一种从茶多酚中纯化茶儿茶素的技术

摘要

本发明涉及从茶多酚中纯化茶儿茶素的技术。包括利用硅胶柱层析串联低取代度的羟丙基纤维素富集精制茶儿茶素类成分，达到既除去茶多酚中的水溶性和脂溶性色素，又能彻底脱除咖啡碱类成分。层析、富集的填料经活化再生后可重复利用，茶儿茶素产品制备过程中所用试剂均具有“绿色”环保性。

说明书

技术领域

本发明属于天然产物分离纯化技术领域，具体涉及一种利用硅胶和低取代度羟丙基纤维素串联组合的方式从茶多酚中纯化制备茶儿茶素的技术。

背景技术

茶树源产于中国云南西双版纳(陈椽.再论茶树原产地.茶业通报,1981,01:20-25.)，隶属于山茶科(Theacea)山茶属(CamelliaSinensis(L.)O.Ktze.)植物(中国植物志,第49(3)卷)。茶树所萌发的新叶可制成一种大众消费者喜爱的饮料，在我国有着几千年的饮用历史，常饮可以生津止渴、去疾强身和明目益思，有益身心健康(赵保路.天然抗氧化剂茶多酚的健康作用及其机理.生物物理学报,2012,28(5):426-437.||ChungS.Yang.CancerPreventionbyVitaminEandTeaPolyphenols:LessonsLearnedfromStudiesinAnimalModelsandhumans.ProgressinChemistry,2013,25(9):1492-1500.)。

茶叶经分离鉴定的化合物约700种(宛晓春.茶叶生物化学,中国农业出版社,2003)，其中包括茶多酚、有机酸、茶氨酸、生物碱、茶皂素、芳香类物质，等。茶多酚是茶树中多酚类混合物，以2-苯基苯并吡喃为主体结构的黄烷醇类化合物—茶儿茶素占主体成分。茶儿茶素一般包括表型儿茶素(Epicatechin,EC)、表没食子型儿茶素(Epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechingallate,ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechingallate,EGCG)，其总质量份数在干茶中一般高于7%(w/w).茶儿茶素具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤，等特性。

我国茶树资源丰富，实有茶园面积2279.94千公顷，可采摘有1735.2千公顷(2012年度国家统计局数据)，茶叶产量192.45万吨(2013年度国家统计局数据)。采摘的茶鲜叶经加工成的干茶一般包括名优茶和大宗茶。以浙江省茶产业为例(毛祖法,罗列万,陆德彪,等.浙江省名优茶产业可持续发展对策研究.中国茶叶加工,2012,2:9-12.)，2010年名优茶产量(6.5万吨)和产值(84.4亿元)分别是总产量和产值的39.2%和93.3%。故大宗夏秋茶存在产量大、产值低的问题。大宗茶酚氨比高，以深加工手段来开发利用其中的多酚将是其发展途径之一。据悉，浙江省当前茶叶深加工企业约40家，年消耗干茶约8.2万吨，主要用来生产茶多酚、速溶茶，等。茶多酚目前为茶叶深加工企业的主打产品，其产品主要运用于茶饮料、食品添加剂及保健类产品。但随着植物提取物的发展、生物化学精制纯化技术的进步，及人们对高品质产品不断追求，成分与功能相对单一、集中的天然产物产品将是未来一种发展趋势。因此，茶儿茶素作为人类的一种健康元素，将其精制纯化符合当前大健康产业的发展。

目前市售茶多酚产品主要是利用水提或水的乙醇溶液提取、浓缩干燥而得，粉末呈黄棕色。茶儿茶素一般得到较好的保留，只是与其相伴随的杂质较多，尤其是脂溶性与水溶性色素类成分影响了产品品质。我们实验室前期收集市场销售的不同含量规格的茶多酚产品，主要来源于浙江东方茶业科技有限公司、四川禹伽茶业科技有限公司、晨光生物科技集团股份有限公司、浙江塔塔茶业科技有限公司、湖州荣凯植物提取有限公司、福建利康源生物工程有限公司、江西绿康天然产物有限责任公司、湖南金农生物资源股份有限公司、安徽红星药业有限责任公司，并按国标家茶叶标准GB/T8313-2008测定了其所含有的茶多酚、茶儿茶素成分(见表1)。结果表明，茶儿茶素总量占茶多酚质量百分数在50%-88.8%范围。

表1市售茶多酚产品中茶多酚、没食子酸及茶儿茶素含量(%,w/w)

注：表中样品中各成分以平均数±标准偏差(n=3)表示。

茶儿茶素的纯化方法主要有沉淀法(ZL02139219.6)、树脂吸附法(张盛,刘仲华,黄建安,等.吸附树脂法制备高纯度儿茶素的研究.茶叶科学,2002,22(2):125-130||张盛,刘仲华,黄建安,等.高ECG型儿茶素纯化工艺研究.湖南农业大学学报(自然科学版),2003,29(2):144-146.||龚雨顺,刘仲华,黄建安,等.大孔吸附树脂分离茶儿茶素和咖啡因研究.湖南农业大学学报(自然科学版),2005,31(1):50-52||李慧星.树脂法提取纯化儿茶素及儿茶素单体EGCG分离制备的工艺研究.合肥工业大学,2006.||钟世安,贺国文,涂秋云,等.大孔吸附树脂对酯型儿茶素吸附性能的研究.离子交换与吸附,2007,23(5):392-399.||仉燕崃.酯型儿茶素的分离纯化工艺研究.大连理工大学,2006||EP1767097,Processforpreparingepigallocatechingallate||杨性民,刘青梅,高海月,应敏,杨留明.茶多酚中EGCG分离纯化工艺优化.中国食品学报,2006,6(5):77-80.||王传金,魏运洋,朱广军,等.聚酰胺色谱法分离制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯.应用化学,2007,24(4):443-447.||龚志华,黄甜,庞月兰,等.HP-20大孔吸附树脂分离纯化儿茶素EGCG的效果.湖南农业大学学报(自然科学版),2010,36(1):87-90||JianhanHuang,KelongHuang,SuqinLiu,QiongLuo,MancaiXu.Adsorptionpropertiesofteapolyphenolsontothreepolymericadsorbentswithamidegroup.Journalofcolloidandinterfacescience.||RuiyingZhao,YuYan,MingxianLi,HushengYan.Selectiveadsorptionofteapolyphenolsfromaqueoussolutionofthemixturewithcaffeineonmacroporouscrosslinkedpoly(N-Vinyl-2-pyrrolidinone).Reactive&FunctionalPolymers68(2008)768-774.||杨文泓,赵长青,高杰,等.用大孔氨甲基聚苯乙烯树脂选择性吸附分离茶多酚和咖啡因.离子交换与吸附,2007,23(6):481-488.||唐课文,周春山,钟世安,等.聚酰胺树脂对茶多酚和咖啡因吸附选择性研究.光谱学与光谱分析,2003,23(1):143-145.)、反相碳十八填料柱层析法(周庆秋.天然酯型儿茶素EGCG的分离纯化及药学研究.黑龙江大学,2008.||林丹,李春苗,鲜殊,等.中压制备液相色谱快速分离制备儿茶素单体.天然产物研究与开发,2013,25(1):92-95,100.||赖榕辉,黄亚辉.中低压柱层析分离儿茶素的研究.离子交换与吸附,2012,28(2):165-170.)、膜分离法(张建勇,江用文,江和源,等.膜分离过程中儿茶素和咖啡碱含量变化研究.安徽农业科学,2013,41(2):493-496.)、凝胶柱层析法(黄静.高纯度儿茶素单体EGCG和ECG分离及纯化工艺研究.合肥工业大学,2004)，等。

硅胶作为一种天然无毒性分离材料已广泛运用于植物提取物中有效成分的分离与纯化，茶多酚的茶儿茶素的制备纯化亦不例外(龚正礼,蒲建,刘勤晋.茶叶儿茶素提取和纯化研究.西南农业大学学报,1995,17(6):546-549||杨磊,高彥华,祖元刚,等.中压硅胶柱层析连续纯化茶叶中EGCG及ECG的研究.林产化学与工业,2007,27(2):100-104.||袁华,吴莉,吴元欣,等.硅胶柱层析法提纯茶多酚的研究.华中师范大学学报(自然科学版),2007,41(4):553-556..||卢涛,兰先秋,朱斌,等.不同茶多酚中儿茶素的测定及柱层析法提取EGCG的比较.化工进展,2008,27(5):749-752.||朱斌,陈晓光.二次层析制备高纯表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的工艺研究.食品与机械,2009,25(4):83-85.)。发明人以文献提供的方法，利用硅胶为柱层析填料对市售茶多酚中茶儿茶素进行纯化验证实验。如文献所述，胶硅以无水乙酸乙酯作为装柱和洗脱用溶剂，茶多酚会被分成较为明显的上下可见的组份，但上下组份中均含有茶儿茶素，分离不彻底；且被吸附的极性较强色素类成分难以洗脱不容忽视。另一方面，使用后的硅胶需干燥后才能使用，使得硅胶的特殊的分离性能难以产业化制备应用。若以凝胶SephadexLH-20为柱填料从茶多酚中纯化精制茶儿茶素亦存在色素污染难以洗脱的问题，再生洗脱需用高浓度的强碱和盐，增加分离周期和实验难度，从而降低了其产业化的应用前景。故以现有的工艺填料作为吸附与层析，获取高纯度的茶儿茶素，有效去除被填料吸附的色素及工艺的组合优化改善显得尤为必要和紧迫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以硅胶和低取代度羟丙基纤维素串联组合的方式纯化制备茶儿茶素的技术，具体技术路线见图1。与现有单独利用硅胶层析技术相比，该工艺可以使得茶儿茶素更加有效的分离和富集。

本发明的目的还在于提供一种有效去除被硅胶吸附后的完固性色素，吸附层析后的硅胶活化更加简单可行，从而可以实现长期循环利用。本发明提供的一种从茶多酚中纯化茶儿茶素的技术，包括：

(1)将茶多酚粉末用含醋酸的水溶解，得茶多酚溶液；

(2)离心步骤(1)所配制的茶多酚溶液，获得上清液；

(3)将步骤(2)的上清液与水饱和的乙酸乙酯充分混合，待分层后，获取上层酯相萃取液；

(4)浓缩步骤(3)的上层酯相萃取液，获得浓缩液；

(5)将步骤(4)的浓缩液上样于硅胶层析柱；

(6)以水饱和乙酸乙酯洗脱，并收集洗脱液；

(7)浓缩步骤(6)的洗脱液，以去除乙酸乙酯，得茶儿茶素纯化产物(I)；

(8)利用酒石酸钾钠水溶液洗脱再生步骤(5)中的硅胶；

(9)用水稀释步骤(7)中的茶儿茶素纯化产物(I)，获得水溶液；

(10)将步骤(9)的水溶液上样并吸附于低取代度羟丙基纤维素；

(11)用水洗脱；

(12)用15-45%(v/v)的乙醇洗脱，并收集洗脱液；

(13)浓缩步骤(12)的洗脱液，获得浓缩液；

(14)利用含乙酸乙酯的水洗脱再生步骤(10)中的低取代度羟丙基纤维素；

(15)向步骤(13)的浓缩液中加入乙酸乙酯充分混合，待分层后，获取上层酯相萃取液；

(16)浓缩步骤(15)的上层酯相萃取液，以去除乙酸乙酯，得茶儿茶素纯化产物(II)；

(17)进一步真空干燥步骤(16)的茶儿茶素纯化产物(II)，得精制纯化的茶儿茶素。

优先地，其中步骤(1)所述含有醋酸的水，醋酸浓度在1-4mol/L。

优先地，其中步骤(1)所述含有醋酸的水，醋酸浓度为2mol/L。

优先地，其中步骤(1)所述的茶多酚溶液，茶多酚浓度高于5%(w/v)。

优先地，其中步骤(1)所述的茶多酚溶液，茶多酚浓度为10%(w/v)。

优先地，其中步骤(2)所述的离心机转速≥3000r/min。

优先地，其中步骤(2)所述的离心时间≥10min。

优先地，其中步骤(3)所述的水饱和乙酸乙酯为上清液的0.5-1.5倍体积。

优先地，其中步骤(3)所述水饱和的乙酸乙酯为上清液的1倍。

优先地，其中步骤(3)所述水饱和的乙酸乙酯为上清液的1倍，萃取2次。

优先地，其中步骤(4)、(7)、(13)、(16)和(17)在真空度-0.07MPa~-0.1MPa，温度35℃~50℃条件下进行。

优先地，其中步骤(9)中溶液的浓度控制在0.5%~5%(w/v)。

优先地，其中步骤(11)洗脱残留的醋酸。

优先地，其中步骤(8)的酒石酸钾钠的浓度为35mmol/L~50mmol/L。

本发明的主要优点在于：

(1)未经纯化的茶多酚(茶多酚含量一般低于80%，w/w)以常温水溶解会有一部分黏性成分难以溶解，难溶解的成分会吸附一定量的茶儿茶素共同形成沉淀；如以一定浓度的醋酸溶解茶多酚，则会促使沉淀中的茶儿茶素重新溶解于水中，从而降低茶儿茶素的损失。

(2)硅胶柱吸附层析前通过水饱和乙酸乙酯萃取，一方面富集了茶儿茶素，另一方面降低了水溶性色素成分与硅胶层析填料发生过度的吸附作用。

(3)水装填硅胶，充分活化后，再以水饱和乙酸乙酯平衡，并以此作为柱层析洗脱剂，则可使咖啡碱和水溶性强的色素得以强保留吸附，而茶儿茶素和脂溶性较强的黄红色色素随洗脱剂一齐洗脱，从而实现较充分的第一步层析纯化。

(4)硅胶层析柱的活化再生直接采用酒石酸钾钠的水溶液，便于水饱和乙酸乙酯的平衡再利用，从而简易实现柱层析填料的可重复循环利用的目的。

附图说明

图1是从茶多酚中纯化茶儿茶素技术路线示意图。

图2是茶多酚原料、硅胶柱层析水饱和乙酸乙酯洗脱液、低取代羟丙基纤维素水洗脱液及解析液中各成分(没食子酸、表没食子儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯)的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合实施例，更进一步阐述本发明的主旨。

下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中茶儿茶素的分析均采用国标方法(GB/T8313-2008，茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法)。高效液相色谱Waters(1525泵、柱温箱、2487紫外可见双通道检测器、717-plus自动进样器、Breeze控制软件包)，色谱柱为PhenomenexLuna5μmPhenyl-Hexyl,250mm×4.6mm。采用咖啡碱作为内标系数法定量各成分。分别取咖啡碱标准溶液50mg/L、100mg/L、150mg/L进样10μL，经高效液相色谱分离后，在278nm条件下所对应的积峰面积分别为1311154(μV×Sec)，2671194(μV×Sec)，4058875(μV×Sec)；强制经过坐标轴原点的标准曲线为ψ(峰面积)=26900×χ(浓度mg/L)，R²=0.999。

下述实施例中所述的茶多酚为同一批次，茶多酚原料、硅胶柱层析制备的茶儿茶素粗品、低取代羟丙基纤维素水洗脱液及解析液中各成分的HPLC图如图2所示。所述的GA、EGC、CAF、EC、EGCG、ECG分别为没食子酸、表没食子儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯。所述的L-HPC为低取代度羟丙基纤维素。

下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中实验数据的采集在2014年10月至2014年12月完成。

实施例1纯水溶解茶多酚粉末

取茶多酚粉末0.5g置于10mL塑料刻度管中,并加5mL的纯水，充分搅拌并经3500r/min离心10min后，转移上清至10mL容量瓶中定容。稀释50倍后，进10μL进行高效液相色谱分析。塑料刻度管中的沉淀经80℃热风充分干燥5h后取出精密称量。结果表明，经定容的上清液中EGCG的浓度为164.2mg/L，ECG的浓度为22.2mg/L，沉淀重0.1088g。

实施例2含醋酸的水溶解茶多酚粉末

取茶多酚粉末0.5g置10mL塑料刻度管中,并加5mL的醋酸水溶液(醋酸浓度为0.2mol/L)，充分搅拌并经3500r/min离心10min后，转移上清至10mL容量瓶中定容。稀释50倍后，进10μL进行高效液相色谱分析。塑料刻度管中的沉淀经80℃热风充分干燥5h后取出精密称量。结果表明，经定容的上清液中EGCG的浓度为189.8mg/L，ECG的浓度为22.9mg/L，沉淀重0.0901g。

实施例3含醋酸的水溶解茶多酚粉末

取茶多酚粉末0.5g置10mL塑料刻度管中,并加5mL的醋酸水溶液(醋酸浓度为0.5mol/L)，充分搅拌并经3500r/min离心10min后，转移上清至10mL容量瓶中定容。稀释50倍后，进10μL进行高效液相色谱分析。塑料刻度管中的沉淀经80℃热风充分干燥5h后取出精密称量。结果表明，经定容的上清液中EGCG的浓度为206.2mg/L，ECG的浓度为29.5mg/L，沉淀重0.0735g。

实施例4含醋酸的水溶解茶多酚粉末

取茶多酚粉末0.5g置10mL塑料刻度管中,并加5mL的醋酸水溶液(醋酸浓度为1mol/L)，充分搅拌并经3500r/min离心10min后，转移上清至10mL容量瓶中定容。稀释50倍后，进10μL进行高效液相色谱分析。塑料刻度管中的沉淀经80℃热风充分干燥5h后取出精密称量。结果表明，经定容的上清液中EGCG的浓度为253.4mg/L，ECG的浓度为37.1mg/L，沉淀重0.0427g。

实施例5含醋酸的水溶解茶多酚粉末

取茶多酚粉末0.5g置10mL塑料刻度管中,并加5mL的醋酸水溶液(醋酸浓度为2mol/L)，充分搅拌并经3500r/min离心10min后，转移上清至10mL容量瓶中定容。稀释50倍后，进10μL进行高效液相色谱分析。塑料刻度管中的沉淀经80℃热风充分干燥5h后取出精密称量。结果表明，经定容的上清液中EGCG的浓度为258.8mg/L，ECG的浓度为37.6mg/L，沉淀重0.025g。

实施例6含醋酸的水溶解茶多酚粉末

取茶多酚粉末0.5g置10mL塑料刻度管中,并加5mL的醋酸水溶液(醋酸浓度为4mol/L)，充分搅拌并经3500r/min离心10min后，转移上清至10mL容量瓶中定容。稀释50倍后，进10μL进行高效液相色谱分析。塑料刻度管中的沉淀经80℃热风充分干燥5h后取出精密称量。结果表明，经定容的上清液中EGCG的浓度为267.5mg/L，ECG的浓度为40.8mg/L，沉淀重0.012g。

上述实施例中，对照取20mg茶多酚以50%(v/v)乙醇完全溶解定溶于10mL，进10μL进行高效液相色谱分析。结果表明，经定容的溶液中GA、EGC、CAF、EC、EGCG和ECG的浓度分别为11.9mg/L，68.6mg/L，97.1mg/L，17.8mg/L，100.2mg/L，23.7mg/L。茶多酚原料中各成分GA、EGC、CAF、EC、EGCG和ECG的质量份数分别为0.6%、3.4%、4.8%、0.9%、5.0%、1.2%。

实施例7硅胶柱层析纯化富集茶儿茶素

以市售茶多酚粉末5g为一纯化富集单元，每单元所采用的步骤如下：

①准确称取茶多酚粉末5g，加入2mol/L的醋酸水50mL，充分搅拌后，放入离心机中3500r/min离心10min后，取上清并加入25mL水饱和乙酸乙酯，充分震摇并静置分层后，取上层酯相上样于水饱和乙酸乙酯平衡的硅胶层析柱(约200目硅胶100g，柱径3.5cm，柱高26cm，柱床中的间隙体积80mL)，并以水饱和乙酸乙酯洗脱，收集始于洗脱液含有黄红色色素至洗脱液无色为止。浓缩洗脱液至干后，真空干燥得茶儿茶素粗品0.42g。

②准确称取茶多酚粉末5g，加入2mol/L的醋酸水50mL，充分搅拌后，放入离心机中3500r/min离心10min后，取上清并加入50mL水饱和乙酸乙酯，充分震摇并静置分层后，取上层酯相上样于水饱和乙酸乙酯平衡的硅胶层析柱(约200目硅胶100g，柱径3.5cm，柱高26cm，柱床中的间隙体积80mL)，并以水饱和乙酸乙酯洗脱，收集始于洗脱液含有黄红色色素至洗脱液无色为止。浓缩洗脱液至干后，真空干燥得茶儿茶素粗品0.53g。

③准确称取茶多酚粉末5g，加入2mol/L的醋酸水50mL，充分搅拌后，放入离心机中3500r/min离心10min后，取上清并加入150mL水饱和乙酸乙酯，充分震摇并静置分层后，取上层酯相并浓缩至其体积低于100mL；取浓缩液上样于水饱和乙酸乙酯平衡的硅胶层析柱(约200目硅胶100g，柱径3.5cm，柱高26cm，柱床中的间隙体积80mL)，并以水饱和乙酸乙酯洗脱，收集始于洗脱液含有黄红色色素至洗脱液无色为止。浓缩洗脱液至干后，真空干燥得茶儿茶素粗品0.57g。

合并混合以上①②③单元所得的茶儿茶素粗品(茶儿茶素纯化产物(I))为1.52g。经HPLC检测其所含有的GA、EGC、EC、EGCG和ECG的质量份数(%，w/w)分别为2.3%、4.1%、4.9%、34.0%、9.1%。采用酒石酸钾钠的水溶液洗脱再生硅胶。

实施例8L-HPC吸附柱富集茶儿茶素

取实施例7所得茶儿茶素粗品0.5g溶解于并定容至100mL，以1cm/min的流速上样于水平衡的L-HPC(5gL-HPC，柱径1.6cm，柱高13.5cm，柱床中的间隙体积10mL)，并以30%(v/v)乙醇水溶液进行洗脱，同时收集洗脱液。观察发现，洗脱液为浅淡黄色，且L-HPC吸附的深红色色素未被洗脱。将洗脱液真空进行浓缩挥去乙醇后，利用乙酸乙酯进行富集干燥得精制茶儿茶素产物0.25g，其中GA、EGC、EC、EGCG和ECG的质量份数(%，w/w)分别为3.2%、4.5%、7.7%、59.5%、13.0%。

实施例9L-HPC吸附柱富集茶儿茶素

取实施例7所得茶儿茶素粗品0.5g溶解于并定容至100mL，以1cm/min的流速上样于水平衡的L-HPC(5gL-HPC，柱径1.6cm，柱高13.5cm，柱床中的间隙体积10mL)，并以40%(v/v)乙醇水溶液进行洗脱，同时收集洗脱液。观察发现，洗脱液为淡黄色，且L-HPC吸附的深红色色素未被洗脱。将洗脱液真空进行浓缩挥去乙醇后，利用乙酸乙酯进行富集干燥得精制茶儿茶素产物0.27g，其中GA、EGC、EC、EGCG和ECG的质量份数(%，w/w)分别为3.7%、6.5%、7.9%、56.8%、16.0%。

实施例10L-HPC吸附柱富集茶儿茶素

取实施例7所得茶儿茶素粗品0.5g溶解于并定容至100mL，以1cm/min的流速上样于水平衡的L-HPC(5gL-HPC，柱径1.6cm，柱高13.5cm，柱床中的间隙体积10mL)，并以50%(v/v)乙醇水溶液进行洗脱，同时收集洗脱液。观察发现，洗脱液为淡黄色，且L-HPC吸附的深红色色素未被洗脱。将洗脱液真空进行浓缩挥去乙醇后，利用乙酸乙酯进行富集干燥得精制茶儿茶素产物0.31g，其中GA、EGC、EC、EGCG和ECG的质量份数(%，w/w)分别为3.8%、6.6%、7.6%、52.8%、16.5%。