一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株及其在小白鼠皮下脓肿动物模型中的应用

摘要

本发明提供一株生长表型稳定的黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)小菌落突变株YN151116，菌株保藏号是：CCTCC NO：M 2016115，该菌株生长表型稳定：在培养基中补充硫胺素或胸腺嘧啶或在二氧化碳培养条件下均不能促进其生长，菌落大小不增加；在培养基中补充甲萘醌则抑制其生长；小菌落生长表型特征稳定，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该金黄色葡萄球菌小菌落突变株可以为研究人和哺乳动物持续性及复发性感染提供生长表型稳定的菌株材料。本发明还利用该金黄色葡萄球菌小菌落突变株建立小白鼠皮下脓肿动物模型，该模型重复性高、稳定性好，为皮下脓肿的发病机理研究、治疗方法、和药物筛选提供动物模型，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属微生物技术领域，涉及一株生长表型稳定的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)小菌落突变株YN151116，及一种应用该菌株建立稳定的小白鼠皮下脓肿动物模型的方法。该菌株保藏号是CCTCC NO：M 2016115，该菌种于2016年3月14日在武汉中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2016115。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种引起人和多种哺乳动物感染的重要病原体，其新亚群——金黄色葡萄球菌小菌落突变株(Small colony variants，简称SCVs)具有独特生长和生化表型及致病特征，较野生株更易在哺乳动物细胞内存活，可能引起持续性及复发性感染，甚至可能导致严重感染，严重威胁人和多种哺乳动物的健康。

由于目前现有金黄色葡萄球菌小菌落突变株生长表型不稳定，表现为在培养基中补充甲萘醌、硫胺素、胸腺嘧啶、血红素或在二氧化碳培养条件下，其菌落直径均增大，均能恢复野生型生长表型，缺乏稳定的生长表型菌株。因此，提供生长表型稳定的金黄色葡萄球菌小菌落突变株对研究其持续感染的致病机理提供菌株材料。

另外，皮下脓肿是一种人类和多种哺乳动物金黄色葡萄球菌感染引起的主要疾病。近年来，其发病率和严重程度逐渐增加，因此，亟待深入开展皮下脓肿的预防和控制研究。目前虽有小白鼠皮下脓肿动物模型用于该病的研究，但这些建立动物模型的方法成功率低下，并且建立的动物模型不稳定，脓肿仅能持续数天就自然消失，缺乏一种稳定的皮下脓肿动物模型，在一定程度上阻碍了该疾病的深入研究。因此，提供一种重复性、稳定性好的小白鼠皮下脓肿动物模型为该病的发病机理研究、治疗方法和药物筛选奠定基础。

发明内容

针对目前葡萄球菌引起的人和多种哺乳动物续性及复发性感染，甚至严重感染疾病，急需生长表型稳定的金黄色葡萄球菌小菌落突变株用于其致病机理研究的问题，以及针对人和多种哺乳动物皮下脓肿疾病预防和控制研究急需一种重复性、稳定性好的动物模型的问题，本发明旨在提供一株具有稳定生长表型的金黄色葡萄球菌小菌落突变株以及一种重复性、稳定性好、易操作、成本低的小白鼠皮下脓肿动物模型的构建方法。

本发明提供的金黄色葡萄球菌小菌落突变株YN151116，于2016年3月14日，保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2016115。

本发明提供的金黄色葡萄球菌小菌落突变株YN151116具有以下特征：

(1)菌落特征：在普通营养琼脂平板上形成乳黄色、表明光滑凸起，边缘整齐的细小菌落，其直径约为0.1mm，连续传代培养8次后菌落特征不改变。

(2)细菌形态特征：细菌革兰氏染色呈阳性，球形，多个菌体聚集在一起呈典型的葡萄串状。

(3)生理生化特征：该菌株分解葡萄糖和甘露糖，不分解乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、棉籽糖、山梨糖、鼠李糖、阿拉伯糖、肌醇、甘露醇、卫矛醇；枸橼酸盐利用试验阴性；鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验阴性；精氨酸脱羧酶试验阳性；VP试验(维培试验)、MR试验(甲基红试验)、靛基质试验、硝酸盐还原试验阴性；氧化酶试验、过氧化氢酶试验阴性。

(4)培养特性：普通营养琼脂平板上培养24小时，生长贫瘠，菌落细小，直径为0.1mm；连续传代培养8次后菌落大小稳定。在培养基中补充硫胺素或胸腺嘧啶不能促进其生长，菌落大小不增加；在培养基中补充甲萘醌则抑制其生长；在二氧化碳培养条件下也不能促进其生长，菌落大小也不增加，是一株生长表型稳定的金黄色葡萄球菌小菌落突变株。而以前发现的金黄色葡萄球菌小菌落突变株生长表型不稳定，在培养基中补充硫胺素、胸腺嘧啶、甲萘醌等营养物质或在二氧化碳培养条件下，菌落大小增加，能恢复其野生型菌株生长表型。

(5)16S rDNA序列特征如SEQ ID NO.1，其与GenBank数据库中的100株金黄色葡萄球菌16S rDNA核苷酸序列同源性高达99％。

金黄色葡萄球菌小菌落突变株YN151116的革兰氏染色菌体形态特征以及其16S rDNA核苷酸序列特征与金黄色葡萄球菌相符合，鉴定为金黄色葡萄球菌，又由于其在普通琼脂平板上菌落细小，连续传代培养8次后菌落大小稳定，鉴定为金黄色葡萄球菌小菌落突变株。

本发明的另一个目的是提供一种利用该金黄色葡萄球菌小菌落突变株YN151116建立小白鼠皮下脓肿动物模型的方法。

利用金黄色葡萄球菌小菌落突变株建立小白鼠皮下脓肿动物模型的方法，包括以下步骤：(1)菌种复苏：取冻存菌种划线接种于普通营养琼脂平板培养基，置普通恒温培养箱，37℃培养24h；

(2)菌悬液制备：挑取上述营养琼脂平板上的单菌落划线接种于新的营养琼脂平板培养基，置普通恒温培养箱，37℃培养24h；然后用灭菌生理盐水将菌落洗脱下来，用稀释平板计数法计算菌液浓度，再用灭菌生理盐水调整其菌浓度为1.0～2.0×10⁷CFU/mL，4℃保藏备用。

(3)接种动物：选取18～22g昆明小白鼠，用酒精棉球消毒后大腿内侧皮肤，用注射器将0.2mL上述菌悬液注入一只后大腿内侧皮下，另一只后大腿内侧皮下注射等量灭菌生理盐水作对照，注射完成后将小白鼠放回笼中继续饲养。

(4)动物模型：接种后第12天观察小白鼠，菌悬液接种的一只大腿内侧出现乳白色黄豆大小肿块，触摸可游动，有波动感；而对照一侧无异常变化，即为皮下脓肿动物模型。用该方法可使100％小白鼠出现皮下脓肿，且该脓肿可持续存在2个月以上。

根据以上方法构建的小白鼠皮下脓肿动物模型在人和哺乳动物皮下脓肿的发病机理研究、治疗方法和药物筛选方面的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供一株分离自山羊皮下脓肿的浓汁中的生长表型稳定的金黄色葡萄球菌小菌落突变株，其生长表型稳定表现在：在培养基中补充硫胺素或胸腺嘧啶不能促进其生长，菌落直径为0.1mm，大小不增加；在培养基中补充甲萘醌则抑制其生长；在二氧化碳培养条件下也不能促进其生长，菌落直径为0.1mm，大小也不增加。该金黄色葡萄球菌小菌落突变株YN151116，为金黄色葡萄球菌小菌落突变株的致病机理研究提供生长表型稳定的菌株材料。

(2)本发明还提供一种建立小白鼠皮下脓肿动物模型的方法：应用该菌株对昆明小白鼠后大腿内侧皮下注射，可使小白鼠100％出现皮下脓肿动物模型，该动物模型重复性、稳定性好、易操作、成本低。

(3)该动物模型对研究皮下脓肿的发病机理研究、治疗方法和药物筛选提供动物模型，具有广阔的应用前景。

微生物保藏情况说明

名称：金黄色葡萄球菌小菌落突变株(Staphylococcus aureus)，YN151116；

菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2016115。

保藏单位：武汉中国典型培养物保藏中心；

保藏时间：2016年3月14日。

附图说明

图1为金黄色葡萄球菌小菌落突变株YN151116菌落特征；其中左半部分为金黄色葡萄球菌小菌落突变株YN151116菌落图，右半部分为野生型金黄色葡萄球菌菌落图；

图2为二氧化碳培养对YN151116菌落大小的影响比较图，其中左图二氧化碳培养条件下的菌落图，右图为普通条件培养下的菌落图；

图3为硫胺素对YN151116菌落大小的影响比较图，其中左图为含0.1mg/mL硫胺素的营养琼脂平板上的菌落图，右图为营养琼脂平板上的菌落图；

图4为胸腺嘧啶对YN151116菌落大小的影响比较图，其中左图为含0.001mg/mL胸腺嘧啶的营养琼脂平板上的菌落图，右图为营养琼脂平板上的菌落图；

图5为甲萘醌对YN151116菌落大小的影响比较图，其中左图为含0.001mg/mL甲萘醌的营养琼脂平板上的菌落，右图为营养琼脂平板上的菌落；

图6为小白鼠皮下脓肿动物模型，其中左后大腿内侧皮下有黄豆大小脓肿，右后大腿内侧皮下无异常变化。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实验所用主要试剂：

营养琼脂培养基和格兰死细菌染色液购自北京奥博星生物技术有限公司；细菌微量生化鉴定管购自杭州滨和微生物试剂有限公司；胸腺嘧啶、硫胺素、甲萘醌均购自Sigma公司。

实施例1：金黄色小菌落突变株的培养及表型特征

金黄色葡萄球菌小菌落突变株YN151116分离自山羊皮下脓肿的浓汁，将浓汁接种普通营养琼脂平板培养基，37℃需氧培养24h；再挑取上述营养琼脂平板上的单个细小菌落划线接种于一个新的营养琼脂平板培养基，37℃需氧培养24h，肉眼观察可见菌落特征如下：菌落呈乳黄色细小菌落，直径为0.1mm，表面光滑凸起，边缘整齐。按上述方法将YN151116在普通营养琼脂平板上连续传代培养7代，每次传代培养菌落直径0.1mm保持不变。取第七代培养物涂布接种于一个营养琼脂平板培养基的左半部分，再取普通野生型金黄色葡萄球菌涂布接种于该营养琼脂平板的右半部分，置普通恒温培养箱，37℃需氧培养24h，菌落直径0.1mm，其直径约为普通野生型金黄色葡萄球菌的1/20(见图1)。

取上述营养琼脂平板上的菌落，涂布于载玻片，进行革兰氏染色，用普通光学显微镜观察细菌形态特征如下：细菌革兰氏染色呈阳性，球形，多个菌体聚集在一起呈典型的葡萄串状。

将上述营养琼脂平板上的菌落用灭菌生理盐水洗脱下来制成菌悬液，用接种棒将菌悬液接种细菌微量生化鉴定管，置普通恒温培养箱37℃培养72h，可观察得到细菌生理生化特征如下：该菌株分解葡萄糖和甘露糖，不分解乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、棉籽糖、山梨糖、鼠李糖、阿拉伯糖、肌醇、甘露醇、卫矛醇；枸橼酸盐利用试验阴性；鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验阴性；精氨酸脱羧酶试验阳性；VP试验(维培试验)、MR试验(甲基红试验)、靛基质试验、硝酸盐还原试验阴性；将菌落蘸于氧化酶试纸上可见氧化酶试验阴性、将双氧水滴加在菌落上可见过氧化氢酶试验阴性。

生长表型稳定性检测：检测前先准备菌悬液，其具体步骤如下，先取50μL保藏的菌种涂布接种1个营养琼脂平板培养基，置普通恒温培养箱37℃培养24h，用1mL灭菌生理盐水将菌落洗脱下来，取10μL加入到1mL灭菌生理盐水中制成稀释的菌悬液用于以下试验。(1)取上述稀释的菌悬液涂布接种两块营养琼脂平板培养基，每块平板接种100μL，一块置普通恒温培养箱，另一块置二氧化碳培养箱(5％二氧化碳)，37℃培养24h，两者菌落直径均约0.1mm，无显著差异(见图2)。(2)取上述稀释的菌悬液涂布接种一块含0.1mg/mL硫胺素的营养琼脂平板培养基和普通营养琼脂平板，每块平板接种100μL，置普通恒温培养箱，37℃培养24h，两者菌落直径均约0.1mm，无显著差异(见图3)。所述的0.1mg/mL硫胺素的营养琼脂平板培养基的制备方法是100mL普通营养琼脂培养基121℃高压灭菌15分钟，待温度降至约55℃时加入10mg硫胺素，充分混匀后倾注于培养皿即得。(3)取上述稀释的菌悬液涂布接种一块含0.001mg/mL胸腺嘧啶的营养琼脂平板和普通营养琼脂平板，每块平板接种100μL，置普通恒温培养箱，37℃培养24h，两者菌落直径均约0.1mm，无显著差异(见图4)。所述的0.001mg/mL胸腺嘧啶的营养琼脂平板的制备方法是在100mL普通营养琼脂培养基中加入0.1mg胸腺嘧啶，121℃高压灭菌15分钟，充分混匀后倾注于培养皿即得。(4)取上述稀释的菌悬液涂布接种一块含0.001mg/mL甲萘醌的营养琼脂平板和普通营养琼脂平板，每块平板接种100μL，置普通恒温培养箱，37℃培养24h，含甲萘醌的营养琼脂平板无菌生长，普通营养琼脂平板呈细小菌落，其直径为0.1mm(见图5)。所述的0.001mg/mL甲萘醌的营养琼脂平板的制备方法是100mL普通营养琼脂培养基121℃高压灭菌15分钟，待温度降至约55℃时加入0.1mg甲萘醌，充分混匀后倾注于培养皿即得。

实施例2：金黄色葡萄球菌小菌落突变株的基因型特征

将保存的菌种接种于普通营养琼脂培养基，37℃需氧培养24h；用灭菌生理盐水将菌落洗脱下来装入离心管，5000转/分钟离心5分钟，弃上清，沉淀用TE缓冲液重悬，水浴煮沸10分钟，12000转/分钟离心5分钟，取上清作为PCR反应模板。用上游引物16S-27F(A)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和下游引物16S-1492R(T)：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3作为PCR反应引物。反应体系(50μL)：ddH2O 38μL、10×Taq buffer 5μL、10mM dNTPs 2μL、25mM上下游引物各1μL、5U/μL Taq DNA polymerase 1μL、模板2μL。反应条件为94℃3min；94℃30S，57℃30S，72℃90S，35个循环；72℃5min，4℃保存。PCR反应产物经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，可得16S rDNA核苷酸序列长度为1513bp，其核苷酸序列特征如SEQ ID NO.1所示。

用GenBank中的BLAST工具对上述16S rDNA核苷酸序列进行同源性比对分析，结果显示，其与GenBank数据库中的100株金黄色葡萄球菌16S rDNA核苷酸序列同源性高达99％，再根据其上述革兰氏染色菌体形态特征，将分离株YN151116鉴定为金黄色葡萄球菌，又由于其在普通琼脂平板上菌落细小，直径为0.1mm，生长表型稳定，鉴定为金黄色葡萄球菌小菌落突变株。

实施例3：小白鼠皮下脓肿动物模型的建立

(1)菌种复苏：取以上冻存菌种划线接种1个普通营养琼脂平板培养基，置普通恒温培养箱，37℃培养24h；

(2)菌悬液制备：①挑取上述营养琼脂平板上的单菌落划线接种于1个营养琼脂平板培养基，置普通恒温培养箱，37℃培养24h；然后用1mL灭菌生理盐水将菌落洗脱下来，装于1个2mL灭菌离心管制成菌悬液保存液。②稀释平板计数法测定菌悬液保存液浓度：取5支离心管，分别编号为1～5号离心管，各装入900μL灭菌生理盐水。取100μL上述菌液保存液加入到第1支离心管，混匀后取100μL加入到第2支离心管，混匀后取100μL加入到第3支离心管，依次将菌悬液保存液作10倍序列稀释至第5支离心管即得菌悬液稀释液；取第5支离心管中的菌悬液稀释液涂布营养琼脂平板，每个平板涂布100μL，共涂布3个营养琼脂平板。置普通恒温培养箱，37℃培养24h，计算3个平板上菌落平均数为800，计算可得原菌悬液保存液的浓度为8×10⁷CFU/mL；取菌液保存液500μL于小三角烧瓶，加入3500μL灭菌生理盐水即得1×10⁷CFU/mL的菌悬液工作液。

(3)接种动物：选取18～22g昆明小白鼠10只，用酒精棉球消毒后大腿内侧皮肤，每只小白鼠左后大腿内侧注射0.2mL菌悬液工作液，右后大腿内侧皮下注射0.2mL灭菌生理盐水作对照，接种完成后将小白鼠放回笼中继续饲养。

(4)实验动物观察：接种后第12天观察小白鼠，10只小白鼠均在左后腿内侧皮下均出现乳白色黄豆大小肿块，触摸肿块可游动，有波动感；右侧则无肿块出现；继续观察60天，左后腿内侧肿块不消退。剖解可见左后腿内测皮下有黄豆大小肿块，切开有乳白色膏状浓汁，右后腿内测皮下无异常变，10只鼠均成功建立皮下脓肿动物模型(见图6)，模型成功率为100％，该方法重复性高、稳定性好。

用上述方法构建的小白鼠皮下脓肿动物模型在人和哺乳动物皮下脓肿的发病机制研究、治疗方法和药物筛选方面有较大的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120>

一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株及其在小白鼠皮下脓肿动物模型中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1513

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

agagtttgat catggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatgcaagtcgagc 60

gaacggacga gaagcttgct tctctgatgt tagtggcgga cgggtgagtaacacgtggat 120

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