一种黄粉虫天然抗氧化八肽的分离鉴定及功能分析

摘要

本发明涉及一种黄粉虫肽的分离鉴定及功能分析方法，采用超声处理、技术筛选、超滤分子截流、分子筛、反相高压液相色谱(HPLC)柱层析、质谱和氨基酸分析等技术，从诱导的黄粉虫中分离到氨基酸序列为SEQ ID NO:1的八肽，并进一步验证其抗氧化活性，证实其抗氧化功能强于谷胱甘肽，为该天然抗氧化八肽的产品开发应用奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄粉虫八肽的分离鉴定方法及其应用，属于生物技术学领域。

背景技术

黄粉虫(Tenebrio molitor Linne)别名大黄粉虫,黄粉甲,俗称面包虫,属昆虫纲,鞘翅目,拟步行甲科,粉虫属。黄粉虫原属仓库害虫,但近年来国内外广大科技工作者在实验材料选取,饲料生产和食品、保健品研发等领域对黄粉虫进行了深入的研究并取得了一系列重要的突破,给予其集实验昆虫和资源昆虫于一身的黄粉虫以“蛋白质饲料宝库”之美誉。黄粉虫是一种具有饲用、食用、药用等多种利用价值的昆虫资源,具有广阔的开发与利用前景。

黄粉虫是一种高蛋白、高脂肪和氨基酸含量较全面的昆虫资源,其含有多种糖类、维生素、矿物质。已有的研究发现，1kg黄粉虫干粉含蛋白质489g、脂肪288g、糖类107g、硫胺素0.65mg、核黄素5.2mg、维生素4.4mg、钾13.7g、钙1.38g、磷6.83g、铁65mg，此外还富含钠、镁、锌、铜、锰、硒等矿物质元素。

黄粉虫作为饲料昆虫历史悠久,已广泛用于多种饲养业。作为饲料,黄粉虫不仅蛋白质含量高,氨基酸比例合理,脂肪酸质量和微量元素含量均优于鱼粉；而且黄粉虫幼虫适宜活体直接饲喂,对动物生长的促进作用是其它饲料所不能比的。在家禽生产中,用黄粉虫饲喂雏鸡、鹌鹑、乌鸡、斗鸡、鸭、鹅等禽类,喂养的雏禽不仅生长发育快、产卵期提前,繁殖率及成活率都有提高,而且可抗病能力增强。但长期以来，对于黄粉虫如何提高饲喂雏禽抗病能力的研究却鲜有报导。

自从Harman自由基理论的提出,人们逐渐认识到动物体内氧化产生的自由基与衰老和众多疾病密切相关。自由基，又称游离基，是独立存在、外层轨道上带有一个或一个以上未配对电子的原子、原子团或分子,其特点为化学反应活性高、不稳定。在机体内过多的自由基可损伤生物大分子,影响细胞的正常结构和功能。自由基可攻击生命大分子物质及细胞壁,造成机体的多种损伤和病变,加速机体的衰老。在食品等复杂体系中,过多自由基的存在也会严重影响体系的稳定性。动物体内有多种自由基,尤以氧自由基最多,也称为活性氧，它们是需氧生物有氧呼吸的产物。

生物体内存在由抗氧化剂和抗氧化酶构成的抗氧化防御系统，该系统是需氧生物减轻氧化损伤而形成的氧化应激机制，正常情况下机体依靠体内的抗氧化防御系统一方面直接清除氧自由基,另一方面使受自由基损伤的生物大分子,在监视和修复系统的作用下得以改正,即使还剩下未被很好修复的细胞,也可通过凋亡机制由吞噬细胞清除,上述生物反应维持了自由基生成与清除的动态平衡。但当机体处于不良环境状态下,以及随着年龄的增长,体内的自由基将会产生过多或清除过慢。当活性氧的浓度超过细胞防御能力时,氧化损伤就可改变细胞的结构和功能,影响机体健康。目前,已知哺乳动物体内有两类消除自由基的系统:一类为酶促系统,主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)；另一类为非酶促系统,主要包括维生素E、维生素C、类胡萝卜素、白蛋白和金属结合蛋白。生理状况下,机体的自由基产生及清除处于平衡状态,一旦机体这种平衡失调,则自由基对组织细胞将产生不可逆转的损伤。上述自由基清除剂也称为抗氧化剂,可清除体内多余的自由基,减轻多余自由基对机体的损伤。已有研究证实,氧化损伤与人类及其他动物的许多疾病诸如癌症、老化、动脉硬化等的发病机理有关。

动物体通过适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平,防止脂质过氧化,帮助机体抵御疾病。由于天然抗氧化剂具有较强抗氧化活性和很高安全性,因此人们把研究重点逐步转向天然抗氧化剂,从各种植物、动物组织中提取,如茶多酚、大豆异黄酮、肌肽、枸杞多糖、大豆肽，以及慈菇、扇贝、六月霜的提取物等等。而且重要的是生物体内的许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质类,由于蛋白质具有优良的乳化特性,能在油水界面起介导作用,因此其在清除生物体内过量自由基,抑制膜脂质过氧化方面更具有重要意义。

随着营养学和生物技术的发展,人们发现介于蛋白质和氨基酸间的肽类,由于其特殊的结构特点,与氨基酸和大分子蛋白质等相比较,其食用安全性更高,具有极强的活性和多样性,且其抗氧化性更为显著。通常把这类具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功效的生物活性肽称为抗氧化活性肽(简称抗氧化肽)。抗氧化活性肽具有抑制体内血红蛋白、自由铁离子、体外单线态氧和脂氧合酶催化的脂肪酸败的功效。

抗氧化肽的开发与应用已成为国内外研究的热点。肽类产品的制备途径通常分为：化学合成、生物工程(重组技术)和从生物中筛选天然肽类三种。化学合成常受到合成起始点的基础结构的限制，生物工程技术也存在如不正确转录而导致蛋白折叠不准确等问题，从生物中筛选天然肽来具有来源丰富、物质天然的有点，因而倍受研究者关注。

针对抗氧化肽研究现状，本发明申请人选用黄粉虫之一长期以来重要的饲料蛋白资源进行研究，对其作为饲料的价值进行深入研究，进一步探究其提高饲喂动物抗病能力的机制，从黄粉虫体内经济、高效地分离获得一种新型抗氧化肽，并研究其抗氧化功能。

发明内容

技术问题

本研究采用了超声处理、技术筛选、超滤分子截流、分子筛、反相高压液相色谱(HPLC)柱层析、质谱和氨基酸分析等技术，从超声诱导的黄粉虫中分离到一个全新的八肽，命名为TM-1，并鉴定其氨基酸的结构组成，并进一步验证其抗氧化活性，对其在体内的抗氧化调节机制进行深入系统的研究，从而为黄粉虫抗氧化肽的临床应用提供理论依据，并有望推进生物活性学理论的发展。

技术方案

本发明的一个方面涉及到黄粉虫抗氧化活性小肽的分离、纯化及质谱分析鉴定，首先利用超滤浓缩技术，通过微孔滤膜(排阻率为1000Da)在外来压力作用下，回收分子量1000Da以下的有效成分获得粗提物；

将获得的粗提物经真空干燥，再次浓缩；

浓缩后粉末经再溶解后，用分子筛和反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离，从而获得多种黄粉虫活性肽成分；

将收获的各活性肽成分经MODIL-TOF质谱分析，测定上述活性肽的完整的氨基酸序列，并对上述活性肽组分的抗氧化功能进行检测，获得具有抗氧化功能的P-7组分，进一步分析得到该组分的氨基酸序列为IIVCPYDK，命名为TM-1。

本发明的另一方面涉及一种黄粉虫天然抗氧化肽制品，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1 IIVCPYDK。

本发明的再一方面涉及一种黄粉虫天然抗氧化肽制品的应用，将上述天然抗氧化肽制品用作饲料添加剂。

进一步的，本发明操作的具体步骤如下：

一种黄粉虫天然抗氧化肽的分离鉴定方法，具体步骤为：

(1)样品处理，称取100g黄粉虫幼虫超声处理后，经液氮反复冻融、碾碎混匀，获得黄粉虫匀浆样品；

(2)蛋白抽提，在上述获得的黄粉虫匀浆样品中加入50ml蛋白抽提液，置于4℃过夜处理，充分抽提后，将所获得的样品经离心4℃，12000g，30min处理后取上清备用，其中蛋白抽提液为50mM HEPES pH7.0,10mM b-ME,1mM EDTA,1.0mM Na3VO4 pH 7.0,50mM NaF pH7.0,1mM PMSF,2mM benzamidine,1mg/ml leupeptin,pepstain A，aprotinin；

(3)去除杂蛋白等大分子物质，将步骤(2)中获得的上清置于80℃水浴中充分反应1h后，再次离心，4℃，12000g，60min，分为三层，上层为多脂层，中层为小分子多肽层，下层为杂蛋白层，取中间上清液；

(4)将步骤(3)中获得的上清液通过1000Da超滤膜进行超滤处理，超滤获得的样品进行真空冻干操作；

(5)将步骤(4)真空冻干处理获得的粉末用0.01MPBS(PH＝7.2)稀释，12000g离心10min，然后将获得的上清液通过0.22um滤膜过滤；

(6)将步骤(5)中过滤处理后的样品经分子筛(Sephadex G-50)纯化分析，收获活性峰P7(见图1)，并真空冻干处理；

(7)将真空冻干粉用B液(2％乙腈，0.065％三氟乙酸)稀释，12000g离心10min，然后用0.22μm滤膜过滤；

(8)高效液相纯化分析取滤液经反向，收获滞留时间的活性，A液为100％乙腈，B液为2％乙腈加0.065％三氟乙酸；

(9)收获的洗脱液经MALDI-TOF-MS分析，氨基酸序列为SEQ ID NO:1 IIVCPYDK。

本发明还采用改良FRAP法、羟自由基清除率的测定方法以及超氧自由基清除率的测定方法对黄粉虫天然抗氧化八肽TM-1的抗氧化活性进行检测，并与常规的抗氧化剂谷胱甘肽进行了对比。

在研究了该黄粉虫天然抗氧化八肽抗氧化生物活性的基础上，本发明还对其在饲料制备中的应用进行了研究。

有益效果

获得TM-1有中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高效率的产物多种途径，除上述方法以外，固相多肽合成技术也是当下流行可行的方法。固相合成肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行，即在一个反应容器，同时产物很容易分离、纯化。本发明中，由生物公司采用固相合成TM-1，纯度可达97％以上。

本发明所述的天然抗氧化八肽的提取和鉴定方法具有原料来源丰富、价格低廉、简便快速的特点，而且其所提纯制备的抗氧化八肽纯度高且安全环保，与化学合成的抗氧化肽相比，具有无毒、无残留，不受合成起始点的核酸结构限制，选择昆虫作为原材料，具有较高的食用安全性，具有生产成本低、周期短、得率高的特点，可广泛应用了饲料添加等领域，具有极大的产业价值。

附图说明

图1：高效液相色谱分离黄粉虫活性肽，箭头所指为P-7的洗脱峰

图2：黄粉虫活性肽的化学组成

图3：总抗氧化能力实验，与谷胱甘肽对照组比较，抗氧化效果差异极显著(P＜0.01)

图4：羟自由基实验，与谷胱甘肽对照组比较，抗氧化效果差异极显著(P＜0.01)

图5：清除O₂-·自由基的活性实验，与谷胱甘肽对照组比较，抗氧化效果差异极显著(P＜0.01)

具体实施方式：

实施例1、黄粉虫肽的分离与鉴定：

(1)样品处理，称取100g黄粉虫幼虫超声处理后，经液氮反复冻融、碾碎混匀，获得黄粉虫匀浆样品；

(2)蛋白抽提，在上述获得的黄粉虫匀浆样品中加入50ml蛋白抽提液，置于4℃过夜处理，充分抽提后，将所获得的样品经离心4℃，12000g，30min处理后取上清备用，其中蛋白抽提液为50mM HEPES pH7.0,10mM b-ME,1mM EDTA,1.0mM Na3VO4 pH 7.0,50mM NaF pH7.0,1mM PMSF,2mM benzamidine,1mg/ml leupeptin,pepstain A，aprotinin；

(3)去除杂蛋白等大分子物质，将步骤(2)中获得的上清置于80℃水浴中充分反应1h后，再次离心，4℃，12000g，60min，取中间上清液(上层为多脂层，中层为小分子多肽层，下层为杂蛋白层)；

(4)将步骤(3)中获得的上清液通过1000Da超滤膜进行超滤处理，超滤获得的样品进行真空冻干操作；

(5)将步骤(4)真空冻干处理获得的粉末用PBS稀释，12000g离心10min，然后将获得的上清液通过0.22um滤膜过滤；

(6)将步骤(5)中过滤处理后的样品经分子筛(Sephadex G-50)纯化分析，收获活性峰Ⅰ(见图1)，并真空冻干处理；

(7)将真空冻干粉用B液(2％乙腈，0.065％三氟乙酸)稀释，12000g离心10min，然后用0.22μm滤膜过滤；

(8)高效液相纯化分析取滤液经反向，收获滞留时间的活性。A液为100％乙腈，B液为2％乙腈加0.065％三氟乙酸；

(9)收获的洗脱液经MALDI-TOF-MS分析，氨基酸序列为SEQ ID NO:1 IIVCPYDK。

该方法首次实现了抗氧化活性肽从黄粉虫的天然分离。

实施例2、黄粉虫天然抗氧化八肽的抗氧化实验：

本实施例采用改良FRAP法、.羟自由基清除率的测定方法以及超氧自由基(O2-·)清除率的测定方法对黄粉虫天然抗氧化八肽TM-1的抗氧化活性进行检测，并与常规的抗氧化剂谷胱甘肽进行对比。

1.还原能力的测定

采用改良FRAP(Ferric Reducing Ability of Plasma)法进行还原能力测定。检测原理是：抗氧化剂能将三价铁离子还原为二价铁离子，而二价铁离子能使菲啉类物质形成稳固的络合物而呈现出明显的蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度的大小计算样品抗氧化活性/还原能力的强弱。该方法反映的不是样品针对某一种自由基的清除活性，而是样品总还原能力。取3.0ml新配的FRAP试剂[25ml醋酸盐缓冲液(300mM,pH3.6)，2.5ml TPTZ(10mM)，盐酸溶液(40mM)，2.5ml FeCl₃(20mM)溶液组成]，分别向其中加入2ml浓度为0μM、100μM、200μM、300μM、400μM和500μM各种浓度的黄粉虫八肽TM-1溶液和谷胱甘肽溶液，加热到37℃，维持反应10分钟，形成蓝色的Fe²⁺-TPTZ复合物，593nm测吸光度，以0～500μM>

从附图3种的结果可以看出，随着TM-1浓度的增加，还原力不断增加。表明TM-1还原能力随着浓度的增加而增强，呈正相关。且比谷胱甘肽效果强。

2.羟自由基清除率的测定方法

参照Fenton反应的方法建立反应体系模型。H₂O₂与Fe²⁺混合后产生羟自由基，羟自由基具有很高的反应活性，存活时间短，但在反应体系中加入水杨酸能有效地捕捉羟自由基并产生有色产物，该产物在510nm处有强吸收，若加入具有清除羟自由基功能的被测物便会与水杨酸竞争羟自由基，从而使紫色产物的生成量减少。简言之，反应管中分别加入1ml硫酸亚铁溶液(6mM)，1ml样品(TM-1和谷胱甘肽)和1mlH₂O₂(6mM)。将该混合物摇匀、孵育10分钟，接着加入1ml水杨酸(6mM)。10分钟后，在510nm处测定溶液的吸光度。

清除率的计算公式如下：清除率＝[1-(Ai-Aj)/Ao]×100％。

其中，Ao为空白溶液的吸光值；Ai为样品中加入水杨酸溶液的吸光值；Aj为样品中无水杨酸溶液的吸光值。

从附图4种的结果可以看出，羟自由自由基(OH-)生成的能力被TM-1明显抑制，呈剂量效应且其清除活性比谷胱甘肽强。

3.超氧自由基(O₂-·)清除率的测定方法

超氧自由基(O₂-·)清除率的测定方法参照Markulund的方法。在碱性条件下(pH＝8.34)邻苯三酚发生自氧化反应生成O₂·-和有色中间产物，该有色中间产物在322nm处有一特征吸收峰，当加入O₂·-清除剂时O₂·-的生成受到抑制，邻苯三酚自氧化过程受阻，溶液在325nm处吸收减弱。故通过测定A325值可以推断清除剂对O₂·-的清除作用。简单地说，2.25ml磷酸盐缓冲溶液(50mM，pH值8.3)与1.6ml超纯水或样品(TM-1和谷胱甘肽)混合。该混合物于25℃放置20分钟后，加入0.15ml新鲜制备的0.2mM邻苯三酚溶液(溶解于0.01M盐酸溶液)。在325nm处，计算线性范围内邻苯三酚自氧化反应增加的吸光度。每隔30s记录反应启动后的A325值，测定3分钟。TM-1对超氧阴离子自由基的清除活性，计算公式如下：

清除率＝(1-ΔAs/ΔAc)×100％

ΔAs，样品溶液线性范围内每分钟吸光度的增加值；ΔAc，空白溶液线性范围内每分钟吸光度的增加值。

附图5的结果表明，超氧阴离子自由基(O₂-·)生成的能力被TM-1明显抑制，呈剂量效应且其清除活性比谷胱甘肽强。

实施例3、黄粉虫天然抗氧化八肽作为饲料添加剂使用

1、产品组分及使用

400只1日龄白羽肉鸡分别称重，依据体质量将肉鸡分为4组，每组100只。1组为对照组，2组为10mM/Kg黄粉虫天然抗氧化八肽组，3组为50mM/Kg黄粉虫天然抗氧化八肽组，4组为250mM/Kg黄粉虫天然抗氧化八肽组，饮水使用，实验周期为42d。分析黄粉虫天然抗氧化八肽对鸡免疫及抗氧化能力的影响。通过该试验发现天然抗氧化八肽能够显著提高小鼠抗体水平，并且具有调节细胞免疫反应的功能。

2、免疫器官指数测定

饲养试验结束后，每组随机抽取15只共计抽取40只鸡进行指标测定。称取活质量后，颈动脉放血致死解剖观察各脏器变化；采集解剖鸡只的胸腺、脾和法氏囊，冲淋去血污，在滤纸上吸去多余水份，修剪组织周围脂肪，称质量获得各免疫器官的质量，根据活质量计算免疫器官指数。

免疫器官指数/(mg/g)＝免疫器官质量/活质量

结果表明，黄粉虫天然抗氧化八肽能够显著提高鸡体的肉鸡免疫器官指数表(表1)。

表1黄粉虫天然抗氧化八肽饲料添加剂对肉鸡免疫器官指数的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

3、抗氧化能力的测定

收集中抽取鸡只的颈动脉血清，以南京建成生化检测试剂盒测定血清中总抗氧化能力(T－AOC)总超氧化物歧化酶(T－SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的水平测定方法参照试剂盒说明书操作。

结果表明：黄粉虫天然抗氧化八肽能够显著提高鸡体的抗氧化水平(表2)。

表2黄粉虫天然抗氧化八肽饲料添加剂对肉鸡血清抗氧化能力的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

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