一种利用鞘氨醇单孢菌拆分丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体的方法

摘要

本发明公开了一种利用鞘氨醇单孢菌制备丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体的方法，具体拆分丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体N‑Boc‑1‑氨基‑2‑乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1‑氨基‑2‑乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐，制备(1R,2S)‑N‑Boc‑1‑氨基‑2‑乙烯基环丙烷甲酸乙酯和(1S,2R)‑1‑氨基‑2‑乙烯基环丙烷甲酸乙酯的方法。包括以下步骤：将菌种接入以N‑Boc‑1‑氨基‑2‑乙烯基环丙烷甲酸乙酯或1‑氨基‑2‑乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐为唯一碳源的培养基，筛选获得的全细胞催化底物拆分反应，制得(1R,2S)‑N‑Boc‑1‑氨基‑2‑乙烯基环丙烷甲酸乙酯和(1S,2R)‑1‑氨基‑2‑乙烯基环丙烷甲酸乙酯。

说明书

技术领域

本发明涉及利用一种鞘氨醇单孢菌拆分丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐，制备(1R,2S)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯的方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)属于黄病毒科肝病毒属，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等六种基因型，从发现至今已有20多年，在全球有超过1.7亿人被感染。HCV病毒包括结构蛋白和非结构蛋白，其中非结构蛋白NS3酶可以直接破坏宿主细胞，同时抑制对干扰素的应答，从而严重影响对其的治疗手段，目前尚无针对HCV安全有效的病毒疫苗，因此对于丙型肝炎NS3酶抑制剂类药物的研发刻不容缓。

目前已上市的丙型肝炎NS3酶抑制剂类药物如simeprevir等药物中，(1R,2S)构型乙烯基取代的环丙烷氨基酸(Vinyl-ACCA))衍生物是十分重要的活性中间体。目前获得(1R,2S)-1-氨基-2-乙烯基-环丙烷甲酸酯类衍生物的方法还十分的有限，主要是通过合成外消旋体，再寻找手性试剂进行拆分的化学方法。

Pierre L.Beaulieu等人在《Synthesis of(1R,2S)-1-Amino-2-vinylcyclopropanecarboxylic Acid Vinyl-ACCA)Aerivatives：Key Intermediates for the Preparation of Inhibitors of the Hepatitis C VirusNS3 Protease.Journal of Organic Chemistry,2005.70(15)A p.5869-5879》一文中使用A-二对甲基苯甲酰酒石酸作为手性拆分剂，进行化学拆分，室温反应16h，最终收率为40％，HPLC检测e.e值为52％。而尝试用酶法拆分，利用市售的蛋白酶Alcalase2.4L对外消旋体的1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸甲酯进行手性拆分，约980g外消旋体，加入600mL Alcalase 2.4L，37℃反应96h后，e.e值为85％，经补加同等量酶液再反应48h后，拆分e.e值达到98.7％。除此之外，目前尚未有使用微生物全细胞法进行拆分实验的报道，同时已有的酶法拆分效率较低，使用量大。

因此，本领域迫切需要筛选获得新的，能够高效拆分1-氨基-2-乙烯基-环丙烷甲酸乙酯类衍生物的微生物资源，从而为丙型肝炎NS3酶抑制剂类药物的研发提供技术支持。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是公开一种能够高效选择性拆分丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐的细菌菌种，即鞘氨醇单孢菌(Sphingomonasaquatilis JSS7)，菌种保藏号为KCTC 2881。

本发明需要解决的技术问题之二是公开一种以该全细胞拆分中间体N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐，分别制得(1R,2S)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯e.e值﹥88％，(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯e.e值﹥99％。

一种利用鞘氨醇单孢菌制备丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体的方法，具体为鞘氨醇单孢菌(Sphingomonasaquatilis JSS7)选择性拆分丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐，利用全细胞催化反应，分别制得(1R,2S)-N-Boc-1-氨基2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯，如下所示。

鞘氨醇单孢菌(Sphingomonasaquatilis JSS7)的筛选，其特征为：

富集特征为：将采集的土壤0.1g溶解于50mL土壤富集培养基中，在30℃，200rpm条件下富集培养1-2d，能观察到培养基变浑浊。(每升培养基含NH₄Cl>2PO₄.2H₂O>2HPO₄·3H₂O>4>

初筛平板培养基特征为：与富集培养基成分一致，额外每升添加琼脂20g。121℃灭菌20min后使用。

复筛培养基特征为：与富集培养基成分一致，121℃灭菌20min。接种前加入过滤除菌的中间体N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯或1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐母液浓度1g/L。

转化培养基特征为：每升含蛋白胨10g、橄榄油5g、酵母粉5g、三水合磷酸氢二钾2g、硫酸铵2g、氯化钠1g、氯化钙20mg、硫酸镁3.2mg，溶解于去离子水中，自然pH，121℃高温高压灭菌20min。

使用鞘氨醇单孢菌(Sphingomonasaquatilis JSS7)对底物N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯或1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐选择催化实验特征为：全细胞350mg与浓度为1g/l N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯或1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐混合，37℃，220rpm，反应72h，手性HPLC检测拆分活性。获得(1R,2S)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯e.e值﹥88％，(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯e.e值﹥99％。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明用于底物拆分的菌株为鞘氨醇单孢菌(Sphingomonasaquatilis JSS7)，该菌株可通过本发明公开的筛选方法筛选获得，也可以通过购买获得，菌种保藏号为KCTC2881。

该菌具有以下性质特征：

1、形态生理生化特征：

形态特征：菌落呈亮黄色，湿润，粘稠，圆形，边缘整齐，不透明。

生理生化特征：革兰氏阴性菌。

2、采用的培养基：

(1)富集培养基：

称取0.1g土壤溶解于50mL土壤富集培养基(每升含NH₄Cl>2PO₄.2H₂O>2HPO₄·3H₂O>4>

(2)初筛培养基：

将土壤富集培养液用3层滤纸过滤后，将其浓度稀释到最初的10^-9，分别取10^-8和10^-9各20uL均匀涂布于初筛培养基平板(成分同富集培养基，除此之外每升加入琼脂20g，高温高压灭菌)中，30℃恒温培养箱中培养3-4d，让其充分生长。

(3)液体复筛培养基：

将初筛平板上长出的各类不同单菌落分别挑取，接入以底物N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯或1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐为唯一碳源的液体培养基中，在30℃，200rpm条件下培养48h。

(4)种子培养基：

每升含蛋白胨10g、橄榄油5g、酵母粉5g、KH₂PO₄·3H₂O>4)₂SO₄>2>4>

3、培养条件：

培养温度：25℃-50℃，更适宜温度：30℃-37℃。

培养方式：有氧条件下进行发酵培养。

本发明利用微生物全细胞催化拆分底物N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯或1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐的方法如下：

菌种的筛选：

将采集的环境土样用富集培养基培养后，三层滤纸抽滤过滤，滤液用无菌水梯度稀释，涂布于初筛培养基平板上，恒温培养箱30℃培养4-5天，挑单菌落接液体复筛试管中复筛2天。用接种环蘸取液体复筛后的菌液，在初筛平板上划线纯化获得单菌落，接种子培养基发酵，30℃培养48h，离心获得菌体，磷酸缓冲液洗涤获得湿菌体。

将湿菌体与底物N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐分别混合，底物浓度1g/L，30℃，220rpm，反应72h，正己烷萃取反应液，HPLC检测拆分结果，筛选得到全细胞转化N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯得到(1R,2S)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯的e.e值为88.7％，筛选得到全细胞转化1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐得到(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯的e.e值高达99.6％的菌株，经16SrRNA技术测序，Ez Taxon数据库比对，与鞘氨醇单孢菌(Sphingomonasaquatilis JSS7)相似度为100％，该菌于2001年Jung-Sook Lee等人在《Sphingomonas aquatilis sp nov.,Sphingomonaskoreensis sp nov andSphingomonas taejonensis sp nov.,yellow-pigmented bacteriaisolated fromnatural mineral water.International Journal of Systematic&Evolutionary Microbiology,2001.51(3)A p.1491-8.》一文中首次发现并保存，菌种保藏号为KCTC 2881^T。因此鉴定确定筛选得到的菌株为鞘氨醇单孢菌(Sphingomonasaquatilis>

上述方法中，手性HPLC检测采用CHIRALPAK AA-H 250×4.6mm，流动相：正己烷：乙醇(50：1)。

本发明相比现有的技术的明显效果是：

1.本发明筛选获得一种高效拆分N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐的微生物Sphingomonasaquatilis JSS7，该菌株为革兰氏阴性菌，自2001年被首次分离发现之后，并未有关于该菌株应用的任何报道，本发明属于首例应用。该菌株对N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐选择拆分活性高，可应用于丙型肝炎NS3酶抑制剂类药物中间体拆分的研发。

2.对获得的微生物Sphingomonasaquatilis JSS7进行丙型肝炎NS3酶抑制剂类药物中间体拆分实验，最终制得(1R,2S)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基-环丙烷甲酸乙酯的e.e值﹥88％，(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基-环丙烷甲酸乙酯的e.e值﹥99％。

3.本发明首次利用微生物对N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐进行拆分，且拆分效果较化学拆分选择性高，更具环保型，且价格低廉；较酶法拆分，缩短了反应时间和酶的用量，更具优势。

附图说明

图1是外消旋N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯手性HPLC图谱。1号为1R,2S构型，2号为1S,2R构型。

图2是外消旋1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯手性HPLC图谱。1号为1R,2S构型，2号为1S,2R构型。

图3是按照本发明实施例1的方法，转化后的N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯手性HPLC图谱。1号为1R,2S构型，2号为1S,2R构型。

图4是按照本发明实施例1的方法，转化后的1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯手性HPLC图谱。1号为1R,2S构型，2号为1S,2R构型。

具体实施方式

菌种筛选：将从全国各地若干地方采集的环境土样富集后，过滤滤液用无菌水稀释，稀释后涂布于平板初筛培养基，30℃培养4-5天，，挑单菌落接液体复筛试管中复筛2天。用接种环蘸取液体复筛后的菌液，在初筛平板上划线纯化获得单菌落，接种子培养基发酵，30℃培养48h，离心获得菌体，磷酸缓冲液洗涤获得湿菌体。

将全细胞与底物N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐分别混合，底物浓度1g/L，30℃，磷酸缓冲液条件，220rpm，反应72h，正己烷萃取反应液，HPLC检测拆分结果，筛选得到制备(1R,2S)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯有高效选择性效果的菌株，经鉴定后属于鞘氨醇单孢菌(Sphingomonasaquatilis>

实施例1：本发明菌株全细胞拆分N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐的方法

(1)菌种选择：选用鞘氨醇单孢菌(Sphingomonasaquatilis JSS7)；

(2)种子培养：取100μL保存的菌液接种至50mL种子培养基中，在30℃，200rpm条件下培养24-48h，使菌体充分生长，能观察到培养基颜色明显浑浊。

(3)收集菌体：将菌体低温离心，弃上清液。菌体用10mL磷酸缓冲液悬浮后备用。

(4)转化实验：底物浓度仍为1g/L为宜，30℃，200rpm条件下转化72h即可完成菌体转化实验。

(5)检测：等体积正己烷萃取反应液，离心后取有机相，10μL样品进样，利用HPLC检测(1S,2R)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和(1R,2S)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯以及(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯和(1R,2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯的含量，制备(1R,2S)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯的e.e值为88.23％，(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯的e.e值为99.6％。