一种冷海希瓦氏菌菌株及其胞外多糖的生产方法

摘要

本发明公开一种冷海希瓦氏菌（

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株及其应用，尤其涉及一种冷海希瓦氏菌菌株（Shewanella>）W32-2及其胞外多糖的生产方法。

背景技术

随着水产养殖的快速发展，尤其是高密度养殖，水产养殖病害的防治往往是决定经济收益的一个重要因素。随着农业部出台相关政策使得抗生素在水产养殖上的应用将逐步被替代，水产养殖病害预防亦逐渐被人们所重视，“防重于治”成为水产养殖主流观念。如何对水产养殖病害进行有效预防，同时提高经济收益实现绿色生态养殖，是水产养殖行业的瓶颈问题。

胞外多糖是一种安全无毒的免疫促进剂，极地微生物因其所处极端环境，所分泌胞外多糖较一般海洋微生物的胞外多糖分子量大5-50倍，有效的保护低温环境下冰晶对细胞的损伤，且其相较于陆源胞外多糖的特异性结构赋予了极地源胞外多糖特异的生物活性，使其在胞外多糖研究开发中占据着不可替代的重要地位。目前世界上普遍认为水产养殖动物肠道是否健康是直接关系到其对养殖病害的抵抗力、生长速度及成活率，使用益生菌或益生元是促进养殖动物肠道健康的一个重要方法，鉴于极地胞外多糖特异的生物活性，使其在水产养殖动物健康养殖中的应用成为可能。然而，具有抗氧化及益生活性的南极胞外多糖应用于水产养殖的研究尚未有相关的报道。所以，本领域技术人员迫切需要有效防治水产养殖，促进绿色健康养殖的制剂和方法的出现。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种冷海希瓦氏菌菌株（Shewanella>）W32-2，该冷海希瓦氏菌菌株W32-2于2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12129，且采用该菌株制备一种具有抗氧化及益生活性的极地源胞外多糖制品的生产方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

从南极沙土及沉积物样品中分离并筛选得到高产胞外多糖的菌株，并采用16s rDNA法对该菌株进行测序分析，最终鉴定其为冷海希瓦氏菌（Shewanella>）的一个菌株。

进一步地，采用该菌株制备一种具有抗氧化及益生活性的极地源胞外多糖制品，其制备的具体步骤为：

（1）所述的冷海希瓦氏菌菌株W32-2的活化：取中所述的冷海希瓦氏菌菌株W32-2并将其接种至斜面2216E培养基，且于8-15℃下培养4-7天；用接种环将斜面培养后的冷海希瓦氏菌菌株W32-2接种至2216E培养基上，并于8-15℃、150-200rpm条件下活化培养4-7天；

（2）发酵液的制备：将步骤（1）活化好的冷海希瓦氏菌W32-2接种至2216E培养基中发酵培养，接种量1-10%，150-200 rpm，温度设定为8-15℃；发酵4-7天则获得所需的发酵液；

（3）去菌体：取步骤（2）所得的发酵液进行8000 -10000rpm离心5-10min，吸取发酵上清液备用；

（4）胞外多糖分离纯化：将步骤（3）所得的发酵上清液进行乙醇沉淀，加入3倍发酵上清体积的无水乙醇，沉淀3-6h，5000-10000rpm离心5-10min，倾去上清，按发酵上清体积的去离子水溶解沉淀的多糖，所得溶液用Sevag法除去蛋白质，重复3-5次，后于5000-10000rpm离心5-10min，保留上清，上清液加入3倍体积无水乙醇，沉淀3-6h，5000-10000rpm离心5-10min，倾去上清，再用去离子水溶解沉淀的多糖；

（5）胞外多糖成品：将步骤（4）溶解的多糖溶液进行真空冷冻干燥，之后进行分装包装即可得所述具有抗氧化及益生活性的胞外多糖制品的成品。

进一步地，所述2216E培养基的组分均为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁 0.1g，陈海水 1000 mL，pH 7.6；

所述陈海水为把从不被陆上污物污染的或很少混有淡水的地方取来的海水装入玻璃瓶储放在暗处数星期后形成的海水。

本发明的有益效果在于：

提供一种冷海希瓦氏菌菌株（Shewanella>）W32-2，并利用该冷海希瓦氏菌菌株（Shewanella>）W32-2制备具有抗氧化及益生活性的极地源胞外多糖制品，且该制品可应用于水产绿色健康养殖，能有效降低养殖过程饲料成本，促进水产养殖动物肠道健康，提高水产养殖动物抗病力及成活率具有较好的市场应用前景。

具体实施方式

本发明中所述的冷海希瓦氏菌菌株（Shewanella>）W32-2于2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12129

本发明一种冷海希瓦氏菌菌株W32-2是从南极沙土及沉积物中分离并筛选得到高产胞外多糖的菌株，并采用16s rDNA法对该菌株进行测序分析，最终鉴定其为冷海希瓦氏菌（Shewanella>）的一个菌株。

1.菌株的分离：

（1）初筛：取1g南极沙土及沉积物样品，加至10mL 2216E培养基中，震荡混匀后取上层浊液置于2216E培养基，且于10℃、180rpm下富集培养，富集培养5天后菌液进行梯度稀释及平板涂布法进行分离操作，之后挑取2216E平板上长起的不同菌落形态的细菌划线分离纯化，保存备用。

（2）复筛：分别挑取步骤（1）初筛中得到的细菌置于2216E培养基中，于10℃、150rpm培养7天，之后10000rpm下离心6min，得发酵上清液，各发酵上清取0.5mL按3倍体积加入无水乙醇，沉淀4小时，后于10000rpm，离心6min，弃上清，沉淀溶于1mL去离子水中得到的溶液分别用苯酚硫酸法测定其多糖含量，进而筛选出胞外多糖产量最高的菌株，将该菌株标记为菌株W32-2。

2．菌株的鉴定：

将筛选所得菌株W32-2接种至2216E固体培养基，于37℃下培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：菌落乳白色，表面光滑，不透明，边缘整齐，革兰氏阴性，D-葡萄糖发酵阴性，D-甘露醇发酵阴性，胰蛋白酶阳性，胰凝乳蛋白酶阴性。同时对该菌株进行16S rDNA测定，得其16s rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

将测得的16s rDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为冷海希瓦氏菌（Shewanella>）；则结合生理生化测定结果及16s rDNA序列数据库比对结果，确定该菌株为冷海希瓦氏菌（Shewanella>）。

3．一种具有抗氧化及益生活性的极地源胞外多糖制品，其制备的具体步骤为：

（1）所述的冷海希瓦氏菌菌株W32-2的活化：取中所述的冷海希瓦氏菌菌株W32-2并将其接种至斜面2216E培养基，且于8-15℃下培养4-7天；用接种环将斜面培养后的冷海希瓦氏菌菌株W32-2接种至2216E培养基上，并于8-15℃、150-200rpm条件下活化培养4-7天；

（2）发酵液的制备：将步骤（1）活化好的冷海希瓦氏菌W32-2接种至2216E培养基中发酵培养，接种量1-10%，150-200 rpm，温度设定为8-15℃；发酵4-7天则获得所需的发酵液；

（3）去菌体：取步骤（2）所得的发酵液进行8000 -10000rpm离心5-10min，吸取发酵上清液备用；

（4）胞外多糖分离纯化：将步骤（3）所得的发酵上清液进行乙醇沉淀，加入3倍发酵上清体积的无水乙醇，沉淀3-6h，5000-10000rpm离心5-10min，倾去上清，按发酵上清体积的去离子水溶解沉淀的多糖，所得溶液用Sevag法除去蛋白质，重复3-5次，后于5000-10000rpm离心5-10min，保留上清，上清液加入3倍体积无水乙醇，沉淀3-6h，5000-10000rpm离心5-10min，倾去上清，再用去离子水溶解沉淀的多糖；

（5）胞外多糖成品：将步骤（4）溶解的多糖溶液进行真空冷冻干燥，之后进行分装包装即可得所述具有抗氧化及益生活性的胞外多糖制品的成品。

进一步地，所述2216E培养基的组分均为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁 0.1g，陈海水 1000 mL，pH 7.6；

所述陈海水为把从不被陆上污物污染的或很少混有淡水的地方取来的海水装入玻璃瓶储放在暗处数星期后形成的海水。

为了更好的对本发明中极地源胞外多糖制品进行进一步阐述说明，申请人例举了如下实施例。

实施例一

（1）所述的冷海希瓦氏菌菌株W32-2的活化：取中所述的冷海希瓦氏菌菌株W32-2并将其接种至斜面2216E培养基，且于10℃下培养5天；用接种环将斜面培养后的冷海希瓦氏菌菌株W32-2接种至10mL 2216E培养基上，并于10℃、150rpm条件下活化培养5天；

（2）发酵液的制备：将步骤（1）活化好的冷海希瓦氏菌W32-2接种至1L 2216E培养基中发酵培养，接种量5%，150 rpm，温度设定为10℃；发酵5天则获得所需的发酵液；

（3）去菌体：取步骤（2）所得的发酵液进行8000rpm离心10min，吸取发酵上清液备用；

（4）胞外多糖分离纯化：将步骤（3）所得的发酵上清液进行乙醇沉淀，加入3倍发酵上清体积的无水乙醇，沉淀3小时，10000rpm离心10min，倾去上清，按发酵上清体积的去离子水溶解沉淀的多糖，所得溶液用Sevag法除去蛋白质，重复3次，后于5000rpm离心10min，保留上清，上清液加入3倍体积无水乙醇，沉淀3小时，5000rpm离心10min，倾去上清，再用去离子水溶解沉淀的多糖；

（5）胞外多糖成品：将步骤（4）溶解的多糖溶液进行真空冷冻干燥，之后进行分装包装即可得所述具有抗氧化及益生活性的极地源胞外多糖制品的成品。

实施例二

（1）所述的冷海希瓦氏菌菌株W32-2的活化：取中所述的冷海希瓦氏菌菌株W32-2并将其接种至斜面2216E培养基，且于15℃下培养7天；用接种环将斜面培养后的冷海希瓦氏菌菌株W32-2接种至10mL 2216E培养基上，并于15℃、180rpm条件下活化培养7天；

（2）发酵液的制备：将步骤（1）活化好的冷海希瓦氏菌W32-2接种至1L 2216E培养基中发酵培养，接种量10%，180 rpm，温度设定为15℃；发酵7天则获得所需的发酵液；

（3）去菌体：取步骤（2）所得的发酵液进行10000rpm离心5min，吸取发酵上清液备用；

（4）胞外多糖分离纯化：将步骤（3）所得的发酵上清液进行乙醇沉淀，加入3倍发酵上清体积的无水乙醇，沉淀6小时， 10000rpm离心5min，倾去上清，按发酵上清体积的去离子水溶解沉淀的多糖，所得溶液用Sevag法除去蛋白质，重复5次，后于10000rpm离心5min，保留上清，上清液加入3倍体积无水乙醇，沉淀6小时， 10000rpm离心5min，倾去上清，再用去离子水溶解沉淀的多糖；

（5）胞外多糖成品：将步骤（4）溶解的多糖溶液进行真空冷冻干燥，之后进行分装包装即可得所述具有抗氧化及益生活性的极地源胞外多糖制品的成品。

4．胞外多糖制品的抗氧化试验

试验一：胞外多糖制品对DPPH清除率测定

（1）试验方法：分别取实施例一制备的胞外多糖0.1g，实施例二制备的胞外多糖0.2g，均溶解于10mL去离子水中，制成多糖溶液；取待测溶液2mL，加入0.2mmol/L DPPH和无水乙醇1mL，混匀后在室温下避光反应30min，后在5000rpm，离心10min取上清测定OD517值（记A₁），以等体积去离子水替代多糖溶液按上述相同操作测定OD517值（记A₀），分别设置三重复后按下述公式计算：

DPPH清除率=【1-（A₀->1）/>0】×100%

（2）试验结果：0.1g实施例一中制备的胞外多糖溶解至10mL去离子水中的多糖溶液对DPPH自由基清除率为36.22±0.17%；0.2g实施例二中制备的胞外多糖溶解至10mL去离子水中的多糖溶液对DPPH自由清除率为56.54±0.33%。

试验二：胞外多糖制品对羟自由基（HO·）清除率测定

（1）试验方法：分别取实施例一制备的胞外多糖0.1g，实施例二制备的胞外多糖0.2g，均溶解于10mL去离子水中，制成多糖溶液备用； 在具塞试管中依次加入1mL 5mmol/L硫酸亚铁，1mL 5mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1mL 3mmol/L双氧水溶液，混匀后加入0.5mL胞外多糖溶液，用去离子水定容至10mL，于37℃恒温水浴15min，后在6000rpm离心10min，测定OD510值（记A_i），以等体积去离子水替代多糖溶液按上述相同操作测定OD510值（记A_j），分别设置三重复后按下述公式计算：

羟自由基清除率=【1-（A_j->i）/>j】×100%

（2）试验结果：0.1g实施例一中制备的胞外多糖溶解至10mL去离子水中的多糖溶液对羟自由基清除率为45.69±0.85%；0.2g实施例二中制备的胞外多糖溶解至10mL去离子水中的多糖溶液对羟自由清除率为75.26±0.41%。

5. 胞外多糖复配益生菌拌饲应用于水产养殖试验

试验一：胞外多糖复配益生菌拌饲应用于甲鱼养殖试验

（1）试验方法：取实施例一制得的胞外多糖按1:10复配益生菌粉配制成的合生元样品并将其用在养殖甲鱼池塘中：设计一组对照组与两组实验组；实验组1中在甲鱼饲料中按4g/kg的拌饵量添加制得的合生元样品，每天拌饵一次进行饲喂；实验组2中在甲鱼饲料中按4g/kg的拌饵量添加益生菌粉；对照组为空白对照，即喂饲相同饵料但不添加益生菌/合生元；试验5个月后，计算甲鱼池中甲鱼的饵料系数及成活率。

通过计算得试验结果为：空白对照组饵料系数1.53，成活率80.1%；而实验组1饵料系数1.12，成活率92.9%；实验组2饵料系数为1.28，成活率为88.6%。

试验二：胞外多糖复配益生菌拌饲应用于南美白对虾养殖试验

（1）试验方法：取实施例二制得的胞外多糖按1:5复配益生菌粉配制成的合生元样品并将其用在养殖南美白对虾池塘中：设计一组对照组与两组实验组；实验组1中在南美白对虾饲料中按6g/kg的拌饵量添加制得的合生元样品，每天拌饵一次进行饲喂；实验组2中在南美白对虾饲料中按6g/kg的拌饵量添加益生菌粉；对照组为空白对照，即喂饲相同饵料但不添加益生菌/合生元；试验3个月后，计算南美白对虾池中对虾的饵料系数及成活率。

（2）试验结果：通过计算得试验结果为：空白对照组饵料系数1.34，成活率78.3%；而实验组1饵料系数0.97，成活率90.4%；实验组2饵料系数为1.18，成活率为87.1%。

综上可知，本发明利用冷海希瓦氏菌菌株W32-2（Shewanella>W32-2）制备所得的极地源胞外多糖制品，对于DPPH自由基及羟自由基均有较好的清除能力，有较高的抗氧化活性；极地源胞外多糖制品配合益生菌使用，在水产养殖过程中作为饲料添加剂，能有效地降低饵料系数，提高成活率，具有较好的生产应用前景。

<110>国家海洋局第三海洋研究所

<120>一种冷海希瓦氏菌菌株及其胞外多糖的生产方法

<160>1

<211>1447

<212>DNA

<213> 冷海希瓦氏菌种（Shewanella frigidimarina）

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