一种用于研究Purα蛋白对BACE1基因表达调控作用的方法

摘要

本发明主要属于基因表达调控技术领域，具体涉及一种用于研究Purα蛋白对BACE1基因表达调控作用的方法。所述方法包括三方面，第一方面为通过报道基因来确定Purα蛋白对BACE1基因启动子的活性影响，第二方面将Purα蛋白的真核表达载体转染到HT22细胞系中，通过QPCR技术在RNA转录水平上检测Purα蛋白对BACE1基因表达的影响，第三方面为通过蛋白免疫印迹法检测Purα蛋白对BACE1蛋白在翻译水平的影响。本发明提供了一种研究Purα蛋白对BACE1基因表达调控作用的方法。

说明书

技术领域

本发明主要属于基因表达调控技术领域，具体涉及一种用于研究Purα蛋白对BACE1基因表达调控作用的方法。

背景技术

阿尔茨海默氏症(Alzheimer′s disease, AD )，又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。

当前对于AD的基本病因仍未获得完全的了解，但大量的数据证实它与β-淀粉样蛋白(amyloidβ peptide，Aβ）的生成和累积导致对神经细胞的毒性损害有关。β-淀粉样蛋白是通过几种酶的活性而形成，其中一种为BACE1 基因编码的β位淀粉样前体蛋白剪切酶 (BACE1,别名Asp2 或memapsin2)，BACE1是一个具有 501 个氨基酸的跨膜天冬氨酸蛋白酶，BACE1是人体内唯一的β分泌酶。BACE1通过剪切β-淀粉样前体蛋白(β amyloidprecursor protein, APP)生成β淀粉样蛋白Aβ)，这是 Aβ生成的一个关键步骤。在阿尔茨海默病患者脑中，Aβ是淀粉样神经炎性斑块的主要成分，Aβ沉积在 AD 的发生发展中起着关键的作用。

人类Purɑ的典型特征是其能结合于人c-myc基因上游的DNA 序列。大鼠Purɑ 的序列与人的Purɑ 序列几乎相同，在所有的322 个氨基酸中仅有两个氨基酸不同。在整个进化过程中，Purα的DNA 结合区域的序列是极其保守的。Purɑ和Purβ、Purγ蛋白同属于Pur 家族。它有两种不同的异构体，使用不同的多聚腺苷酸位点。它是一种多功能蛋白，既可以与DNA 结合，也可以与RNA 结合，在转录起始，DNA 复制，DNA 修复和RNA 的转运等方面都有作用。许多研究表明Purɑ 在调控细胞周期和癌基因转化方面液发挥着重要的作用。

有研究报道发现 Purα对Rho 蛋白的发育性表达和下游信号通路有调控作用。也有报道发现缺乏Purα蛋白可改变大鼠出生后大脑的发育并引起巨脑症。此外也有研究发现Purα还与海马部位与神经可塑性相关的蛋白的代谢以及海马内树突细胞的RNA 转运有着密切的关系。由此可见，作为核转录因子的Purα在神经系统的发育过程中以及维持神经系统基因组的稳定性方面是起着极为重要的作用。

近年来，已有研究发现Purα蛋白可下调淀粉样蛋白基因启动子的活性并抑制该蛋白的表达。但目前，对于Purα蛋白对BACE1基因表达调控作用的研究并未见报道。

发明内容

本发明提供一种用于研究Purα蛋白对BACE1基因表达调控作用的方法，所述方法包括三个方面，分别为通过报道基因来确定Purα蛋白对BACE1基因启动子的活性影响、将Purα蛋白的真核表达载体转染到HT22细胞系中以在转录水平上检测Purα蛋白对BACE1基因表达的影响以及通过蛋白免疫印迹法检测Purα蛋白对BACE1蛋白在翻译水平的影响。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于研究Purα蛋白对BACE1基因表达调控作用的方法，所述方法包括三个方面，所述三个方面分别用于确定Purα蛋白对BACE1基因启动子活性的影响、对BACE1基因在转录水平的影响以及对BACE1蛋白在翻译水平的影响。

进一步地，所述三个方面，第一方面具体为通过报道基因来确定Purα蛋白对BACE1基因启动子的活性影响，第二方面具体为将Purα蛋白的真核表达载体转染到HT22细胞系中以在转录水平上检测Purα蛋白对BACE1基因在转录水平的影响，第三方面具体为通过蛋白免疫印迹法检测Purα蛋白对BACE1蛋白在翻译水平的影响。

进一步地，在所述第一方面中，通过电泳迁移率实验和染色质免疫共沉淀实验确定Purα蛋白在BACE1启动子上的结合位点。

进一步地，所述第一方面具体为：将质粒BACE1基因启动子与Purα真核表达质粒共转染HT22细胞系，收集蛋白，通过荧光素酶检测方法来检测Purα蛋白对BACE1基因启动子的活性影响。

进一步地，所述第二方面具体为：将Purα蛋白真核表达载体Pura转染到HT22细胞系中，收获细胞，提取细胞总RNA，通实时定量PCR在转录水平上检测Purα蛋白对BACE1基因表达的影响；同时使用Purα沉默细胞系，以研究在Purα蛋白在沉默的情况下，BACE1基因的表达情况以从反面来确认Purα蛋白对BACE1基因表达的影响。

进一步地，所述第三方面具体为：将Purα蛋白真核表达载体Pura转染到HT22细胞系中，感染36-48小时收获蛋白，通过蛋白免疫印迹法检测Purα蛋白对BACE1蛋白在翻译水平的影响。

本发明的有益技术效果：

本发明提供一种用于研究Purα蛋白对BACE1基因表达调控作用的方法，BACE1 是体内主要的β分泌酶, 是Aβ产生过程中的限速酶。对BACE1的抑制可以有效降低体内Aβ的水平。因此BACE1 作为治疗老年性痴呆的药物靶点,为研究AD治疗提供新的理论基础。

附图说明

图1 Luciferase实验来验证Purα与BACE1启动子的调控结果柱状图；

图2 Q-PCR检测Control组、PuraKD组、以及PuraO/E组中BACE1的表达量（其中，Control组为对照组，PuraKD组为Purα蛋白沉默组；PuraO/E组为Purα蛋白过表达组）；

图3为Q-PCR检测Control组、PuraKD组、以及PuraO/E组中Purα表达量（其中，Control组为对照组，PuraKD组为Purα蛋白沉默组；PuraO/E组为Purα蛋白过表达组）；

图4为Western-blot检测Control组、PuraKD组、以及PuraO/E组中Purα表达量（其中，Control组为对照组，PuraKD组为Purα蛋白沉默组；PuraO/E组为Purα蛋白过表达组）；

图5为Western-blot检测Control组、PuraKD组、以及PuraO/E组中BACE1表达量（其中，Control组为对照组，PuraKD组为Purα蛋白沉默组；PuraO/E组为Purα蛋白过表达组）；

图6为Western-blot检测电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

实施例1

一种用于研究Purα蛋白对BACE1基因表达调控作用的方法，所述方法包括三个方面，所述三个方面分别用于确定Purα蛋白对BACE1基因启动子活性的影响、对BACE1基因表达的影响以及对BACE1蛋白在翻译水平的影响。

所述三个方面，第一方面具体为通过报道基因来确定Purα蛋白对BACE1基因启动子的活性影响，第二方面具体为将Purα蛋白的真核表达载体转染到HT22细胞系中以在转录水平上检测Purα蛋白对BACE1基因表达的影响，第三方面具体为通过蛋白免疫印迹法检测Purα蛋白对BACE1蛋白在翻译水平的影响。

BACE1启动子的5端非编码区，有多个富含GC的区域，这个区域有可能就是Purα蛋白的结合位点，所以我们根据序列分析的结果，在所述第一方面中，通过电泳迁移率实验（EMSA）和ChIP’s Assay（染色质免疫共沉淀）实验确定Purα蛋白在BACE1启动子上的结合位点。

所述第一方面具体为：通过荧光素酶检测（Luciferase Assay）方法来检测Purα蛋白对BACE1基因启动子的活性影响：将质粒BACE1基因启动子与Purα真核表达质粒共转染HT22细胞系，收集蛋白，使用Invitrogen 的Lipofectinamine 2000做为转染试剂，转染后36-48小时收获细胞，用Promega公司出品的Luciferase 底物进行萤火虫荧光素酶活性测定。以此来检测Purα对BACE1启动子的调控作用。实验结果如图1所示，通过图1可看出：在实验组Purα对BACE1基因表达有下调作用。

所述第二方面具体为：将Purα蛋白真核表达载体Purα空载体以及沉默的质粒转染到HT22细胞系中, 感染36-48小时收获细胞提取细胞总RNA，实时定量PCR（Q-PCR）在转录水平上检测Purα蛋白对BACE1基因表达的影响；同时使用Purα的Knock Down细胞系，以研究在Purα蛋白Knock down的情况下，BACE1基因的表达情况以从反面来确认Purα蛋白对BACE1基因表达的影响。Control组为对照组，PuraKD组为Purα蛋白沉默组，PuraO/E组为Purα蛋白过表达组，分别在control、PuraKD、PuraO/E三组中检测BACE1和Purɑ的表达量检测。如图2结果表明：在Purα沉默组中，BACE1的表达量最高，而在Purα过表达组中， BACE1的表达水平最低，从而可以得出，Purα对BACE1基因在转录水平上具有下调作用。图3结果表明：在Purα沉默组中，Purα的表达量最低，而在Purα过表达组中， Purα的表达水平最高，说明构建的模型成功。

在Pura沉默组中具有下调BACE1的趋势，在BACE1沉默组中有上调BACE1的趋势，在Pura沉默组中具有下调BACE1的趋势。由此说明Pura蛋白对BACE1基因表达有下调作用。由此说明Pura蛋白对BACE1基因表达有下调作用。

所述第三方面具体为：将构建好的Purα蛋白真核表达载体Purα蛋白空载及沉默的质粒转染到HT22细胞系中，感染36-48小时收获蛋白，通过蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测Purα蛋白对BACE1蛋白在翻译水平的影响。

图6所示，用Western-blot检测BACE1和Purɑ的蛋白表达量，分别在control、PuraKD、PuraO/E三组中检测。如图4所示：在Purα沉默组中，Purα的表达量最低，而在Purα过表达组中， Purα的表达水平最高，说明构建的模型成功。图5结果表明：在Purα沉默组中，BACE1的表达量最高，而在Purα过表达组中， BACE1的表达水平最低，从而可以得出，Purα对BACE1基因在翻译水平上具有下调作用。

在Pura沉默组中具有下调BACE1的趋势，在BACE1沉默组中有上调BACE1的趋势。由此说明Pura蛋白对BACE1基因表达有下调作用。

Purα通过各种不同的途径应答细胞外复杂多样的信号，从而发挥对其靶基因的调控作用。随着进一步阐明Purα对BACE1基因表达调控的研究，明确其精细调控机理，Purα很有希望成为一个新的基因治疗靶点，并且为AD治疗提供新的理论基础和思路。

并且本发明首次提出了Pur alpha对BACE1基因表达调控的作用，探讨了Pur alpha对BACE1基因的作用机制。