一种快速区分PRV中国型、欧美型及疫苗株的双色荧光检测方法、引物及探针

摘要

本发明公开了一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha‑K61的双色荧光检测方法、引物及探针。该方法结合了实时荧光PCR技术及熔解曲线分析技术，根据熔解曲线Tm值差异鉴定猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha‑K61；操作简单：只需一个反应即可实现两个基因型及疫苗株Bartha‑K61的鉴别检测；检测速度快且高通量：全部操作过程可在3小时内完成，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha‑K61鉴别检测所需时间；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及病毒不同基因型，及疫苗毒与野毒株的鉴别方法，具体涉及一种快速区分猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV) 中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光检测方法和试剂盒，该方法是一种基于两条双标记自猝灭探针的探针熔解曲线分析技术，用于猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的检测方法。

背景技术

2011以来，我国华北、华中、华南等地规模化猪场先后出现免疫过猪伪狂犬疫苗后爆发伪狂犬病，部分猪场猪群野毒抗体阳性率高达100%，妊娠母猪35%出现流产，这是我国生猪养猪业遭遇的重大冲击。疫苗免疫接种是当前控制猪伪狂犬病的有效手段，目前我国共有4种PRV商品化弱毒疫苗（Bartha-K61株、Bucharest株、HB-98株，及SA215株）临床使用，其中Bartha-K61株市场占有率较高。另有1种商品化灭活疫苗：鄂A株也有销售。灭活苗在安全性方面高于弱毒苗，但不能在伪狂犬病毒潜伏组织(如三叉神经等)中增殖，对有潜伏感染的猪不能起到预防作用；猪伪狂犬基因缺失疫苗毒力较弱、免疫原性较好，但有毒力返强导致疾病流行、潜伏感染引起散毒的危险，所以有必要建立配套的疫苗检测方法。2015年，童光志等通过PRV全基因及67个基因的进化分析，证实PRV可以分为两个进化分支：欧美型（Genotype I，见于欧洲、美洲、澳大利亚、亚洲等地）和中国型（Genotype II，见于中国、马来西亚等地），欧美型的代表株有Bartha、Becker、Kaplan、HS等；中国型的代表株有Fa、Ea、HeN1、JS、TJ等（Chao Ye, etal,>Guang-Zhi Tong. Virology (2015) 483: 32-43）。目前猪伪狂犬病毒的流行毒株与中国型毒株Fa及Ea株亲缘关系较近（Xiuling Yu , etal,>&,>Kegong Tian. Emerging Infectious Diseases (2014) 20: 102-104；Yinbiao Wang,etal, &,>Gaiping Zhang.>Virus Genes (2015) 50: 401–409），有必要跟踪检测临床是否有欧美型的出现，所以建立中国型与欧美型猪伪狂犬病毒的鉴别检测方法意义重大。

根据基因缺失苗缺失全部或部分gE基因而建立的gpI（gE）抗体ELISA检测试剂盒及gB抗体ELISA检测试剂盒，虽然配合使用可以达到鉴定疫苗毒感染的目地，但抗体检测存在严重滞后性，同时也无法鉴别毒株类型，不利于进一步指导疫苗免疫，因此目前也急需一种操作相对简易、检测结果可靠且可高通量、快速的区分猪伪狂犬病毒不同基因型及疫苗株的方法。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光PCR检测方法，该方法操作简易、快速、高通量、检测结果可靠，有利于在临床实践中推广应用。

本发明的目的在于提供一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光PCR引物及探针。

本发明的另一目的在于提供一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光PCR方法。

本发明的再一目的在于提供一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光PCR试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光PCR引物，其核苷酸序列如下所示：

引物F：5'-GGGCGTCTACACGTGGCGC-3'（SEQ ID NO：1），

引物R：5'-GTTGGTCACGAAGGCGGCGT-3'（SEQ ID NO：2）。

一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光PCR探针，其核苷酸序列如下所示：

探针P1：5'-CGCAGCGCCAACGTCTCGCTCGTCCTGTAC-3'（SEQ ID NO：3），

探针P2：5'-CCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCC-3'（SEQ ID NO：4）。

进一步的，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种；且探针P1和P2的5’端标记的荧光基团不相同。

一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光PCR试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。

进一步的，上述试剂盒中还含有上述所述的探针。

一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光PCR方法，包括以下步骤：

1）从样品中提取病毒DNA；

2）以提取的DNA为模板，用上述所述的引物对F、R，及上述所述探针P1和探针P2进行荧光PCR扩增反应获得扩增产物；

3）对扩增产物进行熔解曲线分析，确定样品中的病毒类型。

进一步的，步骤2）中的荧光PCR扩增反应体系为：

Premix Ex-Taq5.0μl

引物P1（1μM）0.4μl

引物P2（10 μM）0.4μl

探针Probe1（10 μM）0.2μl

探针Probe2（10 μM）0.2μl

模板 1.0μl

ddH₂O2.8μl。

进一步的，步骤2）中的荧光PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次。

进一步的，步骤3）中的熔解曲线分析程序为：95℃变性10 sec；40℃到97℃以0.13℃/s的速率，5次/℃连续采集探针P1和P2的荧光信号，进行熔解曲线分析。

进一步的，步骤3）中所述熔解曲线分析的具体分析过程为：

1）在探针P1的荧光检测结果中，以Bartha-K61标准样品为对照时，若样品熔解温度和阳性对照Bartha-K61熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃时，则判定为欧美型猪伪狂犬病毒；

2）在探针P1的荧光检测结果中，以HDDJ标准样品为对照时，若样品熔解温度和阳性对照HDDJ熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃时，则判定为中国型猪伪狂犬病毒；

3）在探针P2的荧光检测结果中，以Bartha-K61标准样品为对照时，若样品熔解温度和阳性对照Bartha-K61熔解温度的∆Tm值的绝对值小于1.0℃时，则判定为Bartha-K61疫苗株。

本发明的有益效果是：

1）本发明首次建立了一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光检测方法、引物及探针。操作简单：只需一个反应即可实现中国型、欧美型与疫苗株Bartha-K61的鉴别检测；检测速度快且高通量：全部操作过程可在3小时内完成，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了猪伪狂犬病毒中国型、欧美型毒株与Bartha-K61疫苗株鉴别检测所需时间；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

2）本发明的PCR引物对F/R，对猪伪狂犬病毒野毒中国型、欧美型、及疫苗株Bartha-K61可特异性扩增，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间。探针P1可特异性与猪伪狂犬病毒中国型和欧美型核酸位点杂交，特异性较好。探针P2可特异性与猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株及其它非Bartha-K61毒株鉴别位点杂交，特异性较好。引物F/R、探针P1和P2，均不与其他常见猪繁殖障碍相关病毒核酸结合，有利于提高本发明对结果分析的正确性。

4）本发明一种快速区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的双色荧光检测方法的最低检测限可达到单拷贝，灵敏度较高。

附图说明

图1为阳性标准化样本基因进化分析图，其中●为标准化样本中国型HDDJ，▲为标准化样本中国型Ea，■为为标准化样本中国型Fa，◇为标准化样本Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型），△为标准化样本欧美型HS；

图2 为标准化样品双色荧光检测方法熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测熔解曲线图，B和C分别为FAM和HEX单通道分别检测熔解曲线图；标准样品为Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型），非Bartha-K61毒株HDDJ（同时也是中国型）；

图3 为双色荧光检测方法特异性试验熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测熔解曲线图，B和C分别为FAM和HEX单通道分别检测熔解曲线图；

图4 为双色荧光检测方法阳性质粒p-Bartha-K61灵敏度试验扩增曲线图和熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测扩增曲线图，B为FAM和HEX双通道同时检测熔解曲线图，C和D分别为FAM单通道和HEX单通道分别检测扩增曲线图；E和F分别为FAM单通道和HEX单通道分别检测熔解曲线图；

图5 为双色荧光检测方法阳性质粒p-HDDJ灵敏度试验扩增曲线图和熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测扩增曲线图，B为FAM和HEX双通道同时检测熔解曲线图，C和D分别为FAM单通道和HEX单通道分别检测扩增曲线图；E和F分别为FAM单通道和HEX单通道分别检测熔解曲线图；

图6 为临床样品双色荧光检测方法熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测熔解曲线图，B和C分别为FAM和HEX单通道分别检测熔解曲线图；标准样品Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型）和非Bartha-K61毒株HDDJ（同时也是中国型）为阳性对照，临床样本4个，编号分别为INT、S、ZZ、LC；结果显示样本INT和S为欧美型毒株，ZZ和LC为中国型毒株，都不是Bartha-K61疫苗株。该结果已经过测序验证。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 引物及探针

经过对所设计的大量引物和探针进行筛选后，发现引物对F、R，及探针P1和P2对双色荧光法区分猪伪狂犬病毒中国型、欧美型及疫苗株Bartha-K61的效果最好，其碱基序列如下所示。

引物F：5'-GGGCGTCTACACGTGGCGC-3'（SEQ ID NO：1），

引物R：5'-GTTGGTCACGAAGGCGGCGT-3'（SEQ ID NO：2），

探针P1：5'-FAM-CGCAGCGCCAACGTCTCGCTCGTCCTGTAC- BHQ1-3'（SEQ ID NO：3），

探针P2：5'-HEX- CCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCC-BHQ1-3'（SEQ ID NO：4）。

实施例2 标准样品的制备、双色荧光PCR扩增及熔解曲线分析

1）猪伪狂犬病毒DNA的提取：

分别取疑似感染有PRV的病料样品，病料样品可以是病死猪的淋巴结、脑、心、肝、脾、肺、肾、扁桃体等组织，或采集猪血清或鼻式子。血清可直接取200μl备用；鼻式子需溶解于1mL PBS盐酸缓冲溶液中，静置10-20min后取200μl备用；病死猪的组织样本需研磨后离心取上清200μl备用；Bartha-K61疫苗，加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行溶解，取200μL备用。按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0的说明书进行核酸提取。

2）标准样品的制备：

为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品（经序列测定正确），为之后的临床样品检测提供阳性对照，本发明需先制备猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型）、欧洲型毒株HS、中国型毒株HDDJ、中国型毒株Fa、中国型毒株Ea阳性标准样品。标准样品的制备步骤如下：取Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型）、欧洲型毒株HS、中国型毒株HDDJ、中国型毒株Fa、中国型毒株Ea，分别在ST细胞（猪睾丸细胞）传代培养至状态稳定，取200μl病毒液按照猪伪狂犬病毒DNA的提取方法进行提取核酸，作为阳性标准品。

通过上述方法，分别获得含有目的基因片断的猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型）、欧洲型毒株HS、中国型毒株HDDJ、中国型毒株Fa、中国型毒株Ea。

为验证所选标准阳性样本的基因型，按照文献报道（Chao Ye, etal,>Guang-Zhi Tong. Virology (2015) 483: 32-43），选取相应具有分型特点的基因做进化树分析，如图1所示。

图1为标准化样本gC基因进化分析图，其中●为标准化样本中国型HDDJ，▲为标准化样本中国型Ea，■为为标准化样本中国型Fa，◇为标准化样本Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型），△为标准化样本欧美型HS。从图1可以看出Bartha-K61疫苗株、HS为欧美型（Genotype I），HDDJ、Fa、Ea为中国型（Genotype II）。

3）阳性标准样品的荧光PCR操作步骤：

分别以上述获得的三种阳性标准样品为DNA模板，分别进行荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析；

PCR反应体系：

ddH₂O2.8μl

Premix Ex-Taq5.0μl

1μM引物F 0.4μl

10μM引物R0.4μl

10μM P10.2μl

10μM P20.2μl

模板 1.0μl

总体积 10μl。

PCR扩增反应程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次。

熔解曲线分析程序如下：

95℃变性10 sec；40℃到97℃以0.13℃/s的速率，5次/℃连续采集FAM和HEX荧光信号，进行熔解曲线分析。

4）阳性标准样品熔解曲线分析结果分析

PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪进行分析。猪伪狂犬病毒5个阳性标准样品熔解曲线分析结果如图2所示。

图2为阳性标准样品双色荧光检测方法熔解曲线图，图2A为图2B和图2C荧光曲线的叠加图。

图2B为FAM荧光通道分析结果（即探针P1的荧光检测结果），从中可以看出，欧美型毒株Bartha-K61、HS和中国型毒株HDDJ、Fa、Ea标准样品的熔解曲线相互分开，表明所设计引物F、R及探针P1适合用于猪伪狂犬病毒中国型和欧美型两种基因型的熔解曲线分析。根据两种阳性标准样品熔解温度（Tm）的不同，欧美型毒株Bartha-K61、HS熔解温度较低为70.42±0.15℃，中国型毒株HDDJ熔解温度较高为76.8±0.07℃（图2A和图2B）。

图2C为HEX荧光通道的分析结果（即探针P2的荧光检测结果），从中可以看出，疫苗株Bartha-K61和非Bartha-K61毒株HS、HDDJ、Fa、Ea标准样品熔解曲线相互分开，表明所设计引物F、R及探针P2适合用于猪伪狂犬病毒疫苗株Bartha-K61和非Bartha-K61毒株的熔解曲线分析。根据两种标准样品熔解温度（Tm）的不同，疫苗株Bartha-K61熔解温度较低为71.66℃，非Bartha-K61毒株熔解温度较高为76.08±0.08℃（图2A和图2C）。

实施例3特异性实验

下面对本发明建立的检测方法作特异性检测。

分别提取其他常见猪繁殖障碍性疾病相关病毒核酸，如提取猪瘟病毒（classicalswine fever virus, CSFV）、猪乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、猪圆环2型（Porcine circovirus type 2, PCV 2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV），猪细小病毒（Porcineparvovirus，PPV），将CSFV、JEV和PRRSV的RNA反转录为cDNA，以上面病毒的cDNA，PCV 2和PPV的核酸及水分别作为PCR模板，以上述（2）中的PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，并与猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型）和非Bartha-K61毒株HDDJ（同时也是中国型）阳性标准样品进行对比分析，熔解曲线峰型化图如图3所示。

从图3A~C中可以看出，本发明检测方法只能特异性扩增出猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型）和非Bartha-K61毒株HDDJ（同时也是中国型）阳性标准样品熔解峰，而其它猪繁殖障碍性疾病相关病毒，如CSFV、JEV、PRRSV、PCV 2和PPV都没有扩增出特异熔解峰。表明引物F、R及探针P1和P2特异性较好，可以用于猪伪狂犬病毒中国型与欧美型，及疫苗株Bartha-K61的荧光检测。

实施例4灵敏度实验

下面对本发明建立的检测方法作灵敏度检测。

以实施例2中标准品Bartha-K61为模板，引物P1和P2为扩增引物，将扩增产物克隆至PMD18T-Vector中，构建阳性质粒p-Bartha-K61，对p-Bartha-K61做核酸检测，换算质粒数，做10倍梯度稀释，形成1.0x10⁹、1.0x10⁸、1.0x10⁷、1.0x10⁶、1.0x10⁵、1.0x10⁴、1.0x10³、1.0x10²、1.0x10¹、1.0x10⁰>

图4为阳性质粒p-Bartha-K61的双色荧光检测方法灵敏度试验扩增曲线图和熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测的扩增曲线图，即C和D图中曲线的叠加图；C和D分别为FAM单通道和HEX单通道检测的扩增曲线图；B为FAM和HEX双通道同时检测的熔解曲线图，即E和F图中曲线的叠加图；E和F分别为FAM单通道和HEX单通道检测的熔解曲线图。从中可以看出该检测方法随着核酸浓度的降低呈现明显的下降的荧光信号，质粒个数低至1.0 copy/μl，FAM通道和HEX通道还可以检测到相应荧光信号。

按照上述同样的方法构建阳性质粒p-HDDJ，10倍梯度稀释，用上述实施例2中的荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，扩增曲线图和熔解曲线峰型化图如图5所示。

图5为阳性质粒p-HDDJ的双色荧光检测方法灵敏度试验扩增曲线图和熔解曲线图，其中A为FAM和HEX双通道同时检测的扩增曲线图，即C和D图中曲线的叠加图；C和D分别为FAM单通道和HEX单通道检测的扩增曲线图；B为FAM和HEX双通道同时检测的熔解曲线图，即E和F图中曲线的叠加图； E和F分别为FAM单通道和HEX单通道检测的熔解曲线图。从中可以看出该检测方法随着核酸浓度的降低呈现明显的下降的荧光信号，质粒个数低至1.0copy/μl ，FAM通道和HEX通道还可以检测到相应荧光信号。

上述检测结果说明本发明方法灵敏度较高。

实施例5 临床样品荧光PCR扩增及熔解曲线分析

1）从样本中提取病毒核酸：方法同上述实施例2中核酸提取方法，提取4份临床样品中的病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸为模板，方法同上述实施例2中荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析；同时以实施例2中所述的阳性标准品猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株（同时也是欧美型）和非Bartha-K61毒株HDDJ（同时也是中国型）作为阳性对照。

3）临床样品熔解曲线分析结果分析

荧光PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪进行分析。本发明检测了4份临床样品，熔解曲线分析结果如图6所示。

从图6的临床样品双色荧光检测方法熔解曲线图上可看出，分析FAM荧光通道（即探针P1的检测结果）时，以PRV欧美型Bartha-K61和中国型HDDJ标准样品熔解曲线作为对照时，待检样品和阳性对照Bartha-K61之间熔解峰∆Tm值的绝对值小于1.0℃时判定为欧美型PRV；待检样品和阳性对照HDDJ之间熔解峰∆Tm值的绝对值小于1.0℃时判定为中国型PRV；结果显示，所检测的4份临床样本中编号INT和S为欧美型PRV，编号ZZ和LC为中国型PRV（见图6A和B）。

分析HEX荧光通道（即探针P2的检测结果）时，以PRV疫苗株Bartha-K61和非Bartha-K61毒株HDDJ标准样品熔解曲线作为对照时，待检样品和阳性对照Bartha-K61之间熔解峰∆Tm值的绝对值小于1.0℃时判定为PRV疫苗株Bartha-K61；待检样品和阳性对照HDDJ之间熔解峰∆Tm值的绝对值小于1.0℃时判定为非PRV疫苗Bartha-K61；结果显示，所检测的4份临床样本中INT、S、ZZ和LC都不是PRV疫苗株Bartha-K61。

综合上述FAM通道和HEX通道结果（即探针P1和P2的检测结果），判定4份临床样本中编号为INT和S的均为欧美型PRV，ZZ和LC均为中国型PRV，都不是PRV疫苗株Bartha-K61。该结果已经过测序验证。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>广东省农业科学院动物卫生研究所

<120>一种快速区分PRV中国型、欧美型及疫苗株的双色荧光检测方法、引物及探

针

<130>

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<170>PatentIn version 3.5

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgcagcgcca acgtctcgct cgtcctgtac 30

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ccgagttcgg cctgagcgcg ccgcc25

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