基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用

摘要

本发明涉及基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用。基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物，包括上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还涉及基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定方法。本发明首次发现不同株的木霉属真菌的线粒体NAD5基因序列均不相同，并以该序列为特征片段建立木霉菌的DNA条形码数据库，对木霉属真菌进行分类鉴定，该方法实验周期短，鉴定准确度高，克服了现有方法的局限性，显示了其准确、便捷、快速的优势。

说明书

技术领域

本发明涉及基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用，特别涉及基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定引物及鉴定方法，属于微生物技术领域。

背景技术

木霉(Trichoderma spp.)菌属于半知菌类的丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，广泛存在于土壤、腐烂的木材及植物残体等基质中。木霉所产生的纤维素酶、半纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶等，在食品、卫生、饲料、纺织、造纸等领域广泛应用，是重要工业酶制剂的生产菌。有些木霉菌能促进植物生长，抑制植物病原真菌，在农业生产上作为重要的植病生防菌使用。

种类鉴定往往是生物学研究的第一步，对种类的准确鉴定能够使人们获得研究目标生物的背景信息，比如生理生化特性、生态学功能、效益与风险等。木霉菌形态多样、种类繁多、功能各异，准确快速地对其进行分类鉴定，对木霉菌的研究和利用有重要的意义。

传统的木霉菌鉴定方法是基于形态学分类研究的基础上，主要根据产孢结构、分枝方式、孢子形态、颜色、大小、瓶梗的形态、数目和着生方式等形态特征进行分类。此外，从能分离到木霉菌有性型形态入手，研究其无性型，也是一种有效的鉴定方法。但是由于木霉菌形态特征的可变性比较强，表现不够稳定，因此利用形态学特征进行鉴定时，出错的可能性比较大。而且，目前能发现有性型的木霉种类非常少，远不能满足分类鉴定的需求。

2002年，Tautz D等在Nature上首先提出要用DNA序列作为生物分类系统的主要平台(DNA Taxonomy)，随后2003年加拿大动物学家Paul Hebert首次提出DNA条形码(DNABarcoding)的概念。DNA条形码是指利用一段标准DNA序列作为标记来实现快速、准确和大批量的物种识别和鉴定。目前在木霉菌上使用的DNA条形码序列主要有内转录间隔区序列(ITS)、转录延伸因子Iα亚基序列(tef1)等，上述DNA条形码系统为快速准确的鉴定木霉菌提供了有力的工具。

然而，现有木霉菌DNA条形码系统仍存在一些不足。例如，ITS条形码系统的区分能力有限，对于近源种往往无法进行明确的区分；tef1条形码系统含有三个系统发生标记，即第4、5内含子和第6外显子，由于对哪个发生标记作为鉴定标准的意见不统一，因此该条形码系统鉴定结果的准确性值得商榷。

发明内容

本发明的目的是提供基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用。与现有方法中的ITS、tef1序列相比，线粒体NAD5基因进化速率较快，即使近缘物种区分度也很好；密码子保守性高、引物通用性强，目的片段更短更易扩增；约700bp的序列长度不需要双向测序，分类鉴定成本更低。

本发明技术方案如下：

基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物，包括上游引物核苷酸序列如SEQID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体序列如下：

SEQ ID NO.1(上游引物)：5’-AATCATGCTTTCTATAAAGGA-3’

SEQ ID NO.2(下游引物)：5’-GAATTCAACTAAGAAACGTTG-3’

一种基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定方法，步骤如下：

(1)提取待鉴定的木霉属真菌样品的DNA，制得基因组DNA；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物进行PCR扩增，纯化，制得PCR扩增产物；

(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行测序，将测序结果与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库进行比对，基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法或基于聚类分析的系统发育树法进行物种鉴定，获得多个序列间的相似性，相似度最高或遗传距离最小的对应种类即为待鉴别真菌的物种。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中提取待鉴定的木霉属真菌样品的DNA采用酚/氯仿抽提法。酚/氯仿抽提法为本领域常规的真核生物DNA提取方法，参见《分子克隆实验指南》。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下，总体系为50μL：

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的反应条件为：

94℃预变性3min；94℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的纯化为采用质量百分比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，利用纯化试剂盒回收纯化。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中已建立的木霉属真菌DNA条形码数据库为采用已经准确分类鉴定的木霉属真菌，按照上述步骤(1)获得基因组DNA，然后按照上述步骤(2)获得PCR扩增产物，再经步骤(3)测序后，建立由含有已知木霉属真菌对应的PCR扩增产物序列组成的木霉属真菌DNA条形码数据库。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法进行物种鉴定的步骤如下：

将PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中的其它木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件计算PCR扩增产物的测序结果的序列与其它木霉菌的Kimura-2-parameter遗传距离，计算种内、种间变异值，当待鉴定菌株与数据库中的基因片段比对后，得到多个序列间最小变异值即种间最小变异值，当最小变异值等于或小于某物种的种内最大变异值，视为与其同一物种；

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，基于聚类分析的系统发育树法进行物种鉴定的步骤如下：

将PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中的其它木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件构建NJ、ML、ME、UPGMA系统发育树，检验PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中序列聚类在一起的物种，若待鉴定菌株与数据库中的物种构成单支系，则待鉴定的木霉属真菌样品鉴定为该物种。

有益效果

本发明首次发现不同株的木霉属真菌的线粒体NAD5基因序列均不相同，并以该序列为特征片段建立木霉菌的DNA条形码数据库，对木霉属真菌该特征片段进行扩增、测序，然后将待鉴定的木霉属真菌样品的序列与DNA条形码数据库进行比对，根据比对结果对木霉菌进行分类鉴定，该方法实验周期短，鉴定准确度高，克服了现有方法的局限性，显示了其准确、便捷、快速的优势。

附图说明

图1所示为部分木霉菌株的NAD5基因PCR扩增产物的电泳检测结果照片；

图中：Marker：DL2000；1：T.guizhouense STSF1.0243；2：T.velutinumSTSF1.0246；3：T.citrinoviride STSF1.0066；4：T.gamsii KUC1747；5：SP1；

图2所示为NAD5序列系统发育树并分析亲缘关系图。

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，可以用于以下典型实验方案达到发明内容的目的，本发明的保护范围并不限于此，凡依照本发明公开序列和引物进行的PCR所做的修改、优化的实施内容，均属于本发明的保护范围。

实施例1

木霉菌属DNA条形码即NAD5基因序列片段数据库的建立，步骤如下：

(1)收集不同的木霉菌株，根据菌株的形态特征，然后提取其基因组DNA，结合它们的tef1条形码序列，对菌株进行准确种类鉴定。供试木霉菌株详细信息见表1。

表1

(2)将表1中所列菌株的纯培养接种于PDA平板，于25℃培养7d后，收集菌丝，采用酚/氯仿抽提法提取木霉菌株的基因组DNA。

(3)以步骤(2)制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-AATCATGCTTTCTATAAAGGA-3’

SEQ ID NO.1：5’-GAATTCAACTAAGAAACGTTG-3’

PCR反应体系如下，总体系为50μL：

PCR扩增的反应条件为：

94℃预变性3min；94℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

然后经质量百分比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳后(部分电泳结果见图1)，利用纯化试剂盒回收纯化，制得PCR扩增产物，产物保存于-20℃或直接送上海生工进行测序，测序引物与PCR扩增的引物一致。

(4)将测序得到的序列与GenBank数据库中已发表的木霉菌NAD5基因片段序列合并，建立木霉菌属NAD5基因片段的数据库。所述数据库包括下述序列编号所示的NAD5基因片段序列：SEQ ID No.3-SEQ ID No.39。数据库中的NAD5基因片段序列用程序ClustalW进行比对，利用程序Gblocks0.91b优化比对的保守区域，然后利用MEGA5.1软件计算出木霉菌属的种内最大变异值为0.008。

实施例2：木霉菌属未知种类菌株的鉴定

1、选未经鉴定的木霉菌株SP1，分别用传统分类方法和本发明中所用的方法进行鉴定。

2、采用实施例1中所述步骤提取木霉菌株的基因组DNA，以SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2作为引物扩增NAD5基因片段，条件同实施例1所述，经PCR产物检测、测序，然后通过下述方法进行菌株鉴定。

3、未经鉴定的木霉菌株SP1的鉴定：将测序结果(SEQ ID NO.40)与其它木霉属真菌的NAD5条形码数据库进行比对，基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和基于聚类分析的系统发育树法设立鉴定规则来进行鉴定，获得多个序列间的相似性，相似度最高或遗传距离最小的对应种类即为待鉴别真菌的物种，具体方法如下：

a.基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法进行物种鉴定

将未经鉴定的木霉菌株SP1的NAD5基因片段序列与数据库中的其它木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件计算未经鉴定的木霉菌株SP1的DNA条形码序列与其他木霉菌的Kimura-2-parameter遗传距离，计算种内、种间变异值，当待鉴定菌株与数据库中的基因片段比对后，得到多个序列间最小变异值即种间最小变异值，当这些值等于或小于某物种的种内最大变异值，视为与其同一物种；该物种与T.asperellum的遗传距离最小，与其两个菌株STSF1.0222和B05的遗传距离分别为0.003和0，初步鉴定为T.asperellum。

b.基于聚类分析的系统发育树法进行物种鉴定

将未经鉴定的木霉菌株SP1的NAD5基因片段序列与数据库中的其它木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件构建NJ、ML、ME、UPGMA系统发育树，检验未经鉴定的木霉菌株SP1的DNA条形码序列与数据库中T.asperellum的两个菌株STSF1.0222和B05菌序列聚类在一起，且构成单支系，如图2所示，鉴定为T.asperellum。

经本方法鉴定后的结论，与传统分类鉴定方法得到的结果一致，但本方法比传统方法更加简便、快速。