一种鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的SCAR标记及其应用

摘要

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的SCAR标记及其应用。本发明以四倍体马铃薯为材料，基于马铃薯基因组相关序列信息，结合高通量简化基因组测序技术，提供了一种鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的方法，并开发了一个可用于马铃薯熟性辅助选择的分子标记SCAR 5‑8。通过实验证明：利用分子标记SCAR5‑8对不同熟性的四倍体马铃薯品种进行检测，检测结果与表型鉴定结果的吻合度达81.4％以上，且选择准确率高、稳定性好、方便又快速，在苗期就能对后代进行选择，不受植物生长阶段及环境条件影响，可有效加速马铃薯熟性育种进程，降低育种成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的SCAR标 记及其应用。

背景技术

马铃薯是世界第三大、我国第四大粮食作物，因其具有耐寒、耐贫瘠、高产稳产、 适应性广、营养全面等优点，在世界范围内广泛种植，对于保障我国及世界的粮食安 全具有重要意义。熟性是马铃薯重要的农艺性状，主要育种目标之一，也是鉴别品种 特征的重要依据之一。不同熟性品种的选育可以满足不同地区和季节马铃薯种植、消 费市场及马铃薯产业发展等多样化需求。如中国广大中原二季作地区春作和秋作马铃 薯的生育期都只有60-70天左右(出苗至成熟)，适合种植早熟或中早熟品种，且可提 早供应市场；而在北方一季作区，马铃薯生育期长，适合种植晚熟或中晚熟品种，且 产量高；在人口众多、可利用耕地日趋减少的中原省份，早熟马铃薯是与粮棉间作套 种的理想作物；对于马铃薯加工业，适宜的早熟或中早熟品种还可提早加工、延长加 工期，减少储藏费用，提高经济效益。因此，选育不同熟性的品种对于促进马铃薯产 业全面发展具有重要意义。

分子标记辅助育种技术不受生长阶段与环境的影响，可以提高选择效率，缩短育 种周期，加速马铃薯育种进程。早期已有研究者利用分子标记对马铃薯熟性进行了遗 传机制的研究。由于四倍体马铃薯(2n＝4x＝48)高度杂合，遗传重组频率高，且自交 多代后衰退严重，遗传背景狭窄，基因库贫乏，分子标记开发困难。而二倍体染色体 数目较少，遗传背景相对简单，易于进行遗传分析和操作，所以研究者大多利用二倍 体材料开发标记，再将标记应用到四倍体材料中。因此，在进行熟性相关分子标记的 研究中，所用材料主要为二倍体马铃薯。前人的研究表明，在大多数马铃薯后代群体 中，5号染色体上存在一个控制熟性的主效QTL，且与分子标记GP21紧密连锁。在 实际的标记辅助育种和对四倍体马铃薯细胞学研究过程中，人们逐渐发现，由于四倍 体马铃薯在减数分裂过程中的复杂性，可导致染色体发生交换重组而出现标记与性状 偏分离、筛选准确率低等问题。人们开始利用四倍体进行标记开发和QTL定位研究， 同样也在5号染色体上定位出一个熟性相关QTL，与分子标记STM3179、c2_476095 等连锁。虽然前人的相关研究已获得一些与熟性相关的分子标记，但目前仍然难以用 于四倍体马铃薯熟性育种，且准确性和稳定性较差，筛选效率低。因此，急需开发出 与熟性紧密连锁的分子标记，为马铃薯分子标记辅助育种提供新的标记资源，加速马 铃薯熟性育种进程。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的物质在如 下(1)-(6)中至少一种中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性性状；

(2)制备鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性性状的产品；

(3)鉴定或辅助鉴定待测马铃薯为早熟马铃薯还是晚熟马铃薯；

(4)制备鉴定或辅助鉴定待测马铃薯为早熟马铃薯还是晚熟马铃薯的产品；

(5)选育早熟马铃薯；

(6)选育晚熟马铃薯。

上述应用中，所述检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的物质为PCR扩增含有 所述DNA片段甲的引物。

上述应用中，

所述引物为如下1)或2)：

1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA 分子组成的引物对A；

2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对 B；

所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相 同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相 同功能的核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性的方法是检测待测马铃薯是否含 有DNA片段甲，

若待测马铃薯含有DNA片段甲，则待测马铃薯为或候选为早熟马铃薯；

若待测马铃薯不含有DNA片段甲，则待测马铃薯为或候选为晚熟马铃薯。

上述方法中，所述检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的方法为如下X1)或 X2)：

X1)直接测序马铃薯个体的基因组DNA；

X2)测序含有DNA片段甲的PCR扩增产物；

所述PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：

1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA 分子组成的引物对A；

2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对 B；

所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相 同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相 同功能的核苷酸。

本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性性状的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯熟性性状的产品为检测待测马铃薯是 否含有DNA片段甲的物质。

上述产品中，所述检测待测马铃薯是否含有DNA片段甲的物质为如下Y1)或 Y2)或Y3)或Y4)：

Y1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA 分子组成的引物对A；

Y2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物 对B；

所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相 同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相 同功能的核苷酸；

Y3)含有Y1)所述引物对A或Y2)所述引物对B的PCR试剂；

Y4)含有Y1)所述引物对A或Y2)所述引物对B或Y3)所述PCR试剂的试剂 盒。

上述DNA片段甲也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种选育早熟马铃薯的方法或一种选育晚熟马铃薯 的方法。

本发明提供的选育早熟马铃薯的方法是选育含有DNA片段甲的马铃薯。

本发明提供的选育晚熟马铃薯的方法是选育不含有DNA片段甲的马铃薯。

上述应用或上述方法或上述产品中，

所述DNA片段甲的核苷酸序列为马铃薯基因组(马铃薯基因组参考序列的版本 号为Potato(SolanumtuberosumgroupPhurejaDM1-3)GenomeBrowserv4.03)的第 4155399-4155979位，也即为序列3所示的DNA分子。

所述早熟马铃薯为生育期小于75天的马铃薯；所述晚熟马铃薯为生育期大于110 天的马铃薯；所述生育期为从出苗至生理成熟的天数；所述出苗为子叶出土；所述生 理成熟为植株叶片达到50％枯黄。

上述应用或上述方法或上述产品中，

所述马铃薯为四倍体马铃薯。

本发明的优点：

1)弥补目前马铃薯熟性标记不足及表观选择筛选效率低、工作量大的问题。

2)利用本发明开发的标记，在苗期就可以根据马铃薯的DNA进行鉴定，从而确 定其熟性，可节省人力物力，缩短育种周期。

本发明以四倍体马铃薯为材料，基于马铃薯基因组相关序列信息，结合高通量简 化基因组测序技术，提供了一种鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的方法，并开发了一个可 用于马铃薯熟性辅助选择的分子标记SCAR5-8。通过实验证明：利用分子标记 SCAR5-8对不同熟性的四倍体马铃薯品种进行检测，检测结果与表型鉴定结果的吻合 度达81.4％以上，且选择准确率高、稳定性好、方便又快速，在苗期就能对后代进行 选择，不受植物生长阶段及环境条件影响，可有效加速马铃薯熟性育种进程，降低育 种成本。

附图说明

图1为试验材料亲本基因组DNA与子代DNA混池的电泳检测。其中，亲本1： 中薯3号；亲本2：中薯19号；混池1：极端早熟子代DNA混池；混池2：极端晚熟 子代DNA混池。

图2为分子标记SCAR5-8在早熟子代中的验证。注：亲本1：中薯3号；亲本2： 中薯19号；编号：依次为早熟子代材料编号。

图3为分子标记SCAR5-8在晚熟子代中的验证。注：亲本1：中薯3号；亲本2： 中薯19号；编号：依次为晚熟子代材料编号。

图4为分子标记SCAR5-8在部分早熟四倍体马铃薯品种中的验证。注：编号1-15 依次为：中薯2号、中薯4号、中薯6号、中薯8号、郑薯5号、郑薯6号、早大白、 克新5号、克新9号、黄麻子、春秋7号、春薯2号、双丰4号、川芋56和超白。

图5为分子标记SCAR5-8在部分晚熟四倍体马铃薯品种中的验证。注：编号1-15 依次为：青薯4号、青薯8号、青薯9号、宁薯5号、宁薯7号、晋薯2号、晋薯4 号、高原2号、高原6号、燕子、中薯21号、云薯401、天薯5号、天薯9号和陇 薯5号。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的亲本中薯3号为马铃薯早熟品种，品种审定编号：国审薯2005005 号，公众可从中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所获得。

下述实施例中的亲本中薯19号为马铃薯晚熟品种，品种审定编号：国审薯 2014002，公众可从中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所获得。

实施例1、分子标记SCAR5-8的获得及鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的方法

一、分子标记SCAR5-8的获得

1、试验材料与熟性性状鉴定

试验材料如下：父本，早熟品种中薯3号；母本，晚熟品种中薯19号；F1代杂 交分离群体，221个基因型。

调查F1代分离群体的出苗与生理成熟时间，计算生育期。按照生育期长短，将生 育期小于75天的记为早熟材料，生育期大于110天的记为晚熟材料，生育期大于75 天且小于110天的记为中熟材料。生育期为从出苗(子叶出土)至生理成熟(植株叶 片达到50％枯黄)的天数。

2、SCAR5-8标记开发

(1)分别选取极端早熟子代(早熟材料)与极端晚熟子代(晚熟材料)各30份。 分别采集极端早熟与极端晚熟子代的叶片，等量混合，采用改良的CTAB小量法分别 提取DNA，并利用琼脂糖凝胶电泳进行质量检测；分别构建得到极端早熟DNA混池 和极端晚熟DNA混池。部分实验材料的电泳检测结果如图1所示。

采用改良的CTAB小量法提取基因组DNA，步骤如下：

1)取管盖大小的马铃薯叶片2片于1.5mL离心管内。

2)将含叶片的1.5mL离心管放于液氮中冷冻后，用研磨棒研成粉末，加入65℃ 预热的2％的CTAB700uL(添加β巯基乙醇，终浓度为1％)，混匀。

3)置65℃水浴1h，期间每10min摇动一次。

4)取出冷却至室温后，加入等体积预冷的氯仿：异戊醇(24：1)溶液700uL，轻 轻摇匀5min。

5)14000rpm，4℃离心10min，吸取上清液约500ul至新的1.5mL离心管中，加 入等体积预冷的异丙醇，轻轻上下震荡混匀。

6)-20℃冰箱中沉淀30min(可过夜)，14000rpm，4℃离心10min；

7)倒掉上清液，加入1mL70％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒6-8次，7500rpm离心 5min，弃上清。

8)重复清洗，取1mL70％乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5min，弃上清液

9)放入通风橱，至酒精挥发完毕，加入100μL有RNA酶的无菌水复溶，37℃温 育1h除去残余的RNA(RNase浓度：0.1mg/mL)。

10)取2μLDNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)将质量检测合格的亲本DNA、极端早熟DNA混池和极端晚熟DNA混池， 利用2b-RAD技术进行高通量简化基因组测序和比较分析，获得早晚熟池间的差异区 段。进一步根据差异标签在差异区段中的位置，结合马铃薯参考基因组序列，利用 Premier5引物设计软件进行引物设计，并合成引物。

(3)以早熟亲本中薯3号与晚熟亲本中薯19号的基因组DNA为模板，采用 SCAR5-8标记进行PCR扩增，扩增产物利用浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测， 查看引物的质量及特异性。选择只在某一亲本中扩增出条带，而另一亲本未扩增出条带 的引物，或者在两亲本中扩增出不同条带的引物，得到亲本PCR扩增条带存在差异的 所有引物。

上述PCR扩增体系(10μL)如表1所示：

表1、PCR扩增体系

上述PCR扩增程序如表2所示：

表2、PCR扩增体系

电泳：上样量为10μL，琼脂糖凝胶为1.2％，电压120V，电泳25min。

3、SCAR5-8标记的验证

分别以极端早熟DNA混池和极端晚熟DNA混池为模板，分别采用亲本PCR扩增 条带存在差异的引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物并对其进行测序。PCR 扩增方法与产物检测方法同上。

结果发现，在亲本PCR扩增条带存在差异的所有引物中，引物5-8在极端早熟与 极端晚熟子代材料中表现的一致性最高。即，除少数个别材料外，极端早熟子代材料 条带扩增结果与早熟亲本中薯3号一致，均扩增出大小为581bp的条带(图2)；而极 端晚熟子代材料条带扩增结果则与晚熟亲本中薯19号一致，均无扩增出条带(图3)。 上述大小为581bp的条带的核苷酸序列为马铃薯基因组(马铃薯基因组参考序列的版 本号为Potato(SolanumtuberosumgroupPhurejaDM1-3)GenomeBrowserv4.03)的第 4155399-4155979位，也即为序列3所示的DNA分子。

由此可见，引物5-8可以对马铃薯熟性进行鉴定，并将该引物命名为SCAR5-8。 SCAR5-8分子标记的序列如下：

F：5’-CACTTCGTAAAAATCCTGG-3’(序列1)；

R：5’-ATTCATCCCATCACGTTTT-3’(序列2)。

二、分子标记SCAR5-8鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的方法

分子标记SCAR5-8对马铃薯熟性进行鉴定的方法具体如下：

(1)用分子标记SCAR5-8对待测马铃薯的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物；

(2)检测PCR扩增产物；

若PCR扩增产物含有大小为581bp的目的条带，则待测马铃薯为或候选为早熟马 铃薯；

若PCR扩增产物不含有大小为581bp的目的条带，则待测马铃薯为或候选为晚熟 马铃薯。

实施例2、分子标记SCAR5-8在四倍体马铃薯熟性分离群体与四倍体品种熟性筛 选中的应用

一、分子标记SCAR5-8在四倍体马铃薯熟性分离群体筛选中的应用

1、试验材料与熟性的性状鉴定

试验材料为马铃薯四倍体分离群体，共221份材料，来源于以早熟品种中薯3号 为父本，晚熟品种中薯19号为母本的F1熟性分离后代。221份马铃薯四倍体分离后 代的性状鉴定均按照实施例1的步骤一中的1的判断标准判定。在221份马铃薯四倍 体分离后代中，有53份早熟材料、63份晚熟材料和105份中熟材料，仅53份早熟材 料和63份晚熟材料用于下一步研究。

2、鉴定方法与鉴定结果

分别以53份早熟材料和63份晚熟材料的基因组DNA为模板，采用分子标记 SCAR5-8为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并利用浓度为1.2％的琼脂糖凝 胶对PCR扩增产物进行检测。若扩增出581bp的目的条带，则将材料标记为阳性，否 则标记为阴性。

结果如表3所示：在标记为阳性的54个材料中有46个表型鉴定为早熟，分子标 记检测与表型鉴定结果吻合度达85.2％；在标记为阴性的62个材料中有55个表型鉴 定为晚熟，分子标记检测与表型鉴定结果吻合度达88.7％。116个材料的标记检测结果 与表型鉴定结果的总体吻合度达87.1％，将表型鉴定结果与分子标记检测结果做 Pearson双侧相关分析，相关系数r为0.740，且达极显著水平。

表3、性状鉴定和标记鉴定结果

上述结果表明，分子标记SCAR5-8与四倍体马铃薯熟性性状紧密连锁，能较好的 区分四倍体马铃薯分离群体后代的熟性，可通过标记辅助选择用于四倍体马铃薯熟性 育种，加快育种进程。

二、分子标记SCAR5-8在四倍体马铃薯品种熟性筛选中的应用

1、试验材料与熟性的性状鉴定

试验材料为70份不同熟性的四倍体马铃薯品种，材料来源于中国农科院蔬菜花卉 研究所，信息如表4所示。70份四倍体马铃薯品种的熟性性状均根据该品种审定时所 描述的生育期来判定。统计结果表明：在70份四倍体马铃薯品种中，生育期小于75 天的早熟品种27份，占总材料数的38.6％；生育期大于110天的晚熟品种43份，占 总材料数的61.4％。

表4、四倍体马铃薯品种信息

2、鉴定方法与鉴定结果

分别以70份四倍体马铃薯品种的基因组DNA为模板，以分子标记SCAR5-8为 引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，并利用浓度为1.2％的琼脂糖凝胶对PCR 扩增产物进行检测。若扩增出581bp的目的条带，则标记为阳性，否则标记为阴性。

利用分子标记SCAR5-8对70份四倍体马铃薯品种的检测结果如图4、图5和表5 所示：在标记为阳性的24个品种中有19个表型鉴定为早熟，分子标记检测与表型鉴 定结果吻合度达79.2％；在标记为阴性的46个品种中有38个表型鉴定为晚熟，分子 标记检测与表型鉴定结果吻合度也高达82.6％。70个品种的标记检测结果与表型鉴定 结果的总体吻合度达81.4％，将分子标记检测结果与表型鉴定结果做Pearson双侧相关 分析，相关系数r为0.602，且达极显著水平。

表5、性状鉴定和标记鉴定结果

上述结果表明，分子标记SCAR5-8能较好的区分四倍体马铃薯品种的熟性，该标 记可以用于四倍体马铃薯熟性的标记辅助选择。