能够溶解带有膜锚定型免疫球蛋白A的B淋巴球与降低免疫球蛋白A生产的抗人类膜锚定型免疫球蛋白A抗体

摘要

本文所公开的是一种抗migis‑α抗体专一于人类mα链上的migis‑α，可以结合B淋巴细胞上的mIgA，导致表达mIgA的B淋巴细胞溶解，并降低分泌IgA的B淋巴细胞产生IgA。进一步公开的是一种药物组合物，包含抗migis‑α抗体和医药上可接受的载体。进一步公开的方法是用在人受试者体内溶解表达mIgA的B淋巴细胞与减少IgA产生，藉由使用专一于人类mα链的抗体，可以结合B淋巴细胞上mIgA的migis‑α，造成表达mIgA的B淋巴细胞溶解，并降低分泌IgA的B淋巴细胞产生IgA。本文公开一种方法用来治疗受试者的疾病，包括施用抗体其专一于人类mα链的migis‑α，可以结合B淋巴细胞上的mIgA，因此溶解受试者免疫系统表达mIgA的B淋巴细胞与减少产生IgA抗体。此外，本发明公开使用所述抗migis‑α抗体或片段来治疗受试者的疾病，它能受惠于在免疫系统中清除表达mIgA的细胞或减少IgA抗体。

说明书

相关申请的声明

此申请要求2013年12月5日提交的美国临时申请号61/912,395，其内容在此通过引用整体并入本文。

技术领域

这个发明与特别是那些能够结合表达人类膜锚定型免疫球蛋白A的B细胞抗体有关。

背景技术

人类免疫球蛋白A(IgA)有两种类型，分别是IgA1与IgA2，在血清里大部分是IgA1(约80％)。IgA1和IgA2分别包含重链α1与α2。两类都有分泌型与膜结合型的序列，是从同一个RNA衍生出两组mRNA转译而来。mα含有膜型表达序列，大部分血清里的IgA是单体型(约90％)，而不是双聚体或是多聚体。

分泌型IgA(SIgA)是在外分泌里含量最多的免疫球蛋白，它在黏膜表面作为对抗入侵微生物的体液免疫，并保持膳食抗原在胃肠管道的平衡。表皮层下由局部浆细胞生产的分泌型IgA主要是与J链接合形成双聚体或多聚体，透过与上皮细胞的基底外侧膜聚Ig受体(pIgR)相互作用，在pIgR顶端切割后SIgA通过胞转作用被运入内腔。切割过的pIgR，已知是种分泌成分，可以保护SIgA不被许多在黏膜的细菌蛋白酶分解。估计在肠腔每天大概分泌3到5克的SIgA，可以解释它在调控黏膜免疫系统的主要角色。

除了分泌型，IgA以膜锚定形式存在(mIgA)，它是藉由RNA剪接将CH3表达序列接了一段膜的表达序列。膜表达序列被转译成膜锚定肽对应于三个不同环境的片段，分别为一个细胞外的肽，也称为mIg的同型特异性(migis-α)片段由26-32个氨基酸组成，一个跨膜区和一个细胞溶质尾段。migis-α片段在五种免疫球蛋白同种型的序列和长度均不同，而它们的跨膜结构域是高度保留的。因此，migis-α段可作为一个抗原区把mIgA与表达mIgA的B细胞作为目标，所得的抗体因此可用于治疗相关的疾病，其可以受益于消除mIgA表达的细胞或是在免疫系统中减少IgA抗体，如IgA淋巴癌，IgA肾病(IgAN)，过敏性紫斑症(HSP)，乳糜泻等。

在IgA1而不是IgA2，膜表达序列有两个剪接受体区而且mα1mRNA的异构物是由替代结合从CH3表达序列供体区对膜表达序列2个受体区的其中一个而来，两个产生的异构物差别在长异构物(mα1_L)在migis肽N端有多出6个氨基酸，短异构物长度为26个氨基酸(mα1_S)。在表达mIgA1的B细胞中长异构物的表达量大概是短异构物的2倍，研究显示，2个mα1对偶基因可以产生migis-α长与短异构物而且3个mα2对偶基因产生独特的短异构物。

早在1990年(美国专利号码5,079,334)migis-α已经被提出当成抗原区用来制备可以结合mIgA的抗体而且能造成表达mIgA的B细胞溶解，没有这样的抗体曾被制备。在我们之前的论文[Hung et al.,Mol.Immunol.48(15-16)：1975-1982(2011)]，酵素免疫分析法(ELISA)里数个能够强烈的与合成migis-α多肽和含有migis-α重组蛋白结合的抗体被制备了，然而这些抗体，只有一个抗体，以29C11表示，稍微可以结合B细胞上的mIgA,像是表达IgA1的DAKIKI细胞或是有转染mα1链的Daudi细胞。没有数据关于29C11可以藉由细胞凋亡，抗体依赖型细胞毒性或其它机制来引起表达mIgA的B细胞溶解。

发明内容

第一个方面，在此公开的实施方案提供抗migis-α抗体或片段其专一于人类mα链的migis-α，可以结合B淋巴细胞上的mIgA，进而造成表达mIgA的B细胞溶解与降低分泌IgA的B细胞产生IgA。

在一些实施例中，本文公开其抗migis-α抗体或片段包含以下互补决定区(CDR)：

(a)CDR-H1序列为SEQ ID NO:17的26-33，

(b)CDR-H2序列为SEQ ID NO:17的51-57，

(c)CDR-H3序列为SEQ ID NO:17的96-104，

(d)CDR-L1序列为SEQ ID NO:18的27-32，

(e)CDR-L2序列为SEQ ID NO:18的50-52，

(f)CDR-L3序列为SEQ ID NO:18的89-97。

在一些实施方案中，抗migis-α抗体或片段包含阐述于SEQ ID NO:17的VH和阐述于SEQ ID NO:18的VL。

在具体的实施方案中，抗migis-α抗体为单株抗体8G7。

在某些实施方案中，本文公开的抗体或片段是包含或上述抗抗体的F(ab)’₂，抗体片段(Fab)，可变片段(Fv)，单链可变片段(single-chain>

第二方面，在此公开的实施方案提供的医药组合物包含抗migis-α抗体或片段其专一于人类mα链的migis-α，可以结合B淋巴细胞上的mIgA，进而造成表达mIgA的B淋巴细胞溶解与降低分泌IgA的B巴细胞产生IgA和医药上可接受的载体。

在某些实施方案中，本文公开的医药组合物是治疗受试者的疾病，它能受惠于在免疫系统中清除表达mIgA的细胞或减少IgA抗体。

在某些实施方案中,疾病挑自含有IgA淋巴癌，IgA肾病，过敏性紫斑症(HSP)和乳糜泻的组别。

在第三个方面，本文公开的实施方案提供一种方法对于受试者在体外或体内溶解表达mIgA的B淋巴细胞与减少IgA的生成。包括采用抗体或片段其专一于人类mα链的migis-α，可以结合B淋巴细胞上的mIgA，进而造成表达mIgA的B淋巴细胞溶解与减少分泌IgA的B淋巴细胞产生IgA。

在第四个方面，本文公开的实施方案提供一种方法用来治疗受试者的疾病，包括施用抗体或片段其专一于人类mα链的migis-α可以结合B淋巴细胞上的mIgA，进而造成受试者免疫系统表达mIgA的B巴细胞溶解与减少IgA抗体。

在第五个方面，本文公开的实施方案提供使用抗migis-α抗体与片段用于治疗受试者的疾病，受惠于在免疫系统中清除表达mIgA的细胞或减少IgA抗体。

在某些实施方案中，所述疾病挑自含有IgA淋巴癌，IgA肾病(IgAN)，过敏性紫斑症(HSP)和乳糜泻的组别。

附图说明

图1显示了一个老鼠/人类嵌合重组蛋白质包括老鼠α免疫球蛋白的CH2和CH3区域，人类膜结合α链上膜锚定肽的migis-α部分，和取代了组成跨膜肽段的亮氨酸拉链肽，此肽形成二聚体。

图2是描绘抗IgA.Fc单株抗体(3C10)和两个抗migis-α单株抗体(8G7和29C11)对人类IgA和含有各种人类膜结合α链，或其它成份的反应性。

图3A-3C显示在ELISA中抗migis-α抗体抗原决定基定位。A)图3A指出migis-α_L的合成肽部分，有底线的序列是位在IgA>L部位的结合反应性。C)图3C指出抗migis-α单株抗体对migis-α_L>

图4A-4B显示在ELISA测量8G7和29C11结合mα的相对亲和力。A)图4A显示8G7和29C11对mα1.Fc_L-456S-LZ蛋白的结合强度。B)图4B显示8G7和29C11在与200nM生物素结合的29C11抗体竞争结合Fc_L-456S-LZ蛋白质的相对能力。

图5显示出抗migis-α单株抗体对DAKIKI细胞和表达mα1.Fc的转染Ramos细胞染色数据，灰色部分是同类型IgG的背景值。

图6显示8G7单株抗体对8个非mIgA表达的细胞株缺乏反应性。

图7显示抗migis-α单株抗体对有或没有处理MβCD的DAKIKI细胞的反应性。

图8的结果表明3C10和8G7能诱导2株表达mα1.Fc的转染Ramos细胞进行细胞凋亡，而29C11却无法有此效果。

图9的结果表明c8G7，但不是c29C11，可以以剂量依赖性的方式诱导显著的ADCC，样品数为4。

图10A-10B显示从22个提供者的人类周边血单核细胞以抗体处理后体外测量IgA和IgM浓度。A)图10A显示了c8G7可以显著并且专一降低周边血单核细胞IgA的产生。**，P<0.05；***P<0.001。B)图10B显示，c8G7治疗组IgA浓度降低到对照组浓度的54％。

图11A-11B显示在活体内表达mα1.Fc的A20转染细胞株处理抗migis-α抗体后生长抑制的研究。A)图11A显示了两个A20转染细胞株细胞表面表达ma1.Fc与B细胞标记的量。B)图11B显示纯化的抗体对肿瘤移植小鼠的治疗时程。

图12显示出了8G7单株抗体重链和轻链的可变区序列。每个链的三个互补决定区(CDRs)以粗体显示。

实施方式

在表达mIgA的B细胞上膜结合型IgA(mIgA)与Igα/Igβ合的复合物形成B细胞受体(BCR)，相较于α链的IgA(α)，mIgA(mα)的α链还含有一个C端膜锚定的肽，其包括细胞外、跨膜和胞内段。细胞外区段，称为mIg的同型特异性(migis-α)段或mα的胞外膜近侧域，是特定于mα，并已提出了可当成特定抗原区用来被抗体瞄准同型特异性表达mIgA的B细胞(美国专利号码5,079,334)，到现在没有这种抗体曾经被制备出来。

曾经有报告过，似乎指出mIgA上migis-α呈现的抗原决定基不是可接近的，在ELISA中有许多抗migis-α的抗体可以与含有合成migis-α的肽或是重组蛋白强烈的结合，然而它们无法侦测到与B细胞上的mIgA结合。29C11可以侦测到与B细胞上的mIgA结合，此结合是很微弱的。从先前技术得到这些结果会建议在B细胞上mIgA的migis-α抗原区以某种原本的构形存在或是被某些邻近的分子所干扰，导致它们无法被抗体所靠近[Hung et al.,Mol.Immunol.48(15-16)：1975-1982(2011)]。

在目前的申请，我们的理论说明合成的migis-α肽无法呈现原本的构形因而无法诱导抗体去辨认migis-α原本的构形，接着再当蛋白质有人类mα的CH3与migis-α时可以呈现原本的构形，这样的抗原决定基在免疫过程中会被认到邻近mIgA的CH3区域抗体所挡住，B淋巴细胞带有专一于migis-α抗原决定基的抗体受体就没有机会能结合migis-α抗原决定基。基于这样的假说，我们设计了一个免疫原它可以排除这样的困难。具体来说，这样的免疫原包含老鼠的CH3与人类的migis-α，在免疫过的小鼠里，没有诱导出结合CH3的抗体，它是个自己的抗原，让migis-α存在于原本的构形去让带有专一于migis-α抗体受体的B细胞辨识。使用这个策略，我们已经产生抗migis-α单株抗体，它可以有更好的结合能力去辨识B细胞上mIgA。我们已经显示出这个抗migis-α单株抗体可以结合表达mIgA的B细胞而且藉由存在二抗交叉结合能导致细胞凋亡使这些B细胞溶解而29C11是无法的。我们进一步显示这个抗migis-α单株抗体可以在体外对人类周边血单核细胞(PBMC)引起细胞毒杀并降低人类周边血单核细胞产生IgA。

第一个方面，在此公开的实施方案提供经分离的抗migis-α抗体或片段其专一于人类mα链的migis-α，可以结合B淋巴细胞上的mIgA，进而造成表现mIgA的B细胞溶解与降低分泌IgA的B细胞产生IgA。

在一些实施例中，其本文公开抗migis-α抗体或片段包含以下互补决定区(CDR)：

(a)CDR-H1序列为SEQ ID NO:17的26-33，

(b)CDR-H2序列为SEQ ID NO:17的51-57，

(c)CDR-H3序列为SEQ ID NO:17的96-104，

(d)CDR-L1序列为SEQ ID NO:18的27-32，

(e)CDR-L2序列为SEQ ID NO:18的50-52，

(f)CDR-L3序列为SEQ ID NO:18的89-97。

在一些实施方案中，抗migis-α抗体或片段其包含阐述于SEQIDNO:17的VH和阐述于SEQIDNO:18的VL。

“分离的”是指从其天然环境中除去蛋白质。然而，应当理解的是，蛋白质可以与稀释剂或佐剂配制，仍然为实用目的而被分离。例如，用于治疗疾病时的抗体通常与可接受的载体混合。

通常一个免疫球蛋白有一个重链与轻链，每个重链与轻链含有一个固定区域与可变区域(分别是VH和VL)，轻链与重链的可变区含有一“框架”区域被三个高度可变区域也称为互补决定区所中断，框架区和互补决定区的范围已被定义，不同轻链或重链框架区的序列在物种内是相对保留的。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，在三度空间中用于定位和对齐互补决定区。

互补决定区主要负责结合抗原的抗原决定基，互补决定区的每条链通常称为CDR1，CDR2和CDR3，从N端开始按顺序编号，并且通常还透过其中的特定链的CDR来识别。因此，VH CDR3位于被发现的抗体重链可变区域，而V_L>

在一个实施方案中，抗migis-α抗体或其片段是嵌合，人源化或人的抗体。

通常，人源化抗体中导入来自非人类来源的一个或多个氨基酸，这些非人类氨基酸残基通常被称为进口残基，其通常取自输入可变区域。人源化基本上遵循Jones等人描述的方法，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；或Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)，通过对一个人类抗体的相对应序列取代啮齿类CDRs或CDR序列。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人物种相对应序列所取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能一些框架残基被类似位置的啮齿动物抗体残基所取代。

在一些实施方案中，“人类抗体”指免疫球蛋白包括了人类的高度变异区与人类框架区和恒定区，这种抗体可以使用各种已知的技术来制造，例如体外方法涉及在噬菌体表达上使用人类抗体片段重组库(如McCafferty等人，1990，Nature348：552-554；Hoogenboom&Winter，J.Mol.Bio.227：381(1991)；和Marks等人，J.Mol.Bio.222：581(1991))，酵母细胞(Boder和Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15：553-557)，或核糖体(Hanes和Pluckthun，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94：4937-4942)。类似地，人类抗体可以通过将人免疫球蛋白基因导入转基因动物，例如小鼠，其中内源的免疫球蛋白基因部分或完全被去活化。刺激过后，人类抗体的产生被观察到，它与人类在各方面都非常地相似，包括基因重组，装配和抗体分布。这种方法有被描述过，例如，在美国专利号6,150,584，5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，并在以下科学出版物：(例如，Jakobavits，Drug Deliv Rev.31:33-42(1998)，Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。

在一个具体实施方案中，抗migis-α抗体是单株抗体8G7。

在某些实施方案中，本文公开所叙述抗体或其片段包括上述抗migis-α抗体的F(ab)'₂，Fab，Fv，或单链Fv片段。

在一些实施方案中，“抗体片段”是指含有完整抗体的一部分，一般是抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')2，和Fv片段；单结构域抗体(例如，Wesolowski，Med Microbiol Immunol.(2009)198(3)：157-74；Saerens等人，Curr OpinPharmacol.(2008)8(5)：600-8；Harmsen和DeHaard，Appl Microbiol Biotechnol.(2007)77(1)：13-22)；螺旋稳定化抗体(参见，例如，Arndt等人，J Mol Biol 312：221-228(2001)；双抗体(见下文)；单链抗体分子(“scFv，”见，例如，美国专利号5,888,773)；双硫化稳定抗体(“dsFvs”，见，例如，美国专利号5,747,654和6,558,672)，和结构域抗体(“dAb，”见，例如，Holt等人，Trends Biotech 21(11)：484-490(2003)，Ghahroudi等人，FEBS Lett.414：521-526(1997)，Lauwereys等人，EMBO J 17：3512-3520(1998)，Reiter等，J.Mol.Biol.290：685-698(1999)，Davies和Riechmann，Biotechnology，13：475-479(2001))。

第二方面，在此公开的实施方案提供的医药组合物包含抗migis-α抗体或片段专一于人类mα链的migis-α，可以结合B淋巴细胞上的进而造成表现mIgA的B淋巴细胞溶解与降低分泌IgA的B淋巴细胞产生IgA和医药上可接受的载体。

“医药上可接受的”是指可接受用于医药和兽医用途，即没有不可接受的毒性或其它不适当的。

在某些实施方案中，本文公开的医药组合物是治疗受试者的疾病，它能受惠于在免疫系统中清除表达mIgA的细胞或减少IgA抗体。

在某些实施方案中，疾病挑自含有IgA淋巴癌，IgA肾病(IgAN)，过敏性紫斑症(HSP)和乳糜泻的组别。

在第三个方面，本文公开的实施方案提供一种方法对于受试者在体外或体内溶解表达mIgA的B淋巴细胞与减少IgA的生成，包括采用抗体或片段其专一于人类mα链的migis-α，可以结合B淋巴细胞上的mIgA，进而造成表达mIgA的B淋巴细胞溶解与降低分泌IgA的B淋巴细胞产生IgA。

在第四个方面，本文公开的实施方案提供一种方法用来治疗受试者的疾病，包括施用抗体或片段其专一于人类mα链的migis-α，可以结合B淋巴细胞上的mIgA，进而造成受试者免疫系统表达mIgA的B淋巴细胞溶解与减少IgA抗体。

在某些实施方案中,疾病挑自含有IgA淋巴癌，IgA肾病(IgAN)，过敏性紫斑症(HSP)和乳糜泻的组别。

在第五个方面，本文公开的实施方案提供使用抗migis-α抗体与片段用于治疗受试者的疾病，受惠于在免疫系统中清除表达mIgA的细胞或减少IgA抗体。

在某些实施方案中,疾病挑自含有IgA淋巴癌，IgA肾病(IgAN)，过敏性紫斑症(HSP)和乳糜泻组别。

在某些实施方案中，本文公开的术语“受试者”或“病患”可交替使用。

在某些实施方案中，术语“受试者”或“病患”是指一种细胞(例如一个免疫细胞，一个B淋巴细胞，或表达mIgA的B淋巴细胞)，动物(例如，鸟类，爬行动物和哺乳动物)，偏好哺乳动物，包括非灵长类(例如，骆驼，驴，斑马，牛，猪，马，猫，狗，大鼠和小鼠)和灵长类动物(如猴子，黑猩猩和人类)。在某些实施方案中，受试者或病患可以受惠于在免疫系统中清除表达mIgA的细胞或减少IgA抗体。

除非在此另有说明或与上下文明显矛盾，使用的术语“一”、“一个”和“这个”与类似的指示对象在上下文中描述本发明(特别是在以下权利要求的上下文中)被解释为包括单数和复数，。除非另有说明。“包括”、“有”、“包含”和“含有”的术语将被理解为开放式术语(即意思是“包含，但不限于，”)。本文在此列举的数值范围仅用作为提及每一个落在该范围内单独的数值的简略方式，除非本文另有说明，并且每个单独的数值并入说明，就好像它在本文中单独列举一样。本文中所描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾。除非另有声明，本文所提供使用的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“如”)，仅仅是为了更好地阐明本发明，并不构成限制本发明的范围。不应将说明书中记载而未请求保护的组件视为实作本发明所必须的组件。

本发明在此描述的偏好实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读了前面的描述，这些偏好实施方案的变化对本领域的普通技术也许变得显而易见。发明人预期熟练的技术人员采用这些适当的变化，并且发明人认为本发明被不同于这里具体描述的所实践。因此，在符合相关法律的前提下，本发明涵盖附随的权利要求书中所述主题的所有修改和等同物。。此外，本发明包括上述元素在所有可能的变化中的任何组合，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾。

下面的实施例进一步说明实施方案，当然，不应该被认为以任何方式限制其范围。

实施例

实施例1

建构与表达含有migis-a的重组蛋白质

为了制备含migis-α_L小鼠/人嵌合蛋白(SEQ>TM293表达系统(Invitrogen)来表达。对于大规模的细胞转染，1.2毫克的质粒DNA稀释于20ml无血清DMEM中，与3.6毫克的线性聚乙烯亚胺(Polysciences)稀释在20毫升9克/升的NaCl溶液混合。将混合物在室温下放置10分钟，然后缓慢加入到一个含有160毫升新鲜FreeStyle^TM293表达培养基中有2×10⁹FreeStyle^TM293F细胞的培养瓶中。细胞在37℃摇动4小时，然后将600ml新鲜FreeStyle^TM293表达培养基加入到瓶中用于进一步的培养。细胞生长5天后，把培养基离心，将上清液通过使用的Ni-NTA琼脂糖(MACHEREY-NAGEL)进行蛋白质纯化。纯化步骤根据生产商的操作手册，纯化的蛋白被储存在PBS中。为了准备用免疫酵素分析法(ELISA)筛选和检查融合瘤的重组蛋白，表达各种含有人类migis-α蛋白质同种型与异构物的DNA序列分别是mα1.Fc(SEQ ID NO:2)和mα1.Fc_S-LZ(SEQ>L-456S-LZ(SEQ>L-456C-LZ(SEQ>

实施例2

确认一个崭新能够显著地结合表达mIgA的B细胞的抗migis-α单株抗体

在两周的间隔用五十微克嵌合蛋白质以皮下注射4-5次来免疫每只Balb/c小鼠，细胞融合前三天，注射10微克嵌合蛋白质到每只小鼠静脉里。从免疫小鼠中分离的脾细胞透过使用聚乙二醇1500(Roche)与小鼠骨髓瘤细胞FO融合。在融合过程后，细胞生长在HAT筛选培养基中10-12天而且培养液被取出用于ELISA筛选(在下一节详述)。重组蛋白mα1.Fc_L-456S-LZ和mα1.Fc分别作为阳性抗原和阴性抗原。融合瘤产生抗体与mα1.Fc_L-LZ反应但未与mα1.Fc反应被鉴定为可能的细胞，藉由在ELISA中使用辣根过氧化物酶(HRP)结合山羊抗小鼠IgG.Fc抗体(Jackson>5DAKIKI细胞与100μl细胞培养液在冰上静置30分钟，细胞用染色缓冲液[PBS，2％胎牛血清(FBS，Invitrogen)和0.05％迭氮化钠]洗涤后，与FITC结合的兔子F(ab)'2抗小鼠IgG抗体(AbD>

实施例3

检查抗migis-α单株抗体结合反应性和相对结合亲和力

从融合瘤细胞培养液中使用蛋白质A琼脂糖CL-4B介质(GE Healthcare)纯化抗migis-α单株抗体8G7(Igγ2b，κ)和29C11(Igγ1，κ)，纯化的单株抗体以1毫克/毫升的浓度储存在PBS中。小鼠抗人单株抗IgA1.Fc抗体3C10(Igγ1，Abcam)和小鼠总IgG(Sigma-Aldrich公司)分别用作阳性和阴性对照，数个含有migis-α重组蛋白和几个不相干蛋白在ELISA中进行测试。蛋白质在4℃以1微克/毫升，在0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液覆盖在免疫分析盘一整夜。用PBST(PBS含0.05％20)洗涤免疫分析盘，并在室温下1小时以PBS/BSA(PBS含有1％BSA)阻断。用PBST洗涤后，单株抗体以1微克/毫升的浓度在PBS/BSA中加入免疫分析盘里并在室温下放置1小时。免疫分析盘用PBST洗涤，然后HRP结合的山羊抗小鼠抗体IgG.Fc以1:10,000稀释在PBS/BSA中加入到免疫分析盘。在室温下放置1小时后用PBST洗涤，四甲基联苯胺底物(Clinical Scientific Products)加入到免疫分析盘作为比色测量，图2显示出了8G7专一反应于migis-α片段。

进一步在ELISA用合成migis-α_L多肽研究抗migis-α单株抗体的抗原决定基。多肽maFL(SEQ>L序列全长片段，N端部分，中间部分，以及C末端部分(图3A)。多肽maF1-2(SEQID>L的N端序列部分反应，但不与N端多肽的短片段反应(图3B-C)。相较之下，29C11是能够结合migis-α_L序列N端和中间部分，并且与N端多肽的短片段反应(图3B-C)。

为了确定抗migis-α单株抗体的相对结合亲和力，用连续稀释的单株抗体与mα1.Fc_L-456S-LZ蛋白反应，由ELISA进行定量结果，结合曲线是由软件(GraphPad)进行分析，并用以下的方程试计算出

Y＝B_max*X/(Kd+X)

B_max为最大结合，与Y为同一单位，Kd是平衡结合常数，相当于在平衡时抗体结合一半抗原的浓度。8G7达到一半最大结合的浓度比29C11低约6倍(图4A)。

用竞争性ELISA测定8G7和29C11抑制结合生物素标记的29C11对mα1.Fc_L-456S-LZ蛋白的能力，使用EZ-Link的磺基-NHS-生物素和生物素化试剂组(Thermo>L-456S-LZ蛋白以1微克/毫升覆盖在免疫分析盘上接着以PBS/BSA阻断。8G7和29C11以500nM的起始浓度4倍连续稀释分别与200nM生物素结合的29C11预先混合，并且在室温下静置20分钟，混合物然后转移到免疫分析盘并在室温静置2小时。洗涤后，将HRP结合的抗生物素蛋白(Sigma-Aldrich)以1:100,000稀释在PBS/BSA加入免疫分析盘并静置30分钟。经过彻底的洗涤后加入TMB底物用于比色测量。ELISA结果是由软件分析而且两个单株抗体的抑制浓度(IC50)由下面的方程式所计算

Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^(X-LogIC50))

顶部和底部是在Y轴的单位高原且IC50是竞争者造成在底部和顶部之间结合一半的浓度。图4B显示8G7能够与生物素结合29C11对migis-α结合做竞争而且比29C11更有效，本实施例的结果证明，8G7的亲和力比29C11更高。

实施例4

流式细胞分析靠近表达mIgA的B细胞的抗migis-α单株抗体

在融合瘤的筛选中使用DAKIKI细胞，它表达mα1链长的和短的亚型，藉由纯化的单株抗体定量检测。为了进一步测试对每个mα1亚型的结合，人类B细胞株Ramos(IgM⁺B淋巴细胞，ATCC)分别稳定表达mα1.Fc_L-456C(SEQ>L-456C或mα1.Fc_S(SEQID>S被制备。简言之，5×10⁶Ramos细胞溶于300μl无血清的RPMI>L-456C和mα1.Fc_S细胞藉由流式细胞分析用FITC结合的山羊抗人类IgA抗体分别被挑选出，细胞维持在含有0.5毫克/毫升G418完全RPMI培养基。

对于在实施例中的流式细胞测定法，3C10被用作检测表达mIgA的阳性对照和小鼠抗人类膜结合mIgE单株抗体4B12(Igγ1，κ)被用作阴性对照。为了进行细胞染色，10⁶细胞洗涤并与单株抗体在100μl染色缓冲液放置在冰上30分钟，细胞随后用染色缓冲液洗涤并与FITC标记的兔子F(ab)'₂抗小鼠IgG抗体(Invitrogen)以1:400稀释在100μl染色缓冲液放置冰上30分钟。洗涤后，将细胞重新溶于400μl染色缓冲液并用FACSCanto>L-456S和Ramos/mα1.Fc_S的MFI超过背景值{(MFI_8G7-MFI_背景)/(MFI_29C11-MFI_背景)}分别比2911高13.49和10.37倍。

藉由数个没有表达mIgA的细胞株，有Ramos，Daudi(IgM⁺B淋巴细胞，ATCC)，IM-9(IgG⁺B淋巴细胞，ATCC)，U266(IgE⁺B淋巴细胞，ATCC)，H929(IgA⁺B淋巴细胞，ATCC)，CCRF-CEM(T淋巴细胞，ATCC)，KU812(嗜碱性细胞，ATCC)和U-937(单核细胞，ATCC)，来检验8G7的反应性(图6)，结果显示8G7对这些细胞株的表面分子不具有反应性。

由于mIgA与B细胞表面Igα/Igβ异二聚体结合形成B细胞受体复合物可与脂筏相互作用，一些migis-α段可能被埋在复合物内。为了研究抗migis-α单株抗体对B细胞上mIgA反应的屏障，胆固醇萃取化合物甲基β环糊精(MβCD，Sigma-Aldrich)被用来瓦解mIgA受体复合物的完整性。DAKIKI细胞用预热的RPMI培养基中洗条两次并溶在浓度10mM MβCD的RPMI培养基中(5×10⁶细胞/毫升)在37℃偶尔搅拌30分钟。细胞随后用染色缓冲液两次，并在流式细胞分析中进行细胞染色。10微克/毫升的单株抗体用于染色而且用FITC标记的兔子F(ab)'₂抗小鼠IgG抗体以1:400稀释来侦测。MβCD处理后，29C11显现增加结合DAKIKI细胞的讯号，而3C10的荧光强度下降超过10倍(图7)。在相同的抗体浓度8G7结合MβCD处理过的DAKIKI细胞比3C10和29C11更好。在这个例子的结果表明，8G7能够与B细胞表面原本形态的mIgA结合，只有当脂筏遭到破坏时29C11才能结合mIgA。

实施例5

藉由抗migis-α单株抗体8G7诱导表达mIgA的B转染细胞进行细胞凋亡

为了测试交叉结合的mIgA受体复合物是否能够诱导细胞凋亡信号，Ramos的转染细胞，Ramos/mα1.Fc_L-456C和Ramos/mα1.Fc_S分别用抗体处理，200μl完全RPMI>5细胞接种于96孔盘中对每个条件以三次重复来操作。单株抗体的连续稀释液加入到孔中并在37℃下静置1小时，交叉结合用山羊的F(ab')₂抗小鼠IgG(Jackson>2]中用2微克碘化丙啶(PI，Sigma-Aldrich)和1μl的膜联蛋白V-FITC(Annexin>+/PI^-加膜联蛋白V⁺/PI⁺。图8显示出3C10和8G7在最大浓度(1.5微克/毫升)分别诱导73.67％和66.68％Ramos/mα1.Fc_L-456C的细胞凋亡，在相同的浓度3C10和8G7可分别诱导89.70％和49.45％的Ramos/mα1.Fc_S(图8)。与小鼠IgG对照组的结果相较，在此浓度范围29C11对这2株Ramos转染细胞株不会诱导任何显著的细胞凋亡。比较诱导这两个转染细胞株细胞凋亡的效率，8G7诱导Ramos/mα1.Fc_L-456C细胞凋亡比Ramos/mα1.Fc_S强。

实施例6

对人类周边血单核细胞用老鼠/人类嵌合抗migis-α单株抗体c8G7触发抗体依赖型细胞毒性(ADCC)

ADCC是抗体聚集带有Fcγ受体的作用细胞如自然杀手(NK)细胞和巨噬细胞，破坏被抗体覆盖的细胞的有效机制之一。在本实施例2株人类mIgA1转染细胞株，Ramos/mα1.Fc_L-456C和Ramos/mα1.Fc_S，分别被用作标靶细胞且从血库(台北，台湾)中得到白血球浓缩物里面分离出人类周边血单核细胞担任作用细胞，人类血液样本的操作是根据医学研究伦理委员会(中央研究院，台湾)所核准。小鼠/人类嵌合单株抗体的制备是透过基因工程将与人类对应部分(γ1和κ)取代老鼠的γ和κ恒定区，并在FreeStyle^TM293表达系统中表达，嵌合8G7和29C11分别被标示为c8G7和c29C11，会与gp120蛋白发生反应的老鼠/人类嵌合单株抗cBAT123用作阴性对照。

为了制备周边血单核细胞，白血球浓缩物(50毫升)与50毫升Hank’s平衡盐溶液(HBSS，Invitrogen)混合，20毫升的稀释浓缩物小心的加到装有15毫升Ficoll-HypaquePlus溶液(GE Healthcare)的50毫升离心管。四管有1百毫升总稀释的浓缩物进行离心，从浓缩物残留的红血球细胞以300xg离心40分钟以分离周边血单核细胞。取出周边血单核细胞层并用50毫升的HBSS洗三次，周边血单核细胞的数量以台盼蓝排除法计算且所需的周边血单核细胞数目以5×10⁶细胞/毫升溶于完全RPMI培养基中供接下来使用，剩下的周边血单核细胞中储存在含10％二甲基亚砜的FBS放在液氮里。为了使用保存的周边血单核细胞当成作用细胞，进行ADCC检测前将周边血单核细胞解冻并培养在完全的RPMI培养基中24小时。

以羧基琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen公司)标记靶细胞，1×10⁶的转染细胞，用10毫升温的0.1％BSA/PBS洗涤一次并溶于1ml温的含有1μm>5个细胞/毫升溶在温的完全RPMI培养基中进行下列测试。为了测试ADCC活性，将2×10⁴标记的靶细胞(100μl)加到圆底96孔盘的每个孔里，不同浓度的嵌合抗体(5μl)加入到孔里并在37℃下静置30分钟，随后混合5×10⁵的PBMC(100μl)，然后细胞混合物培养在37℃16-20小时。在这个例子中4位捐助者的周边血单核细胞个别进行了测试且每个抗体浓度实验为三次重复。在将细胞送入FACSCanto>+/7-AAD^-，靶细胞溶解百分比(％ADCC)的由下面的公式所计算

％靶细胞溶解＝{([％活靶细胞]_无mAb处理–[％活靶细胞]_mAb处理)/[％活靶细胞]_无mAb处理}*100

结果显示，利妥昔单抗(Rituxan)和c8G7对这两个靶细胞显现剂量依赖性的ADCC(图9)，c8G7在10微克/毫升的浓度下对Ramos/mα1.Fc_L-456C和Ramos/mα1.Fc_S分别诱导25.23％和28.30％ADCC(图9)。在相同浓度下利妥昔单抗对Ramos/mα1.Fc_L-456C和Ramos/mα1.Fc_S分别诱导58.16％和65.4％细胞溶解，本实施例测试的抗体浓度范围内，c29C11组没有造成显著的ADCC。

实施例7

人类PBMC藉由处理小鼠/人类嵌合抗migis-α单株抗体c8G7而减少产生IgA的体外测试

22名健康者提供的PBMC以前面例子中所描述的程序制备，细胞以浓度2×10⁶/毫升溶于完全IMDM(Invitrogen)而且将200μl的细胞加到96孔培养盘的每个孔里，然后以5微克/毫升的最终浓度将抗体加入到孔中。培养5天后，将细胞以400xg离心5分钟，将上清液(各孔150μl)与等体积的1％的BSA/PBS混合,用人类IgA和IgM>

结果显示，c8G7和利妥昔单抗处理过的组别与对照组相比IgA浓度减少具有高度统计上显著(图10A)，c29C11在此处理的浓度不能降低IgA产生(图10A)。虽然在c29C11和c8G7处理过的组别IgM浓度比对照组略低，但它们之间与对照组没有统计上显著性(图10A)。相较之下，利妥昔单抗可以有效地抑制IgM的产生(图10A)，图10B显示出每个组与对照组IgA和IgM浓度的百分比。在这种处理条件与对照组相比，c8G7和利妥昔单抗分别降低IgA的浓度50％与20％(图10B)，与对照组相比只有利妥昔单抗可以减少IgM浓度40％，为统计上显著(图10B)。

实施例8

以抗migis-α单株抗体8G7治疗表达mIgA的B转染细胞移植到小鼠的生长抑制

稳定表达mα1.Fc_L-456S(SEQ>+B淋巴细胞，ATCC)αα分别称为A20/mα1.Fc_L456S和A20/mα1.Fc_S；以细胞电穿孔和药物筛选制备细胞的过程，与前面的例子准备Ramos的转染细胞一样。由流式细胞分析用FITC标记的山羊抗人类IgA抗体分别有挑选到稳定表达mα1.Fc_L-456S和mα1.Fc_S的细胞株，(图11A)且维持在含有0.5毫克/毫升G418的完全RPMI培养基中。2株转染细胞的小鼠B细胞标记CD19，CD45R，和CD79b也藉由流式细胞鉴定，分别用FITC标记的大鼠抗小鼠CD19，PE标记的大鼠抗小鼠CD45R，和FITC标记的仓鼠抗小鼠CD79(BD>

为了测试抗体处理A20的转染细胞体内生长抑制，细胞用Hank’s平衡盐溶液(HBSS，Invitrogen)洗涤两次，并以1×10⁸细胞/毫升溶于HBSS中，然后将细胞与Geltrex^TMLDEV低生长因子基底膜基质(Invitrogen)以1:1混合，并小心转移到装有22号针头的针筒。细胞混合物(5×10⁶个细胞/100μl/部位)以皮下方式接种到6-8周C.B-17Scid小鼠的腹腔侧面(国家实验动物中心，台湾)。植入(第0天)后，小鼠接受纯化29C11或8G7以5毫克/公斤的剂量通过尾静脉在第1，4，7，10，14和21天进行静脉注射(图11B)，纯化的小鼠血清IgG(Sigma-Aldrich)用于对照组。每种抗体组测试五只肿瘤接种的小鼠，每周用光标卡尺测定肿瘤大小，而且体积计算采用下列算式：1/2×长×宽平方，肿瘤达到3000立方毫米体积就会将小鼠牺性。

序列表

SEQ ID NO 1

长度：306

类型：PRT

生物体：人工序列

特征：粗体，小鼠IgA.Fc：带下划线字体，人类migis-α1_L；斜体，亮氨酸拉链

其他资讯：含小鼠/人类嵌合migis-α1_L的蛋白质

序列：1

SEQ ID NO 2

长度：243

类型：PRT

生物体：智人

特征：

其他资讯：人类mα1.Fc

序列：2

SEQ ID NO 3

长度：297

类型：PRT

生物体：智人

特征：

其他资讯：人类mα1.Fc_S-LZ

序列：3

SEQ ID NO 4

长度：303

类型：PRT

生物体：智人

类型：

其他资讯：人类mα1.Fc_L-456S-LZ

序列：4

SEQ ID NO 5

长度：303

类型：PRT

生物体：智人

类型：

其他资讯：人类mα1.Fc_L-456C-LZ

序列：5

SEQ ID NO 6

长度：314

类型：PRT

生物体：智人

类型：

其他资讯：人类mα1.Fc_L-456C

序列：6

SEQ ID NO 7

长度：308

类型：PRT

生物体：智人

类型：

其他资讯：人类mα1.Fc_S

序列：7

SEQ ID NO 8

长度：314

类型：PRT

生物体：智人

类型：

其他资讯：人类mα1.Fc_L-456S

序列：8

SEQ ID NO 9

长度：36

类型：PRT

生物体：人工序列

特征：

其他资讯：合成肽maFL

序列：9

SEQ ID NO 10

长度：18

类型：PRT

生物体：人工序列

类型：

其他资讯：合成肽maFa

序列：10

SEQ ID NO 11

长度：16

类型：PRT

生物体：人工序列

类型：

其他资讯：合成肽maFb

序列：11

SEQ ID NO 12

长度：16

类型：PRT

生物体：人工序列

类型：

其他资讯：合成肽maFc

序列：12

SEQ ID NO 13

长度：12

类型：PRT

生物体：人工序列

类型：

其他资讯：合成肽maF1-2

序列：13

SEQ ID NO 14

长度：12

类型：PRT

生物体：人工序列

类型：

其他资讯：合成肽maF1-3

序列：14

SEQ ID NO 15

长度：12

类型：PRT

生物体：人工序列

类型：

其他资讯：合成肽maF2

序列：15

SEQ ID NO 16

长度：12

类型：PRT

生物体：人工序列

类型：

其他资讯：合成肽maF2-1

序列：16

SEQ ID NO 17

长度：115

类型：PRT

生物体：小家鼠

特征：

其他资讯：小鼠8G7重链的可变区

序列：17

SEQ ID NO 18

长度：107

类型：PRT

生物体：小家鼠

特征：

其他资讯：小鼠8G7轻链的可变区

序列：18

SEQ ID NO 19

长度：120

类型：PRT

生物体：小家鼠

特征：

其他资讯：小鼠29C11重链的可变区

序列：19

SEQ ID NO 20

长度：106

类型：PRT

生物体：小家鼠

特征：

其他资讯：小鼠29C11轻链的可变区

序列：20