不同亚型中国乳腺癌患者来源异种移植瘤模型的构建方法及应用

摘要

本发明涉及生物医学研究领域，公开了一种不同亚型中国乳腺癌患者来源异种移植瘤模型的构建方法及应用。所述构建方法将获取人乳腺癌组织标本破碎，加入小牛血清和基质胶，然后植入到NOD‑SCID雌小鼠腹部第四对乳房垫中；同时，在NOD‑SCID雌小鼠颈后皮下植入雌激素缓释制剂；正常饲养所述雌小鼠。本发明将人乳腺癌新鲜肿瘤组织，配合小牛血清和基质胶，直接接种于NOD‑SCID小鼠乳房垫内，同时采用皮下植入雌激素缓释药剂的方式进行原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立，能够实现对原代人源乳腺癌移植瘤稳定和持久的刺激，在确保不同代传代间乳腺肿瘤的基本特性与临床原代样本保持一致的前提下，提高了原代模型的构建成功率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学基础研究领域，具体的说是涉及不同亚型中国乳腺癌患者来源异种移植瘤模型的构建方法及应用。

背景技术

乳腺癌是一种严重危害女性身心健康的常见恶性癌,占女性癌症的第二位。在全球范围内，每年估计有超过120万妇女被诊断乳腺癌。尽管我国是乳腺癌发病率较低的国家，但由于庞大的人口基数，乳腺癌患者人口绝对数大；更为严重的是，因女性乳腺癌发病率近年来上升三倍，我国已成为乳腺癌发病率增长最快的国家之一，乳腺癌已经成为都市女性的第一杀手。因此寻找更明确的癌症致病机制及治疗途径，已成为基础研究与临床医学的当务之急。

由于难以获得足够量临床肿瘤样本持续进行体内外研究，并且这些肿瘤样本还不能新鲜保存进行后续实验，因此肿瘤动物模型就成为进行肿瘤相关机制研究以及药物筛选的重要平台，其可以在一定程度上代替珍贵的临床样本，对体外的研究结果进行验证，使基础研究获得的结论能够更适用于临床。

建立稳定可靠并能准确反映临床情况的肿瘤动物模型是肿瘤研究的重点。然而传统肿瘤动物模型的建立是将人肿瘤细胞进行体外筛选，经过传代培养，逐步建立可稳定传代的细胞株，然后植入到免疫缺陷小鼠体内而建立，该模型虽然具有肿瘤细胞系易获得和实验重复性好等优点。但是利用细胞系建立的肿瘤模型存在诸多缺陷：因为连续传代的肿瘤细胞株适应了培养皿的环境，缺乏肿瘤微环境例如非肿瘤基质细胞、细胞外基质、肿瘤微环境因子等，最终导致肿瘤生物学行为和自然属性不可逆性改变，这些细胞株种植到免疫缺陷小鼠后形成的肿瘤是同质性的，丢失了原代肿瘤的特性，因此不能客观地反应原代肿瘤的情况。这严重阻碍了对肿瘤机制及药物开发的研究。

近十几年来多种肿瘤研究中都开始建立并使用患者来源异种移植瘤小鼠模型(PDX)来进行基础研究及药物开发，但是这种患者来源异种移植瘤小鼠模型受到构建方法的影响会呈现出不同的成功率，而只有适宜的方法才能够使PDX成功率较高，使得通过PDX获得的移植瘤能够一代一代传递下去用于肿瘤研究。中国专利CN104546868A公开了一种基于中国人群的原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立方法，但是该种方法所构建的原代PDX成功率并未详细记载，经过研究其原代模型构建成功率并不令人满意。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种不同亚型中国乳腺癌患者来源异种移植瘤模型的构建方法及应用，使得所述构建方法构建出的乳腺癌移植瘤模型能够连续传代，并且与原代临床肿瘤样本的病理结构以及分子分型保持相同，可以应用到乳腺癌的基础研究和临床研究中，同时具有较高的原代移植瘤模型构建成功率。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

不同亚型中国乳腺癌患者来源异种移植瘤模型的构建方法，包括：

步骤1、获取人乳腺癌组织标本；

步骤2、将人乳腺癌组织标本破碎，并加入小牛血清和基质胶，然后植入到NOD-SCID雌小鼠腹部乳房垫中；同时，在NOD-SCID雌小鼠颈后皮下植入雌激素缓释制剂；

步骤3、正常饲养步骤2中所述雌小鼠至乳腺癌移植瘤长至300-500mm³。

PDX模型的原代构建成功率高低决定着后续基础和临床研究能否顺利开展，本发明针对现有方法构建成功率不高的问题，直接利用人乳腺癌新鲜肿瘤组织，配合小牛血清和基质胶，接种于非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠乳房垫内建立移植瘤模型，在保留肿瘤原始微环境的同时，原位移植能更加贴近肿瘤生长微环境，同时采用皮下植入雌激素缓释药剂的方式，相对于喂食方式和一次性给药方式更能够实现对原代人源乳腺癌移植瘤稳定和持久的刺激，增加了原代模型的构建成功率。

本发明步骤1具体为，取人乳腺癌组织，放入无菌的预冷的装有DMEM基础培养基中，并保持0-4℃保存，在1小时内进行处理，剪去周边脂肪组织以及坏死组织，获得人乳腺癌组织标本。

本发明所述人乳腺癌组织来自临床乳腺癌患者，采集前患者均自愿并签署知情同意书，且通过正规医疗机构采集获得。所述人乳腺癌组织按照临床分子分型标记分为如下亚型：

(1)ER(雌激素受体)阳性，PR(孕激素受体)阳性。HER2(人表皮生长因子受体2)阳性；

(2)ER阳性，PR阳性。HER2阴性；

(3)ER阳性，PR阴性。HER2阳性；

(4)ER阳性，PR阴性。HER2阴性；

(5)ER阴性，PR阳性。HER2阳性；

(6)ER阴性，PR阳性。HER2阴性；

(7)ER阴性，PR阴性。HER2阳性；

(8)ER阴性，PR阴性。HER2阴性。

作为优选，所述将人乳腺癌组织标本破碎是将人乳腺癌组织标本破碎为＜1mm³。

作为优选，所述NOD-SCID小鼠为为体重在18-22g，6-8周龄SPF级雌性小鼠。

作为优选，所述人乳腺癌组织标本、小牛血清和基质胶的体积比为2:2:1。

作为优选，所述雌激素缓释制剂为17β-雌二醇缓释药剂，所述药剂可通过市售途径购买，如IRA公司，货号SE-121。

作为优选，本发明所述雌小鼠腹部乳房垫为雌小鼠腹部第四对乳房垫。

原代人源乳腺癌移植瘤模型构建成功，其也需要定时进行乳腺癌移植瘤的传代，以便继续临床和理论研究，因此本发明所述构建方法还包括移植瘤模型的传代：

将上一代模型小鼠处死后，体表消毒，在无菌环境下取出乳腺癌移植瘤组织，切碎后使用含胶原酶的M199培养基37℃消化，过滤获得单细胞悬液，离心后用小牛血清重悬细胞，将细胞浓度调整到1×10⁷/ml，植入到NOD-SCID小鼠腹部第四对乳房垫中，每位点0.1ml，同时附加50ul基质胶，同时在NOD-SCID雌小鼠颈后皮下植入雌激素缓释制剂。

本发明从原代与传代移植瘤模型中取出肿瘤组织进行鉴定，通过免疫组化比对不同代之间乳腺癌临床分子分型标记物雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体-2(HER2)的表达情况，以及HE染色片对比不同代之间的组织结构和通过对不同代的深度测序结果比对，结果显示，不同传代间乳腺肿瘤的基本特性与临床原代样本保持一致。同时，原代小鼠模型的构建成功率高达20％以上。

基于上述技术效果，本发明提供了所述构建方法构建的移植瘤模型在乳腺癌肿瘤机制基础研究和乳腺癌临床研究中的应用。例如，肿瘤机制研究方面可以验证体外获得的结论在临床样本中的普适程度；临床研究方面可以直接用于新靶点筛选、新型药物筛选等。

由以上技术方案可知，本发明将人乳腺癌新鲜肿瘤组织，配合小牛血清和基质胶，直接接种于NOD-SCID小鼠乳房垫内，同时采用皮下植入雌激素缓释药剂的方式进行原代人源乳腺癌移植瘤模型的建立，能够实现对原代人源乳腺癌移植瘤稳定和持久的刺激，在确保不同代传代间乳腺肿瘤的基本特性与临床原代样本保持一致的前提下，提高了原代模型的构建成功率。

附图说明

图1所示为USTC-5编号亚型人乳腺癌组织P0代与P3代之间免疫组化结果；

图2所示为USTC-6编号亚型人乳腺癌组织P0代与P3代之间免疫组化结果；

图3所示为USTC-7编号亚型人乳腺癌组织P0代与P3代之间免疫组化结果；

图4所示为USTC-8编号亚型人乳腺癌组织P0代与P3代之间免疫组化结果；

图5所示为USTC-17编号亚型人乳腺癌组织P0代与P3代之间免疫组化结果；

图6所示为USTC-18编号亚型人乳腺癌组织P0代与P3代之间免疫组化结果；

图7所示为不同编号亚型乳腺癌组织P2代成瘤曲线；

图8所示为不同编号亚型乳腺癌组织P3代成瘤曲线。

具体实施方式

本发明实施例公开了不同亚型中国乳腺癌患者来源异种移植瘤模型的构建方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述构建方法和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明提供的构建方法基础上，本发明还包括将步骤3所述雌小鼠采用二氧化碳窒息法处死动物，体表消毒，在无菌环境下取出移植瘤组织，即在本发明提供的构建方法基础上对移植瘤小鼠模型处死并获取移植瘤是一种对临床原代乳腺癌肿瘤标本的制备方法、传代方法或延续繁殖方法，继而以最终获取乳腺癌移植瘤为目的。

以下就本发明所提供的不同亚型中国乳腺癌患者来源异种移植瘤模型的构建方法及应用做进一步说明。

实施例1：本发明所述构建方法(构建原代人源乳腺癌移植瘤模型)

取人乳腺癌组织标本，放入无菌的4℃预冷的装有DMEM基础培养基的15ml离心管中，并保持0-4℃保存，在1小时内进行处理。

在超净工作台中，将上述肿瘤组织放入无菌培养皿中，剪去周边脂肪组织以及坏死组织后，使用无菌手术刀将肿瘤组织P₀切成＜1mm³的小块后，移入无菌1.5mlEP管中，加入小牛血清和基质胶(BD公司，货号354234)各200ul，使用1ml注射器换12^#针头吸取肿瘤组织备用；

接种小鼠使用18-22g，6-8周龄SPF级NOD-SCID雌小鼠，具体接种方法：麻醉小鼠后，使用动物剃毛器对小鼠腹部和颈后剃毛；剃毛区域先后使用碘伏和酒精擦拭消毒，将肿瘤组织植入分别植入至小鼠腹部两侧第四对乳房垫中；颈后皮下植入17β-雌二醇缓释药剂(IRA公司，货号SE-121)。植入完毕后正常饲养并完成相关信息记录。

实施例2：原代移植瘤模型乳腺癌移植瘤传代

待实施例1原代荷瘤鼠肿瘤长至300-500mm³时进行传代，选取荷瘤鼠采用二氧化碳窒息法处死动物，体表消毒，在无菌环境下剖出原代小鼠模型中乳腺癌移植瘤组织，切碎后使用消化液(胶原酶(stemcell公司，货号07912)1份：M199培养基(corning公司，货号R10-060-cv)9份)，37℃水浴消化1小时，过滤网获取单细胞悬液，350×g离心5分钟收取细胞，使用小牛血清重悬细胞后，台盼蓝计数数活细胞数，将细胞浓度调整到1×10⁷/ml，用1ml注射器植入至6-8周龄SPF级NOD-SCID雌鼠第四对乳房垫中，每位点0.1ml(另加50ul基质胶)，同时在NOD-SCID雌小鼠颈后皮下植入雌激素缓释制剂。植入完毕后正常饲养。

实施例3：不同亚型乳腺癌组织稳定传代试验

试验以12例临床人源乳腺癌组织为标本按照本发明实施例1的构建方法以及实施例2的传代方法进行，统计各代之间的乳腺癌组织基本特性，结果见表1。

表1不同亚型乳腺癌组织稳定传代试验

注：表中“保持分子分型标记稳定传代情况”中所列传代代数并非说明只能传代到所列代数，其能够一直稳定传代，试验所列代数已能足够说明移植瘤模型可稳定传代，传代数据不可能无限记载在表格中。

由表1可知，按照本发明构建方法构建成功的原代移植瘤模型可稳定传代至多代，且在分子分型标记上与临床原代乳腺癌肿瘤组织保持一致。

实施例4：不同亚型乳腺癌组织P0代与P3代之间免疫组化试验

试验以表1中USTC-5编号亚型、USTC-6编号亚型、USTC-7编号亚型、USTC-8编号亚型、USTC-17编号亚型、USTC-18编号亚型人乳腺癌组织为标本，按照本发明实施例1的构建方法以及实施例2的传代方法进行，以免疫组化方式对比P0代与P3代的乳腺癌组织基本特性，结果见图1-图6。

由图1和图6免疫组化镜检结果可以看出，P0代(临床原代人乳腺癌组织)与P3代之间组织结构基本一致，同时对P0代与P3代进行深度测序结果比对，结果也显示P0代与P3代之间乳腺肿瘤的基本特性一致。表明移植瘤模型中不同传代间乳腺肿瘤的基本特性与临床原代样本保持一致。

实施例5：不同亚型乳腺癌组织P2代与P3代肿瘤生长情况统计

试验以表1中USTC-5编号亚型、USTC-6编号亚型、USTC-7编号亚型、USTC-8编号亚型、USTC-17编号亚型、USTC-18编号亚型人乳腺癌组织为标本，按照本发明实施例1的构建方法以及实施例2的传代方法进行，统计P2代与P3代肿瘤生长情况，结果见图7和图8。

由图7和图8可知，不同亚型不同代数之间，肿瘤生长情况均保持一致和稳定。

实施例6：原代移植瘤模型构建成功率试验

对比方法A：专利CN104546868A方法(第一次接种)；

对比方法B：将原代肿瘤样本使用胶原酶消化液(StemCell Catalog#07912)消化至单细胞，使用小牛血清重悬，加入基质胶(比例为1:1)，植入NOD-SCID小鼠第四节乳腺脂肪垫，剩余步骤同本发明实施例1；

本发明方法：实施例1方法；

试验小鼠：18-22g，6-8周龄SPF级NOD-SCID雌小鼠；

乳腺癌组织：临床获得新鲜的不同亚型人乳腺癌组织。

成功构建标准：以实施例3-5试验方法来判定，原代小鼠模型可稳定传代至P3代，各代之间基础特性保持一致。

结果见表2。

表2原代移植瘤模型构建成功率

注：非三阴性中存在重叠。

由表2数据可知，对照方法(包括现有专利方法)的构建成功率远远低于本发明的构建成功率。同时，本发明构建方法采用各亚型乳腺癌肿瘤组织均具有较高的构建成功率，达到20％以上，表明本发明构建方法受临床肿瘤来源、亚型不同的影响小，具备再现性和实用性。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。