功能型仿细胞外层膜立体结构涂层的构建方法

摘要

本发明公开了一种在几乎任何材料表面构建仿细胞外层膜立体结构涂层的方法，其首先将材料浸于多巴胺水溶液中涂覆聚多巴胺，然后将二羧基聚乙二醇HOOC?PEG?COOH或羧基聚乙二醇PEG?COOH，含有活性酯基团及磷酰胆碱基团侧链的仿细胞外层膜结构共聚物PMEN依次在水溶液中与聚多巴胺涂层表面的氨基反应固定在材料表面，形成仿细胞外层膜立体结构抗生物污染涂层，最后用含有氨基的靶向分子与涂层表面聚乙二醇末端羧基共价结合，得到仿细胞外层膜立体结构涂层。本发明提高了材料生物相容性并赋予设计的功能，将该涂层构建于纳米载药颗粒表面，可大幅度提高纳米药物在体内的“隐形”效果及在血液中的循环时间，显著增强在病灶部位的富集释放。

说明书

技术领域

本发明涉及仿细胞外层膜立体结构涂层的构建及性能优化，属于表面改性技术领 域。

技术背景

现有的生物医用材料及装置在临床应用中，依然不同程度的存在感染、凝血和术 后组织增生等问题，这些生物相容性不理想的问题已经成为制约生物医用材料及纳米药物 在临床应用的关键因素。目前，对材料进行表面改性是提高其生物相容性非常有效的方式。 但如何简单、高效地提高改性物质在材料表面的稳定性和生物相容性是当前研究及应用的 关键。

一般而言，改善材料的生物相容性可以通过提高材料表面亲水性，形成水化层，利 用水化层与蛋白质分子等体内分子之间的排斥作用来改善材料在体内的生物相容性。

磷酰胆碱是细胞外层膜中带有等量正、负电荷的亲水官能团，可以结合大量的水 分子形成一层水合层，表现出很好的生物相容性及抗污作用。用含磷酰胆碱基团的聚合物 对材料表面进行亲水改性，使表面不易吸附蛋白质、粘附聚集血小板等反应，从而可消除或 降低材料在体内被识别及发生排异反应，可以有效地改善材料的生物相容性。Gong等人 （JournalofMembraneScience,2014,452,29）用含有磷酰胆碱基团的共聚物（PMBT） 改性聚丙烯中空纤维等材料表面，改性后对蛋白质及血小板等的吸附量降低90以上。该聚 合物对改性与血液直接接触的医疗器械及材料有广阔应用前景。

发明内容

本发明的目的是提出一种建立在任何材料表面构建功能型仿细胞外层膜立体结 构涂层的通用型方法，并进行抗非特异性蛋白质吸附、细菌及其它细胞粘附、靶向作用等， 并建立用表面等离子体共振仪实时测定水溶液中相关数据、进行涂层性能优化的方法。

本发明实现过程如下：

一种仿细胞外层膜立体结构涂层的构建方法：首先将材料浸于多巴胺水溶液中涂覆聚 多巴胺，然后将二羧基聚乙二醇HOOC-PEG-COOH或羧基聚乙二醇PEG-COOH，含有活性酯基团 及磷酰胆碱基团侧链的仿细胞外层膜结构共聚物PMEN依次在水溶液中与聚多巴胺涂层表 面的氨基反应固定在材料表面，形成仿细胞外层膜立体结构抗生物污染涂层，最后用含有 氨基的靶向分子与涂层表面聚乙二醇末端羧基共价结合，得到仿细胞外层膜立体结构涂 层；所述材料选自玻璃、聚碳酸酯、不锈钢、聚四氟乙烯、聚丙烯。

上述聚多巴胺介导涂层构建用浓度0.2~2.0mg/ml，pH7.0~8.5的多巴胺水溶液 在室温下对材料进行浸涂、喷涂及旋涂处理；多巴胺水溶液处理后的材料用水清洗后依次 浸入二羧基聚乙二醇或羧基聚乙二醇、PMEN或直接到PMENP水溶液中与聚多巴胺表面的氨 基以酰胺键结合构建仿细胞外层膜立体结构涂层；聚乙二醇末端羧基经EDC和NHS溶液活化 后与氨基发生酰胺化反应结合。

上述靶向分子为乙二胺化叶酸、肽链、蛋白质或酶。

上述仿细胞外层膜立体结构涂层中聚乙二醇与磷酰胆碱基团的表面密度及其之 间的比例用加入浓度及反应时间来控制，靶向分子的加入量及其反应时间参数用于调控靶 向分子的表面密度及靶向性作用的强弱，其中，涂层表面聚乙二醇含量100~1000ng/cm²， 磷酰胆碱基团含量1000~5000ng/cm²，靶向分子含量20~500ng/cm²。

本发明构建的涂层表面与水接触的前进角为40~65°，后退角为8~30°；对牛血清白 蛋白吸附量减少到2~50ng/cm²，对纤维蛋白原的吸附量减少到5~150ng/cm²，对血小板黏附 量减少80~99.8%，对设计的特异性相互作用增加2~20倍。

本发明的优点：（1）适用范围广。几乎可用于任何材料及形状的物体，包括金属及 其氧化物、玻璃、陶瓷、塑料、多种纳米颗粒及最难粘附的聚四氟乙烯等，是一种材料表面改 性的“万能型”共性技术方法。（2）使用过程简便。可以做到在室温水溶液中浸涂完成对材料 表面改性；也可通过喷涂、旋涂等简单过程进行涂覆。（3）涂层功能化方便灵活、性能可优 化。涂层功能化过程可以逐步进行，也可以组合、集成在聚合物链中一次结合固定在聚多巴 胺表面。调控PEG和磷酰胆碱基团的表面密度及比例，容易实现仿细胞外层膜立体结构涂层 的性能优化；改变或调控表面功能基团如靶向基团等，可转变涂层的功能及优化其性能。 （4）仿生涂层无毒副作用。构成仿细胞外层膜立体结构涂层的材料已研究应用多年，无不良 反应报道。涂层构建是仿贻贝粘附过程在水溶液中进行，无环境污染及有害物残留。

附图说明

图1为功能型仿细胞外层膜立体结构涂层的构建过程示意图；

图2为不同处理过程表面等离子体共振仪中芯片表面吸附分子的吸附量变化示意图。

具体实施方式

本发明仿细胞外层膜立体结构涂层的构建方法如下：

1、聚多巴胺介导涂层的制备：配制0.1~2mg/mL的多巴胺水溶液(pH7.5~8.6)，于室温 下浸涂在拟改性的材料表面，形成稳定的聚多巴胺涂层。

2、在聚多巴胺层表面构建功能型仿细胞外层膜立体结构涂层：

1）把涂有聚多巴胺的材料浸于经过活化的羧基聚乙二醇水溶液中，通过酰胺化反应在 聚多巴胺表面键合设计量的聚乙二醇作为仿细胞外层膜立体结构向外伸展的柔性长链；

2）然后在含有活性酯基团及磷酰胆碱基团侧链的仿细胞外层膜结构共聚物（PMEN）水 溶液中浸涂，继续在涂有聚多巴胺及羧基聚乙二醇的材料表面经酰胺化反应共价结合 PMEN，形成同时含有大量的细胞外层膜磷酰胆碱基团亲水界面和向外伸展的PEG亲水壳层 组成的立体结构涂层。这种具有仿细胞外层膜立体结构的亲水涂层，能像细胞膜那样更有 效地防止与体内成分发生反应，提高材料的生物相容性；

3）最后用含有氨基的靶向分子与涂层表面聚乙二醇末端羧基共价结合，得到抗生物污 染及靶向性兼具的多功能涂层。

3、在聚多巴胺层表面构建功能型仿细胞外层膜立体结构涂层，也可用组合有磷酰 胆碱基团、羧基PEG、靶向基团及邻苯二酚基团的聚合物，在水溶液中浸涂一步完成。这种用 组成比例已知的多功能聚合物构建功能型仿细胞外层膜立体结构涂层的工艺过程简单，容 易进行性能优化筛选。

4、形成涂层的过程及涂层的性能评价，可直接用表面等离子体共振仪在线实时测 定。功能型仿细胞外层膜立体结构涂层的构建过程如图1所示。不同处理过程中芯片表面吸 附分子的吸附量变化示意图如图2所示。依据涂层表面对非特异性蛋白吸附量的降低程度 及对特异性分子结合的增加程度来筛选优化涂层性能。

本发明用分步反应及集成后一步反应，在聚多巴胺介导涂层表面构建含有磷酰胆 碱基团、聚乙二醇链和靶向基团的多功能仿细胞外层膜立体结构涂层的工艺过程简单，适 用于多种材料表面改性，在提高生物相容性的同时赋予最佳的设计功能特性。在提高人工 器官及相关材料、纳米药物载体、分离材料及其它材料表面的生物相容性研究及生产领域 具有广阔的应用前景。

更具体地说，仿细胞外层膜立体结构涂层的构建方法如下：

1、聚多巴胺介导涂层的制备：用商品试剂盐酸多巴胺配制0.1~2mg/mL的多巴胺水溶 液(pH7.5~8.6)，于室温下将拟改性的材料浸没于溶液中1~20小时，形成一定厚度、在水中 稳定的聚多巴胺涂层；分离取出后用水淋洗，干燥备用。

2、仿细胞外层膜立体结构涂层的构建：1）将涂有聚多巴胺的材料浸于经过EDC和 NHS溶液活化的羧基聚乙二醇（商品试剂）水溶液中，通过酰胺化反应在聚多巴胺表面键合 设计量的聚乙二醇作为仿细胞外层膜立体结构向外伸展的柔性长链。固定在表面的聚乙二 醇链密度由溶液浓度（2~20mg/mL）及反应时间（10~60min）调控，可用表面等离子体共振 仪实时测定。2）然后在含有活性酯基团及磷酰胆碱基团侧链的仿细胞外层膜结构共聚物 （PMEN）水溶液中浸涂，继续在涂有聚多巴胺及羧基聚乙二醇的材料表面经酰胺化反应共价 结合PMEN，形成同时含有大量的细胞外层膜磷酰胆碱基团亲水界面和向外伸展的PEG亲水 壳层组成的立体结构涂层。PMEN按文献方法（J.Mater.Chem.B,2015,3,2350–2361） 制备，配制成2~20mg/mL水溶液与材料表面反应0.5~6h。反应固定在表面的PMEN也可用表 面等离子体共振仪实时测定。3）最后用含有氨基的靶向分子水溶液（0.1~5mg/mL）与涂层 表面聚乙二醇末端羧基共价结合，得到抗生物污染及靶向性兼具的多功能涂层。靶向分子 的结合量同样可用浓度及反应时间调控，用用表面等离子体共振仪实时测定。

3、形成涂层的过程及涂层的性能数据，可直接用表面等离子体共振仪在线实时测 定。依据涂层表面对非特异性蛋白吸附量的降低程度及对特异性分子结合的增加程度来筛 选优化涂层性能。

实施例1：含活性脂基团及磷酰胆碱基团二元聚合物PMEN的制备。取一个的三颈烧 瓶，三口分别加滴液漏斗、带干燥管的回流管、通氮气的装置，100mL干燥洁净三颈烧瓶中 加入20ml无水乙醇,于70℃恒温，保持此温度30min，称取加入0.05gAIBN溶于6ml THF溶液。滴加40ml含活性酯单体MEONP1.05g、含磷酰胆碱基团单体MPC2.98g无水乙 醇溶液，在4h内滴加完毕，反应20h。将所得PMEN二元随机共聚物溶液浓缩后装入截留分 子量为7000的透析袋，用pH3.93磷酸水溶液透析48h。冷冻干燥后得PMEN絮状固体。¹HNMR 测得功能化聚合物中MPC、MEONP组分的摩尔含量分别为89%及11%。

实施例2：含有活性酯功能聚合物PMENP的制备。在100mL三颈瓶中加入10mL无水 乙醇，通氮气，磁力搅拌并逐渐升温至70℃。依次称取活性酯单体NPCEMA0.140g、含有羧 基链单体PEGA2.726g和MPC0.805g，并加入34mL无水乙醇使其溶解。称取0.037g AIBN，加到单体的混合液中。用滴液漏斗滴加单体的混合溶液，约2h滴加完毕。改为密闭体 系，使其继续反应24h。停止反应后，取出部分反应液装入截留分子量为7000的透析袋中， 在pH3~4的酸性水溶液中透析。冷冻干燥。D₂O溶剂中¹H-NMR表征其结构，组成为含有活性酯 单元、MPC及PEGA摩尔含量分别为12%、69%及29%的聚合物PMENP。

实施例3：聚多巴胺介导涂层的在线构建。配制2mg/mL的多巴胺Tris-HCl(pH 8.2)溶液，以20μL/min的流速注射流过等离子体共振仪芯片金表面30min，流动相洗脱 平衡30min后测得聚多巴胺在表面的固定量为148ng/cm²。

实施例4：聚多巴胺涂层的浸涂构建。配置1mg/mL的多巴胺水溶液(pH8.5)，用2 ×2cm²的聚丙烯片室温浸涂6h。蒸馏水中浸泡、淋洗后室温晾干。测定静态接触角平均为 46°，与空白聚丙烯片的静态接触角101°相比有明显降低。

实施例5：聚乳酸纳米颗粒表面涂覆聚多巴胺涂层。配置0.2mg/mL的多巴胺水溶 液(pH8.2)5mL，加入聚乳酸纳米颗粒水分散液使其浓度为0.5mg/mL。室温缓慢震荡24 h后离心除去（聚）多巴胺水溶液，聚乳酸纳米颗粒由涂覆前的白水变为棕褐色。再分散在 pH6.0水中后zeta由之前的负值变为正值。同时，动态光散射测得纳米颗粒粒径由涂覆前 的92nm增大到96纳米。这些结果均证明聚乳酸纳米颗粒表面涂覆聚多巴胺涂层。

实施例6：玻璃表面喷涂聚多巴胺涂层。配置1.5mg/mL的多巴胺水溶液(pH7.5)， 喷涂在玻璃片（1.8×1.8cm²）表面，于室温湿度90%环境中保存2天。蒸馏水中浸泡、超纯水 淋洗后室温晾干。测定水中静态接触角平均为39±2°，与空白玻璃片的静态接触角平均28 ±2°相比变化显著。

实施例7：构建羧基聚乙二醇涂层。配制2mg/mL羧基聚乙二醇的PBS（pH6.5）水 溶液，其中包含10mg/ml的EDC和10mg/mlNHS来活化羧基。将该溶液以10μL/min流速流 过实施例3构建的聚多巴胺介导涂层40min，流动相洗脱平衡30min后测得羧基聚乙二醇 在表面的固定量为66ng/cm²。

实施例8：表面键合仿细胞外层膜结构聚合物PMEN91。配制5mg/mLPMEN91聚合物 水溶液（pH6.5），充分溶解后以5μL/min流速流过实施例7构建的羧基聚乙二醇涂层表面 200min，流动相洗脱平衡30min后测得PMEN91在表面的固定量为380ng/cm²。构建的仿细 胞外层膜立体结构涂层表面膜在线测定1.0mg/mLBSA及Fg蛋白的吸附量分别为0.6ng/ cm²及7.0ng/cm²。与未改性的金表面相比，该仿细胞外层膜立体结构涂层表面对这些非特 异性蛋白质的吸附抑制率达到96%以上。

实施例9：仿细胞外层膜立体结构涂层表面功能化。实施例8构建的仿细胞外层膜 立体结构涂层表面聚乙二醇羧基经EDC和NHS活化后，以5μL/min流速通入0.2mg/mL乙二 胺化叶酸的PBS水溶液（pH6.5）60min。流动相洗脱平衡30min后测得肿瘤靶向分子叶酸 在表面的固定量为16.4ng/cm²。该表面对0.5μg/mL叶酸受体蛋白αFR的吸附量高达66 ng/cm²，靶向作用显著提升。

实施例10：含有活性酯功能的仿细胞膜立体结构聚合物PMENP涂层的在线构建。配 制5mg/mLPMENP聚合物PBS水溶液（pH6.5），在表面等离子体共振仪上以5μL/min流速流 过实施例3构建的聚多巴胺介导涂层表面180min，流动相洗脱平衡30min后测得PMENP在 表面的固定量为236ng/cm²。该涂层表面1mg/mLBSA蛋白的吸附量为3ng/cm²。

实施例11：仿细胞外层膜立体结构涂层构建：配制4mg/mLPMENP聚合物PBS水溶 液（pH6.5），用涂有聚多巴胺涂层的聚碳酸酯浸涂24h。取出纯水淋洗5次后干燥，XPS精细 图谱显示表面有明显的磷酰胆碱基团的季铵基信号，表明PMENP聚合物在水溶液中结合到 基层的聚多巴胺介导层表面。

实施例12：涂覆聚多巴胺涂层的聚乳酸纳米颗粒表面构建仿细胞外层膜涂层。用 实施例5制备的涂覆聚多巴胺涂层的聚乳酸纳米颗粒水再分散液及PMEN91水溶液，配置含 纳米颗粒1mg/mL，PMEN910.2mg/mL，pH7.2的水溶液，室温磁力搅拌24h。动态光散射 数均粒径有反应前的96nm增加到119纳米；纳米颗粒膜表面的XPS精细图谱上液出现了磷 酰胆碱基团的季铵基及磷元素信号峰，证明仿细胞膜聚合物涂覆在聚乳酸纳米颗粒表面的 聚多巴胺介导层上。