梵天花组织培养与快速繁殖的方法

摘要

本发明属于植物培养技术领域，涉及一种梵天花组织培养与快速繁殖的方法。包括梵天花的消毒、腋芽萌发不定芽的诱导、丛生芽的诱导、不定芽的增殖、再生植株的生根培养、炼苗移栽的步骤。本发明能够不受地桃花种子数量、萌发率和气候限制而快速地获得与母株相同性状的地桃花植株，利于产业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于植物培养技术领域，涉及一种梵天花组织培养与快速繁殖的方法。

背景技术

梵天花(Urena procumbens Linn.)为锦葵科(Malvaceae)梵天花属(Urena)落叶小灌木，产广东、台湾、福建、广西、江西、湖南、浙江等省区。常生于山坡小灌丛中。其全草入药名为梵天花《福建民间草药》，异名三角枫、三合枫《植物名实图录》、香港野棉花、犬跤迹、野茄、破布勒、假肉花、虱麻头《福建民间草药》、五龙会、粘花衣、假棉花《闽东本草》、地棉花、八大锤、千下槌《江西草药》、小桃花(广州部队《常用中草药手册》)、小痴头婆、铁包金、乌云盖雪《广西草药》、野棉花、山棉花、棉花肾、红野棉花、小号山棉皮、野木棉《浙江民间常用草药》、拦路虎《福建药物志》、狗脚迹《广西药用植物名录》。其性凉，味甘、苦，具祛风利湿和清热解毒之功效，主治风湿痹痛、泄泻、痢疾、感冒、咽喉肿痛、肺热咳嗽、风毒流注、疮疡肿毒、跌打损伤和毒蛇咬伤等症；其根入药名为梵天花根《福建民间草药》，性平，味甘、苦，具健脾化湿和活血解毒之功效，主治风湿痹痛、劳倦乏力、肝炎、疟疾、水肿、白带、跌打损伤和痈疽肿毒等症。在我国，梵天花属植物有3种5变种，尚未见有组织培养的研究报道。

在我国，目前地桃花主要靠种子繁殖，受制于种子数量、萌发率和气候限制，不能得到快速繁殖。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种梵天花组织培养与快速繁殖的方法。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种梵天花组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)梵天花的消毒

剪取当年抽出的、带叶的梵天花茎段，刷洗后减去叶片，留若干叶柄，置于洗洁精溶液中搅拌后用流水冲洗0.5h以上，在无菌环境下依次转入到70％的酒精溶液和0.1％HgCl₂溶液内浸泡消毒，即为消毒完成的茎段外植体，取出放入已灭菌的湿滤纸上待接种；

(2)腋芽萌发不定芽的诱导

用消毒后的刀具将上一步获得的茎段外植体两端各切除少量茎段，以正常的极性方向接种到添加有6-BA 0-5mg/L，IBA 0-1.0mg/L，AC 1.0g/L的1/2MS基本培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/m²·s，得腋芽萌发的不定芽；

(3)丛生芽的诱导

将上一步得到的腋芽萌发的不定芽切成带一叶的茎段，以正常的极性方向接种到添加有ZT 0-1.0mg/L，6-BA 0-5.0mg/L，IBA 0-1.0mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/m²·s，得不定芽丛；

(4)不定芽的增殖

将上一步诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有6-BA 0-5.0mg/L，IBA 0-1.0 mg/L，CH 0.25g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/m²·s；

(5)再生植株的生根培养

切取叶片嫩绿且2-3cm高的不定芽，插入到添加IBA 0-1.0mg/L，AC 0.5-1.0g/L的1/8-1/4MS基本培养基的生根培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m²·s)，得生根的组培苗；

(6)炼苗移栽

待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过3cm时，将组培苗定植于高压湿热灭菌过的珍珠岩、泥炭重量比为1：1-9的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃之间；3d后，揭开薄膜一角，让内外空气相通，适应1d后将薄膜全部揭开，于叶面喷雾以保持湿润，待新叶长出后移栽大田中继续种植。

在上述的梵天花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(1)中，所述的无菌环境为经紫外线消毒30min以上并开启无菌风的超净工作台，茎段转入70％的酒精溶液中浸泡40s，取出用无菌水冲洗3次，再浸入滴加有吐温-80和1mol/L NaOH溶液的0.1％HgCl₂溶液内浸泡消毒9-10min，然后用无菌水充分浸洗3次。

在上述的梵天花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(2)中，所述的刀具为经过高温灼烧消毒的解剖刀，培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30.0g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min；

在上述的梵天花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(3)中，培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min；

在上述的梵天花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(4)中，培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min；

在上述的梵天花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(5)中，生根培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/8-1/4，微量元素、铁盐、有机物质等含量均为MS基本培养基的1/4-1/2，而肌醇添加量为0mg/L，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min。

在上述的梵天花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(6)中，组培苗从组培瓶中取出的方法为：松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水，以防止培养基干裂、组培苗失水，盖住瓶盖，12h后半挪开瓶盖，再过12h，移走瓶盖，让灯光直照组培苗培养2d；然后将培养基捣碎，夹出组培苗，用流水将残留的琼脂冲洗干净。

在上述的梵天花组织培养与快速繁殖的方法中，步骤(2)中的1/2MS基本培养基中添加了6-BA 2.0mg/L，IBA 0.2mg/L，AC 1.0g/L，步骤(3)中的1/2MS基本培养基中添加了ZT 0.2mg/L，6-BA 2.0mg/L，IBA 0.5mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L，步骤(4)中的1/2MS基本培养基中添加了6-BA 1.0mg/L，IBA 0.5mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L。

在上述的梵天花组织培养与快速繁殖的方法中，步骤(5)中的1/4MS基本培养基中添加了IBA 0.2mg/L，AC 0.5-1.0g/L。

在上述的梵天花组织培养与快速繁殖的方法中，步骤(6)的混合基质中珍珠岩与泥炭的重量比为1：4，且所用基质均经高压湿热消毒。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：能够不受种子数量、萌发率和气候限制而快速地获得与母株相同性状的梵天花植株，利于产业化生产。

具体实施方式

下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量数据，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

本实施例提供一种梵天花组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)梵天花的消毒

剪取当年抽出的、带叶的茎段，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，剪去叶片，仅留少量叶柄，放入添加少量洗洁精的容器内搅拌浸泡2-4min，倒去洗洁精溶液，于流水冲洗0.5h后，转入已经紫外消毒30min以上的超净台中，将茎段转入70％的酒精溶液中浸泡40s，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有1滴吐温-80和1滴1mol/L NaOH溶液的0.1％HgCl2溶液内浸泡消毒11-12min，然后用无菌水充分浸洗3次，即为消毒完成的茎段外植体，放入已高温高压灭菌的湿滤纸上待接种；

(2)腋芽萌发不定芽的诱导

将上一步获得的茎段外植体在无菌湿滤纸上用灼烧冷却的解剖刀切去少量的消毒液接触的两端，以正常的极性方向接种到添 加有6-BA 2.0mg/L，IBA 0.2mg/L，AC 1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30.0g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)，25d后统计发现，腋芽不定芽的诱导率达94.7％，生长正常；14h光/10h暗是指每天光照14h，黑暗中培养10h，交替进行，以下同；

(3)丛生芽的诱导

将上一步得到的腋芽萌发的不定芽切成带一叶的茎段，以正常的极性方向接种到添加有ZT 0.2mg/L，6-BA 2.0mg/L，IBA 0.5mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d后统计发现，丛生芽的诱导率为95.2％，诱导出的不定芽数平均为5.8个，茎和叶色正常。

(4)不定芽的增殖

将上一步诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有6-BA 1.0mg/L，IBA 0.5mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该增殖培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗 糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d后统计发现，不定芽的增殖倍数为5.2倍，且生长速度快，叶色绿。

(4)再生植株的生根培养

切取叶片嫩绿、生长旺盛且2～3cm高的不定芽，插入到添加IBA 0.2mg/L，AC 0.5-1.0g/L的1/4MS基本培养基中，该生根培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/4，微量元素、铁盐、有机物质等含量均为MS基本培养基的1/2，而肌醇添加量为0mg/L，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d后统计发现，无根组培苗的生根率达98.2％，根粗和根长适中，发根数3.6根。

(5)炼苗移栽

待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过3cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水，以防止培养基干裂、组培苗失水，但先不移开瓶盖，12h后半挪开瓶盖，再过12h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2d；然后小心地将培养基捣碎，夹出再生植株，用流水将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于高压湿热灭菌过的珍珠岩、泥炭重量比为1：4的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃之间，培养室采光良好；3d后，揭开薄膜一角，让内外空气相通，适应1d后将薄膜全部揭开，于叶面喷雾以保持湿润。15d后统计后发现，炼苗成活率达95.6％。

文中涉及的缩略词：

AC 活性炭

6-BA 6-苄氨基腺嘌呤

CH 水解酪蛋白

IBA 吲哚丁酸

ZT 玉米素

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于步骤(2)：将步骤(1)获得的茎段外植体在无菌湿滤纸上用灼烧冷却的解剖刀切去少量的消毒液接触的两端，以正常的极性方向接种到添加有6-BA 0-5mg/L，IBA 0-1.0mg/L，AC 1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30.0g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d统计后发现，随着BA浓度的提高，不定芽诱导率随之提高，说明6-BA诱导了不定芽的萌发，但高浓度的6-BA会诱导玻璃化现象的发生；随着IBA浓度的升高，不定芽的生长加快，但较高的IBA浓度会促进玻璃化的发生和发展；AC所起的作用为吸附外植体褐化产生的物质，在较低浓度时确实起了良好的作用，但是较高的浓度却会起吸附培养基营养的作用，不利于外植体的生长；从表1来看，添加6-BA 2.0mg/L，IBA 0.2mg/L，AC 1.0g/L的1/2MS基本培养基的不定芽诱导率虽然不是最高的，但是综合不定芽的生长来看却是最好的，其不定芽的诱导率为94.7％，不定芽的生长也表现佳。

表1不同处理对腋芽不定芽诱导的影响

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于步骤(3)：丛生牙的诱导：将步骤(2)得到的腋芽萌发的不定芽切成带一叶的茎段，以正常的极性方向接种到添加有ZT 0-1.0mg/L，6-BA 0-5mg/L，IBA0-1.0mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；培养25d后统计发现，随着ZT和6-BA含量的升高，丛生芽诱导不断提高，不定芽数也随之提高，而且两者表现出的是协同促进作用，但ZT和6-BA浓度过高容易导致不定芽的水渍化倾向，两者结合会使玻璃化更加明显；IBA的作用在于促进不定芽的生长，但同样高浓度的IBA对不定芽的生长也是不利的，植物生长变快，导致茎变细弱，会加重或诱导玻璃化苗的形成。综合来看，以添加有ZT 0.2mg/L，6-BA 2.0mg/L，IBA 0.2mg/L的1/2MS基本培养基的表现最佳，其丛生芽的诱导率为95.2％，不定芽数为5.8，生长快速且叶色正常。

表2不同处理对丛生芽诱导的影响

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于步骤(4)不定芽的增殖：将步骤(3)诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有6-BA 0-5.0mg/L，IBA 0-0.5mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该增殖培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；培养25d后统计发现，不定芽的增殖应适当降低6-BA的浓度而提高IBA的浓度，从表4可以看出添加有6-BA 1.0mg/L，IBA 0.5mg/L的1/2MS基本培养基中的不定芽增殖效果最好，增殖倍数为5.2，且不定芽生长快，叶色正常。高浓度的6-BA会导致不定芽的玻璃化现象，不利于接下来的生根培养。

表4不同处理对不定芽增殖的影响

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于步骤(5)再生植株的生根培养：切取叶片嫩绿、生长旺盛且2～3cm高的不定芽，插入到添加IBA 0-1.0mg/L，AC 0.5-1.0g/L的1/8-1/4MS基本培养基中，该生根培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/8-1/4，微量元素、铁盐、有机物质等含量均为MS基本培养基的1/4-1/2，而肌醇添加量为0mg/L，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d统计发现，在一定浓度下，随着MS浓度的降低、IBA浓度的升高生根率会随之升高，MS浓度的降低或IBA浓度的降低会使根变细变长，地上部叶色会变差，但是在较高浓度MS或IBA处理时，会带来地上部生长的变差，甚至可能会发生玻璃化的现象。这是因为生根过程其实是一个从异养到自养过程转变的过程，故处理时往往会降低外界环境的营养，外界的高营养反而不利于不定芽的生根。综合生根率、地上部和根的生长情况来看，表4列出的含IBA 0.2mg/L的1/4MS基本培养基表现最好，生根率达98.2％，地上部和根生长 良好。

表4不同培养基对生根的影响

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于步骤(6)炼苗移栽：待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过3cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水，以防止培养基干裂、组培苗失水，但先不移开瓶盖，12h后半挪开瓶盖，再过12h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2d；然后小心地将培养基捣碎，夹出再生植株，用流水将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于高压湿热灭菌过的珍珠岩、泥炭重量比为1：3-4的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃之间；3d后，揭开薄膜一角，让内外空气相通，适应1d后将薄膜全部揭开，于叶面喷雾以保持湿润。25d后统计后发现，炼苗成活率为95.6％，泥炭含量较少，由于有机质含量较低，苗生长得较慢，叶色稍黄，而随着泥炭含量增加，炼苗成活率提高， 苗生长速度提高，且叶片颜色也变绿，但当泥炭含量较高而珍珠岩含量较少时，炼苗成活率反而呈现下降趋势，苗的生长速度较慢，而叶色较为浓绿，可能是由于生长变缓后叶绿素积累的原因所致。从数据来看当珍珠岩、泥炭重量比为1：4时，炼苗成活率最高，苗生长也最佳。

表5不同基质组分比例对炼苗成活率的影响

对比实施例1至6可知，实施例1为最优选的实施例，实施例1的每个步骤均采用了实施例2至6所述的最佳培养条件，能够获得最高的梵天花植株数量。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。