银纳米粒子诱导苝衍生物探针自组装的苝激基缔合物及其制备方法

摘要

本发明提供一种银纳米粒子诱导苝衍生物探针自组装的苝激基缔合物及其制备方法，属于生物分析技术领域。该方法将银纳米粒子溶液和苝衍生物探针溶液混合，得到苝激基缔合物；所述的银纳米粒子的粒径为19.69‑29.34。本发明首次利用银纳米粒子与苝探针结合，形成缔合物不需要共价修饰，步骤简单，成本较低廉，且在探针浓度很低的情况下，银纳米粒子即可诱导其形成明显的缔合物荧光，而且其集聚体可以通过金属增强效应有效增加缔合物发射强度，探针浓度在很低时依然可观察到明显的缔合物荧光。

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种银纳米粒子诱导苝衍生物探针自组装的苝激基缔合物及其制备方法。

背景技术

苝衍生物是一类芳香稠环共轭化合物，它有大的π-π共轭电子结构，当两个或多个激发态的分子相互靠近时，可以观察到很强的激基缔合物(Excimer)荧光。激基缔合物荧光具有其较大的stokes位移和较长的荧光寿命，在生物分析和生物传感中有广泛应用。例如2014年Wang Fangyuan等人利用苝探针的激基缔合物荧光实现了不同基底上的指纹识别(Anal.Methods.,2014,6,654-657)。2015年Wang Yan等人利用聚合物诱导苝探针形成激基缔合物，并将其成功应用于甲基化酶活性及抑制剂检测(Anal.Chem.,2014,86,4371-4378)。

目前已报道的获得苝激基缔合物的手段主要分为两大类：共价和非共价方法。共价方法是通过化学修饰使两个或多个分子偶联结合起来，形成更大的π-π共轭结构。但是共价方法技术上要求苛刻，繁琐耗时，而且成本较高。已报道的非共价方法主要包括改变温度，调整溶剂极性，由小分子或聚合物诱导以及自组装形成纳米结构。这些方法通常都需要发光分子处于很高的浓度范围(微摩尔级别)。因此迫切需要发掘可以使苝衍生物在低浓度就可以检测到可观的荧光发射的新方法。

研究发现贵金属(例如金、银)纳米材料可以很好的增强发光物质的荧光，这种现象被称为金属增强荧光(Metal-enhanced fluorescence,MEF)。当发光物质足够靠近金属表面，金属的表面等离子共振效应(Surface plasmon resonance,SPR)使其表面的电磁场强度急剧增强。金属表面的电磁场与发光基团形成耦合体系，有效地增强激发和辐射衰变，进而使得荧光发射显著增强。金属纳米材料增强荧光效应和纳米材料的形状尺寸，纳米材料与发光基团之间的距离以及发光物质的发射光谱与纳米材料的SPR光谱重叠情况密切相关。银纳米材料因为其很强的SPR效应被广泛应用于各种发光物质的荧光增强，包括荧光染料、量子点、共轭聚合物以及上转换材料。然而，银纳米材料在苝衍生物激基缔合物荧光增强方面的应用却很少，只有Ryohei Yasukuni等利用银立方体来增强苝衍生物薄膜的激基缔合物发光(Journal of Phtochemistry and Photobiology A:Chemistry,2011,221,194-198)。他们在苝衍生物薄膜表层自组装了一层银立方体，银立方体的SPR效应就可以很好地增强苝的缔合物荧光。此方法不足的地方在于银立方体合成可控性较差，层层组装步骤繁琐以及需要很高浓度的苝探针，导致成本较高。

发明内容

本发明的目的是为了提供现有的方法需要很高浓度的苝探针且方法繁琐的问题，而提供一种银纳米粒子诱导苝衍生物探针自组装的苝激基缔合物及其制备方法。

本发明首先提供一种银纳米粒子诱导苝衍生物探针自组装的苝激基缔合物的制备方法，该方法包括：

将银纳米粒子溶液和苝衍生物探针溶液混合，得到苝激基缔合物；所述的银纳米粒子的粒径为19.69-29.34。

优选的是，所述的苝衍生物探针的结构为：

优选的是，所述的银纳米粒子溶液是将银纳米粒子、磷酸盐缓冲溶液和水混合得到的。

优选的是，所述的银纳米粒子溶液和苝衍生物探针溶液的体积比为396：4。

优选的是，所述的苝衍生物探针的终浓度为10-200nM。

本发明还提供上述制备方法得到的苝激基缔合物。

本发明的有益效果

本发明提供一种银纳米粒子诱导苝衍生物探针自组装的苝激基缔合物及其制备方法和应用，该方法将银纳米粒子溶液和苝衍生物探针溶液混合，得到苝激基缔合物；所述的银纳米粒子的粒径为19.69-29.34。与现有技术相对比，本发明首次利用银纳米粒子与苝探针结合，形成缔合物不需要共价修饰，步骤简单，成本较低廉，且在探针浓度很低的情况下，银纳米粒子即可诱导其形成明显的缔合物荧光，而且其集聚体可以通过金属增强效应有效增加缔合物发射强度，所以探针浓度在很低时依然可观察到明显的缔合物荧光。

附图说明

图1为本发明苝激基缔合物形成的原理示意图；

图2为不同浓度银纳米粒子与探针作用后探针荧光光谱的变化图以及缔合物荧光与单体荧光比值(I_E/I_M)随银纳米粒子浓度的变化图；

图3为银纳米粒子在加入苝探针前(A)和后(B)SPR光谱图；

图4为银纳米粒子与不同浓度探针作用后探针荧光光谱的变化图；

图5为对比例1和2纳米粒子加入探针前后的SPR光谱(A)以及探针荧光光谱(B)。

具体实施方式

本发明首先提供一种银纳米粒子诱导苝衍生物探针自组装的苝激基缔合物的制备方法，该方法包括：

将银纳米粒子溶液和苝衍生物探针溶液混合，得到苝激基缔合物；所述的银纳米粒子的粒径为19.69-29.34nm。

按照本发明，所述的银纳米粒子溶液优选是将银纳米粒子、磷酸盐缓冲溶液和水混合得到的，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH优选为7.0，银纳米粒子、磷酸盐缓冲溶液和水的体积比优选为40：20：336。

按照本发明，所述的银纳米粒子的制备方法采用本领域熟知的方法制备而成，没有特殊限制，本发明的银纳米粒子是参照文献Journal of Colloid and Interface Science,2013,394,263-268制备得到的。

按照本发明，所述的苝衍生物探针溶液是将苝衍生物探针溶于水中得到的，所述的苝衍生物探针溶液的浓度优选为10-200nM，所述的苝衍生物探针是参照文献Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49,1485–1488制备得到的。所述的苝衍生物探针的结构优选为：

按照本发明，所述的苝衍生物探针的终浓度优选为10-200nM；所述的银纳米粒子溶液和苝衍生物探针溶液的体积比优为396：4。

本发明还提供上述制备方法得到的苝激基缔合物。

按照本发明，所述的银纳米粒子表面保护剂是柠檬酸钠，因此其在缓冲液中是带负电荷，苝衍生物探针是带正电荷，带正电荷的苝衍生物探针(Probe 1)在水溶液单独存在时，主要是以单体形式存在，荧光主要是单体荧光发射。图1为本发明苝激基缔合物形成的原理示意图，当加入负电荷的银纳米粒子，由于正负电荷静电吸引作用，银纳米粒子诱导探针集聚，导致单体荧光集聚淬灭，并形成激基缔合物荧光(如图1所示)。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。

实施例1

将396uL银纳米粒子溶液和4uL苝衍生物探针溶液(10uM)混合，得到苝激基缔合物；所述的银纳米粒子(Ag-1 NPs，Ag-2 NPs和Ag-3 NPs)的粒径分别为9.74、19.69和29.34nm；苝衍生物探针的终浓度为100nM。

所述的银纳米粒子溶液包括20uL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)、Ag NPs(0～100uL,间隔10uL)和H₂O,最终体积396uL。

图2为不同浓度(以Ag NPs的初始加入体积占溶液总体积来表示浓度)银纳米粒子(A,B,C分别对应Ag-1 NPs,Ag-2 NPs,Ag-3 NPs)与探针作用后探针荧光光谱的变化图(比值升高部分)，以及缔合物荧光与单体荧光比值(I_E/I_M)随银纳米粒子浓度的变化图(D)，图2说明：随着银纳米粒子浓度的增加，545nm处的单体荧光发射逐渐被淬灭，但是660nm处缔合物荧光变化却有所不同，尺寸最小(Ag-1>

图3为银纳米粒子在加入苝探针前(A)和后(B)SPR光谱图，图3说明：加入苝探针以前，银纳米粒子呈良好的单体分散状态，其主要SPR峰位分别是387,391,和394nm。加入探针以后，银纳米粒子被诱导形成集聚体，单体SPR峰强度急剧下降，较大尺寸银纳米粒子(Ag-2 NPs,Ag-3 NPs)分别在630nm和657nm处生成了明显的集聚体SPR峰，这是因为较大尺寸银纳米粒子的集聚体SPR峰位很靠近苝探针激基缔合物的发射峰位660nm，因此可能会通过金属增强荧光效应有效增加探针的缔合物荧光，而小尺寸银纳米粒子(Ag-1 NPs)则无明显集聚峰生成。这结果与上面荧光光谱的变化结果相一致。

实施例2

将396uL银纳米粒子溶液和4uL不同浓度的苝衍生物探针溶液混合，得到苝激基缔合物；所述的银纳米粒子Ag NPs的粒径为29.34nm；苝衍生物探针的终浓度分别为0,5,10,20,25,50,75,100,125,150,175和200nM.。

所述的银纳米粒子溶液包括20uL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)、Ag NPs(40uL)和336uLH₂O,最终体积396uL。

图4为银纳米粒子与不同浓度探针作用后探针荧光光谱的变化图，图4说明：随着探针浓度的增加，660nm处缔合物荧光也不断增强，而且在探针浓度低至10nM时，就可以观察到缔合物荧光，和现有技术中其他诱导缔合物形成的方法相比，所需探针浓度低了2～3个数量级。

对比例1

将396uL Fe₃O₄纳米粒子溶液和4uL苝衍生物探针溶液(10uM)混合，得到混合物；所述的Fe₃O₄粒子的粒径分别为30nm；苝衍生物探针的终浓度为100nM；所述的Fe₃O₄纳米粒子溶液包括20uL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)、Fe₃O₄粒子(40uL)和336uL>2O,最终体积396uL。

对比例2

将396uL SiO₂纳米粒子溶液和4uL苝衍生物探针溶液(10uM)混合，得到混合物；所述的SiO₂纳米粒子的粒径分别为30nm；苝衍生物探针的终浓度为100nM；所述的SiO₂纳米粒子粒子溶液包括20uL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)、SiO₂粒子(40uL)和336uL>2O,最终体积396uL。

图5为对比例1和2纳米粒子加入探针前后的SPR光谱(A)以及探针荧光光谱(B)，图5说明：只有诱导集聚后单体荧光的淬灭，没有明显缔合物荧光。这是因为它们在靠近缔合物发射峰位处均不具有明显的SPR峰，因此它们也无法通过金属增强效应增强其缔合物发光。至此银纳米粒子不仅仅可以诱导苝探针集聚形成缔合物，而且其集聚体可以通过金属增强效应有效增加缔合物发射强度，所以探针浓度在很低时依然有明显的缔合物荧光可观察到。