愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2及其相关生物材料与应用

摘要

本发明公开了愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2及其相关生物材料与应用。本发明所提供的愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2为a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与愈伤组织起始发育相关的蛋白质。实验证明，愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2可诱导植物愈伤组织起始，从而替代抗生素作为植物转基因的筛选标记，为无抗生素基因的植物转基因育种奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2及其相关生物材料与应用。

背景技术

植物的遗传转化体系必须有一个有效的转化筛选标记系统。目前转基因研究中被广泛应用的转化细胞筛选标记系统主要有两类：一类是将抗性基因作为选择标记，将非转化细胞杀死而使转化细胞存活的负向筛选系统，主要包括两种，一种是编码使抗生素失活的蛋白酶基因如新霉素磷酸转移酶基因nptII和潮霉素磷酸转移酶基因hpt等，另一种是可使除草剂失活的基因如膦丝菌素乙酰转移酶基因bar和5-烯醇丙酮酰草莽酸-3-磷酸合成酶基因epsps。这两种方法都是通过将外源的筛选标记基因转入受体细胞中，在培养基中添加筛选物质，不仅增加了培养成本，使用过的培养基增加了环境中的抗生素、除草剂等筛选物质的残留量。同时完成筛选作用后，这些抗性基因便失去了作用，成为转基因植物的一种负担。由于标记基因数量有限，这些基因的存在给转基因植物的再次转化带来了困难，无法将多种优良性状积累到同一转化植株内从而得到产量、品质等多种性状同步改善的作物。另一类则是无抗生素和除草剂抗性，基因及其编码的蛋白对生态环境和生物无毒无抗性，相对安全，被称为区别于传统抗性标记基因的新一代标记基因。安全标记基因策略不是依靠对非转化细胞致死作用筛选出转化细胞，而是将转化细胞处于某种有利的环境，从而筛选出转化细胞。这种方法的优点在于选择剂无毒副作用，操作简单，在多数情况下有利于转化植株的再生。

新一代标记基因主要为编码激素、抗逆、糖类、氨基酸、叶绿体和解毒等代谢系统的酶类基因。其中，愈伤组织起始发育基因通过调节植物内源生长素信号转导，使转化细胞的生长与分化不同于非转化细胞，从而有效筛选出转化细胞和植株，具有不需要在培养基中添加任何筛选标记的优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何建立无抗生素和除草剂抗性的植物遗传转化正向筛选体系。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了名称为GaLBD-2的蛋白质。

本发明所提供的蛋白质GaLBD-2，来源于亚洲棉(Gossypium arboreum L.)，为如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与愈伤组织起始发育相关的蛋白质。

其中，SEQ ID No.2由201个氨基酸组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质GaLBD-2，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质GaLBD-2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质GaLBD-2的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述GaLBD-2相关的生物材料。

本发明所提供的与GaLBD-2相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：

A1)编码所述GaLBD-2的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；

A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；

A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；

A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；

A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；

A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；

A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的基因：

a1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID No.1由606个核苷酸组成，SEQ ID No.1的核苷酸编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GaLBD-2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GaLBD-2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GaLBD-2且具有GaLBD-2功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码GaLBD-2的核酸分子的表达盒(GaLBD-2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GaLBD-2的DNA，该DNA不但可包括启动GaLBD-2基因转录的启动子，还可包括终止GaLBD-2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes>

可用现有的表达载体构建含有所述GaLBD-2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述GaLBD-2基因转录的启动子具体为35S启动子。

在本发明的一个实施方式中，GaLBD-2的编码基因(即SEQ ID No.1所示的DNA分子)通过含有GaLBD-2的编码基因的表达盒的重组载体导入根癌农杆菌LBA4404中。所述重组载体为用SEQ ID No.1所示的DNA分子替换pCAMBIA2301的KpnI和AscI识别序列间的片段(pCAMBIA2301被限制性核酸内切酶KpnI和Asc I切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)得到的重组载体pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS，pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS表达GUS蛋白和SEQ ID No.2所示的GaLBD-2。所述pCAMBIA2301与pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS的差别仅在于将pCAMBIA2301的Kpn I和Asc I识别序列间的DNA片段(pCAMBIA2301被限制性核酸内切酶Kpn I和Asc I切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为SEQ ID No.1所示的DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛋白质、或所述生物材料在诱导植物愈伤组织起始中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛋白质、或所述生物材料在作为植物转化筛选标记中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛋白质、或所述生物材料在培育无抗生素抗性和除草剂抗性的转基因植物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛋白质、或所述生物材料在培育愈伤组织快速脱分化的转基因植物中的应用。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为锦葵科植物，如棉花(Gossypium spp)。所述棉花具体可为棉花品种中棉所24。

上述应用中，所述愈伤组织起始具体可为愈伤组织脱分化并增殖。

上述应用中，所述激素可为生长素(Auxin)、赤霉素(Gibberellins,GA)、细胞分裂素(Cytokinin,CTK)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)、乙烯(ethyne，ETH)和油菜素甾醇(Brassinosteroids，BR)中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。

为解决上述技术问题，本发明还提供了培育无抗生素和除草剂抗性基因的转基因植物的方法和培育愈伤组织快速脱分化的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育无抗生素抗性和除草剂抗性基因的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述GaLBD-2的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物无抗生素抗性和除草剂抗性。

本发明所提供的培育无抗生素抗性和除草剂抗性的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述GaLBD-2的编码基因和目的基因，得到含有目的基因的转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比无抗生素和除草剂抗性。在本发明的一个实施例中，所述目的基因可为编码GUS蛋白的基因。

上述培育无抗生素抗性和除草剂抗性基因的转基因植物的方法中，所述受体植物无抗生素和除草剂抗性。

本发明所提供的培育愈伤组织快速脱分化的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述GaLBD-2的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的愈伤组织脱分化速度高于所述受体植物的愈伤组织脱分化速度。

本发明所提供的培育愈伤组织快速脱分化的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述GaLBD-2的编码基因和目的基因，得到含有目的基因的转基因植物的步骤；所述转基因植物的愈伤组织脱分化速度高于所述受体植物的愈伤组织脱分化速度。

上述方法中，所述GaLBD-2的编码基因的编码序列为如下a1)或a2)或a3)所示的基因：

a1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为锦葵科植物，如棉花(Gossypium spp)。所述棉花具体可为棉花品种中棉所24。

上述方法中，其中所述GaLBD-2基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GaLBD-2基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述GaLBD-2基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Methodfor Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson andCorey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GaLBD-2基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

实验证明，本发明提供的愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2及其编码基因能促进植物愈伤组织的起始：在不添加外源生长素的愈伤诱导培养基上培养的转GaLBD-2基因的下胚轴组织和转空载体的下胚轴组织产生的愈伤组织的质地和大小均不一样：转GaLBD-2基因的下胚轴组织很容易唤醒愈伤组织的增殖进程，其两端愈伤组织起始程度大，产生的愈伤组织颜色较浅，质地疏松，而转空载体的下胚轴组织很难或几乎不能脱分化从而产生愈伤组织，仍然停留在下胚轴切断的状态。以本发明提供的愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2作为筛选标记建立的正向筛选体系能够起到与使用大量抗生素或除草剂的负向筛选体系同样的筛选效果。结果表明，愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2可替代抗生素和/或除草剂作为植物转基因的筛选标记，与目的基因共转化，然后根据愈伤组织起始程度筛选并获得含有目的基因的无抗生素和除草剂抗性的转基因植物。

附图说明

图1为植物表达载体pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S：GUS的T-DNA区示意图。

图2为转GaLBD-2基因愈伤组织及转空载体愈伤组织在诱导30天的表型。

其中图2中左上为转空载体愈伤组织，图2中右上、左下和右下为转GaLBD-2基因愈伤组织。

图3为转GaLBD-2基因的三种类型的愈伤组织表型。

其中，S为大块愈伤组织(strong type)，I为中块愈伤组织(intermediate type)，W为小块愈伤组织(weak type)。

图4为转GaLBD-2基因的棉花愈伤组织的GUS(β-葡萄糖醛酸糖苷酶)染色结果。其中A为愈伤组织起始较快的棉花愈伤组织；B为愈伤组织起始较慢的棉花愈伤组织。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的植物表达载体pCambia2301为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司的产品，产品目录号为MCV037，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌LBA4404为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司的产品，产品目录号为MCC026，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的2,4-D为sigma公司产品，产品目录号为D7299。

下述实施例中的棉花品种陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种中棉所24来源于中国农业科学院棉花研究所种质库，记载在如下文献中：Zhang C,Yu S,Fan S,et al.Inheritance of somatic embryogenesis using leaf petioles as explants in upland cotton[J].Euphytica,2011,181(1):55-63.，在下文中简称中棉所24。

下述实施例中所用的培养基如下：

基本培养基MSB：溶质及其浓度为：NH₄NO₃>3>2PO₄>4·7H₂O>2·2H₂O>4·7H₂O27.85mg/L，Na₂EDTA>4·4H₂O>4·7H₂O>3BO₃6.2mg/L，KI>2M_OO₄·2H₂O>4·5H₂O>OCl₂·6H₂O>1>6>

愈伤诱导培养基MSB1：向基本培养基MSB加入2,4-D和KT，使2,4-D和KT含量均为0.5mol/L得到的培养基。

愈伤诱导培养基MSB2：向基本培养基MSB加入KT至其含量为0.5mol/L得到的培养基。

无菌苗培养基：溶质及其浓度为：NH₄NO₃>3>2PO₄170mg/L，MgSO₄·7H₂O>2·2H₂O>

实施例1、愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2编码基因的克隆及其载体构建

1、愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2编码基因的克隆

本发明的发明人从亚洲棉(Gossypium arboreum L.)石系亚1号(中国农业科学院棉花研究所)中分离克隆出愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2基因。具体克隆方法如下：

采用Trizol法(TianGen)提取的棉花品种亚洲棉(Gossypium arboreum L.)石系亚1号的叶片总RNA，用反转录酶XL(AMV)合成第一链cDNA为模板，以GaLBD-2-F：5'-GGCGCGCCATGGCATCCTCT-3’(下划线为酶切位点AscI)和GaLBD-2-R：5'-GGTACCTCAGTTCCTCATCATTC-3’(下划线为酶切位点KpnI)为引物，进行PCR扩增，扩增得到核苷酸序列为SEQ>

2、重组载体和重组农杆菌的构建

将植物表达载体pCambia2301的限制性核酸内切酶AscI识别序列和限制性核酸内切酶KpnI识别序列间的DNA(植物表达载体pCambia2301被限制性核酸内切酶AscI和KpnI切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为核苷酸序列是SEQ IDNo.1的DNA分子，保持植物表达载体pCambia2301的其它序列不变得到GaLBD-2基因表达载体，其名称为pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS，载体构建示意图见图1。pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS表达SEQ ID No.2所示的GaLBD-2蛋白。

将重组载体pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS导入根癌农杆菌LBA4404中，得到含有重组载体pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS的重组农杆菌1。

将空载体质粒pCambia2301转入根癌农杆菌LBA4404，得到含有质粒pCambia2301的重组农杆菌2。

实施例2、转GaLBD-2基因棉花愈伤组织在不同愈伤诱导培养基上的表型

1、将实施例1的重组农杆菌1接种到含卡那霉素50mg/l的LB液体培养基，28℃，150rpm振荡培养，得到OD₆₀₀＝0.3-0.5的重组农杆菌1菌液。

将实施例1的重组农杆菌2接种到含卡那霉素50mg/l的LB液体培养基，28℃，150rpm振荡培养，得到OD₆₀₀＝0.3-0.5的重组农杆菌2菌液。

2、以棉花品种中棉所24为实验材料，剥去棉籽的外壳后，棉仁用0.1％的升汞浸泡消毒5min，然后用无菌水冲洗3-5次，播于无菌苗培养基上使其萌发并长成无菌苗。在无菌工作台上，用经过酒精灯火焰消毒的手术刀片将生长至7天的无菌苗的下胚轴切成0.5厘米的小段。

3、采用农杆菌介导转化法用步骤1中的重组农杆菌1转化步骤2得到的下胚轴组织，共培养两天后分别平放于愈伤诱导培养基MSB1、愈伤诱导培养基MSB2上，30天后观察转GaLBD-2基因愈伤组织的表型。

采用农杆菌介导法用步骤1中的重组农杆菌2转化步骤2得到的下胚轴组织，共培养两天后分别平放于愈伤诱导培养基MSB1、愈伤诱导培养基MSB2上，30天后观察转空载体愈伤组织的表型，作为空载体对照。

培养条件：28±2℃，人工光照强度2000Lx，光照周期14h/10h。

实验重复三次，每次重复侵染下胚轴组织100个。

实验结果见图2。结果表明，在不含生长素的愈伤诱导培养基MSB2上培养的转GaLBD-2基因的下胚轴组织和在含生长素的愈伤诱导培养基MSB1上培养的转空载体的下胚轴组织产生的愈伤组织质地和颜色大致相同。但是与转空载体产生的愈伤组织相比，转GaLBD-2基因产生的愈伤组织生长速度更快：转空载体的愈伤组织在愈伤诱导培养基MSB2上培养30天时，愈伤组织的两端刚刚呈现愈伤起始状态，而转GaLBD-2基因的愈伤组织在愈伤诱导培养基MSB2上培养30天时，愈伤组织生长旺盛，质地湿润疏松，生长状态良好，两者差异显著。转空载体产生的愈伤组织培养15天时，转GaLBD-2基因的愈伤组织在愈伤诱导培养基MSB2上正常进行愈伤起始，其愈伤组织生长形态与转空载体的愈伤组织在愈伤诱导培养基MSB1上生长的愈伤组织的生长形态基本一致。实验证明，GaLBD-2基因能够代替外源生长激素使得愈伤组织正常起始。

实施例3、愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2作为筛选标记用于棉花的遗传转化

本实施例以GUS基因作为目的基因，愈伤组织起始发育相关基因GaLBD-2作为筛选基因。

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、采用农杆菌介导转化法用实施例2步骤1中的重组农杆菌1菌液转化实施例2步骤2得到的下胚轴组织，共培养两天后平放于愈伤诱导培养基MSB2上，培养30天得到转GaLBD-2基因的愈伤组织。培养条件为：28±2℃，人工光照强度2000Lx，光照周期14h/10h。

2、将上述步骤1得到的转GaLBD-2基因的愈伤组织依据愈伤组织起始状况是否明显分为三组：分别命名为S组(大块愈伤组织)、I组(中块愈伤组织)和W组(小块愈伤组织)。以100块愈伤组织为一组，重复三次。

3、完成步骤2后，将S组、I组(中块愈伤组织)和W组的愈伤组织分别进行GUS染色，重复三次，统计其阳性率。染色结果表明(图4)，S组阳性率达到100％，I组阳性率也达到75.29％，W组阳性率为10％。这一结果说明非转化愈伤组织由于不具有GaLBD-2基因，细胞脱分化及增殖非常缓慢，能够明显的与转化外植体形成明显差异表型。利用这一表型，在阳性愈伤组织再生成植株的过程中，选择大块愈伤组织作为阳性愈伤块，培养基中不添加卡那霉素，筛选可得到阳性转基因植株。

将步骤1中S组愈伤组织进一步分化、再生培养后得到棉花再生植株。用CTAB法分别提取棉花再生植株的幼嫩叶片DNA，并以该DNA为模板，以35S-F:ACATCAAGTGCAAAAGAAAGAA和GaLBD-2-R:GGTACCTCAGTTCCTCATCATTC为引物，分别进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃40s，72℃60s，30个循环；72℃延伸10min。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,能得到1200bp目的条带的棉花再生植株即为阳性转GaLBD-2基因棉花植株；以水和未转基因棉花植株的叶片DNA为模板进行上述鉴定实验无目的条带；以质粒pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS为模板进行上述鉴定实验能得到1200bp目的条带。

经统计，愈伤组织起始相关蛋白GaLBD-2作为筛选标记建立的正向筛选体系的阳性率为62.5％，与长期使用的大量抗生素和/或除草剂的负向筛选体系(阳性率60％)相比，能够起到同样的筛选效果。结果表明，愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2可替代抗生素和/或除草剂作为植物转基因的筛选标记，与目的基因共转化，然后根据愈伤组织起始程度筛选并获得含有目的基因的无抗生素和除草剂抗性的转基因植物。