氧化石墨烯纳米材料和阳离子季铵化壳聚糖的复合纳米材料

摘要

本申请提供了由氧化石墨烯(GO)纳米材料与阳离子季铵化壳聚糖共价结合组成的复合纳米材料，还提供了制备该复合纳米材料的方法，含有该复合纳米材料的抗微生物组合物，以及该抗微生物组合物用于抑制环境微生物生长的用途。

说明书

相关申请交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请61/791784的优先权，该申请的全 部内容以引用方式并入并通用于本申请。

技术领域

本申请涉及氧化石墨烯纳米材料与阳离子季铵化壳聚糖共价结合的复合纳米材料，及 其制备方法。本申请还涉及含有该复合纳米材料的抗微生物组合物。

背景技术

石墨烯一般是指六边形sp2键合的碳原子单层。石墨烯的独特物理，化学，电学和机械 性质使其在大量领域中得到应用，例如透明导电膜，传感器，晶体管，太阳能电池，电容器， 和材料加固。

除了电子应用，石墨烯及其衍生物，例如氧化石墨烯(GO)已被考虑用于生物医学应用 中，例如，纳米药物，光热疗法，药物递送和细菌抑制。然而，原始石墨烯和氧化石墨烯的抗 微生物功效较差。即使将生物杀伤剂剂例如银纳米粒子掺入石墨烯/氧化石墨烯中，以经由 释放银离子来提高石墨烯/氧化石墨烯的抗微生物效力，抗微生物试剂的持续释放有毒于 哺乳动物细胞，且长远来看会造成环境危害。

需要新的抗微生物剂种类，以应付多重抗药性超级细菌以及对要求消毒剂更安全更有 效的监管压力。新一代抗微生物药物应具有高广谱抗微生物效力，良好的生物相容性和对 病原微生物抗性的低敏感性。在现有抗微生物剂中，抗生素通常针对特定的生化途径，很容 易引起细菌的耐药性。重金属如金则不能用于禁止外来有毒物质存在的应用。

目前尚无报告具有较高抗微生物效力、低毒性、良好耐盐性，易回收性和可重用性的有 效广谱抗微生物剂。对该抗微生物剂的需要存在于各种应用中，包括水处理，环境治疗和修 复，食品加工，以及防腐处理。

]鉴于上述情况，需要一种可用于生物医学应用的改进石墨烯基材料及其制备方法，以 克服或至少减轻一种或多种上述问题。

发明内容

本申请的第一方面中，提供由氧化石墨烯纳米材料与阳离子季铵化壳聚糖共价结合组 成的复合纳米材料，其中所述阳离子季铵化壳聚糖可表示为式(I)

其中，每个X独立选自–NH-C(O)-CH₃,-N(R¹)(R²)和-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)，其中至少一个X为- N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)；R¹,R²,R³,R⁴和R⁵独立选自H和C_1-18烷基；以及k为3～3000之间的整数。

本申请的第二方面中，提供用于制备氧化石墨烯纳米材料与阳离子季铵化壳聚糖共价 结合组成的复合纳米材料的方法，其中，所述阳离子季铵化壳聚糖可表示为式(I)：

其中，每个X独立选自–NH-C(O)-CH₃,-N(R¹)(R²)和-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)，其中至少一个X为- N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)；R¹,R²,R³,R⁴和R⁵独立选自H和C_1-18烷基；以及k为3～3000之间的整数；所述 方法包括，在偶联剂的存在下，使用式(I)的阳离子季铵化壳聚糖与氧化石墨烯反应，以令 所述阳离子季铵化壳聚糖与所述氧化石墨烯共价结合。

本申请的第三方面中，提供含有根据第一方面所述的复合纳米材料或根据第二方面所 述方法制备的复合纳米材料的抗微生物组合物。

本申请的第四方面中，提供根据第三方面所述的抗微生物组合物用于抑制环境微生物 生长的用途。

附图说明

参考以下详细描述，以及非限制性实施例和附图，能够更好地理解本发明。

图1A展示了实施例中的阳离子季铵化壳聚糖(QC)：二甲基癸基铵壳聚糖(DMDC)化学结 构。如图所示，R可以是–CH₂(CH₂)₈CH₃或–CH₃，m:n:p比例可以是3:5:2。

图1B展示了在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)的存在下，通过氨基偶联反应，合成氧化石墨烯-季铵化壳聚糖(GO-QC)纳米复合物的 化学反应。如图所示，具有如图1A所示结构的QC在EDC和NHS的存在下与GO反应，形成Go-QC 纳米复合物。

图2A是原始玻璃片的照片。

图2B是透明GO-QC(1:5)涂层玻璃片的照片。

图2C是原始玻璃片的扫描电镜(SEM)图像。图中的比例尺长度为1μm。

图2D是GO-OC涂层玻璃片的SEM图像。图中的比例尺长度为1μm。

图2E中展示了大肠杆菌、金黄葡萄球菌和白色念珠菌与GO、GO-QC(10:1)、GO:QC(10: 2.5)、GO:QC(10:5)andGO:QC(10:10)的Go和GO-QC涂层接触后的对数杀灭和杀灭百分比 (％)的图表。

图3是阳离子GO-QC纳米复合物破坏负电荷细菌包膜，使其死亡的示意图。

图4是季铵化壳聚糖(二甲基癸基铵壳聚糖)的合成示意图。条件(I)：在NaBH₄的存在 下，室温下使用RCHO进行1.5小时N-烷基化反应。条件(II)50℃下使用NaOH,NaI和CH₃I进行 24小时的季铵化反应。

图5是合成所得季铵化壳聚糖(二甲基癸基铵壳聚糖)的凝胶渗透色谱(GPC)图谱。Y轴： 强度(mV)；X轴：洗脱时间(分钟)。

图6A是GO和GO-QC(1:5)的场发射扫描电镜(FESEM)图像。图中的比例尺长度为1μm。图 6B是GO和GO-QC(1:5)的带厚度测定的原子力显微镜(AFM)图像。

图6C展示了GO,QC和GO-QC(1:5)的傅里叶变换红外光谱(FTIR)图谱。

图6D展示了(i)GO,(ii)GO-QC(1:5)和(iii)QC在氮气保护下以每分钟10℃的加热速度 进行的热衷量分析(TGA)曲线。Y轴：重量损失(％)；X轴：温度(℃)

图7A是GO的SEM图像。图中的比例尺长度为1μm。

图7B是GO的粒径分布图。每种样品至少测量了100个纳米片来得到平均粒径和分布。Y 轴：频率(％)；X轴：粒径(nm)。

图7C是GO-QC(1:5)的SEM图像。图中的比例尺长度为1μm。

图7D是GO-QC(1:5)的粒径分布图。每种样品至少测量了100个纳米片来得到平均粒径 和分布。Y轴：频率(％)；X轴：粒径(nm)。

图8A是与GO,QC和GO-QC系列(100μgml^-1)以10⁸CFUml^-1培养1小时后，对大肠杆菌、金 黄葡萄球菌和白色念珠菌的微生物杀灭率。Y轴：杀灭百分比；X轴：GO；GO-QC(1:1)；GO:QC (1:2.5)；GO:QC(1:5)；GO:QC(1:10)；和QC。

图8B是GO；GO-QC(1:1)；GO:QC(1:2.5)；GO:QC(1:5)；GO:QC(1:10)；和QC对大肠杆菌、金 黄葡萄球菌和白色念珠菌的最低杀菌浓度(MBC，单位：μgml^-1)。插入图为GO-QC(1:5)；GO- QC(1:10)；和QC图表的放大视图。

图8C是GO,QC和GO-QC(1:5)(100μgml^-1)在NaCl中1小时的杀菌活性，以及GO,QC和GO- QC(1:5)(100μgml^-1)分散系/溶液在NaCl(150mM)中1小时的照片。Y轴：大肠杆菌杀灭百分 比(％)；X轴：NaCl浓度(mM)。

图8D是GO-QC(1:5)(100μgml^-1)重复对抗大肠杆菌10次后的可再用杀菌活性，处理后 的细菌以离心(2000×g,10min)分离。Y轴：大肠杆菌杀灭百分比(％)；X轴：重复使用次数。

图8E是大肠杆菌、金黄葡萄球菌和白色念珠菌对GO；GO-QC(1:1)；GO:QC(1:2.5)；GO:QC (1:5)；GO:QC(1:10)；和QC的选择性。

图8F是以100μgml^-1GO-QC(1:5)培养点平滑肌细胞的体外细胞毒性研究，通过细胞计 数试剂盒-8(CellCountingKit-8，CCK-8)检验细胞活性，使用组织培养聚苯乙烯(TCPS) 作为对照(p>0.05,无显著差异)。Y轴：CCK-8吸光度；X轴：天数。插入图是在(i)不存在和 (ii)存在100μgml^-1GO-QC(1:5)的情况下培养7天的平滑肌细胞LIVE/DEAD分析。

图9中，以GO,QC或GO-QC(1:5)分散系(100μgml^-1)培养大肠杆菌不同时长(0.5～24小 时)，来研究抗微生物活性随时间的变化(杀灭曲线)。GO,QC和GO-QC对大肠杆菌的杀灭百分 比(％)随着培养时间单调上升。QC和GO-QC(1:5)很快达到高杀灭率，并在4小时后达到 100％。GO的杀灭百分比增加更具有渐进性，在12小时后达到70％杀灭率并持平。

图10A展示了氯化钾(KCl)中1小时后GO,QC和GO-QC(1:5)(100μgml^-1)的杀菌活性。

图10B展示了氯化钙(CaCl₂)中1小时后GO,QC和GO-QC(1:5)(100μgml^-1)的杀菌活性。

图10C展示了氯化镁(MgCl₂)中1小时后GO,QC和GO-QC(1:5)(100μgml^-1)的杀菌活性。

图11A展示了(i)未处理和以100μgml^-1的(ii)QC,(iii)GO和(iv)GO-QC(1:5)处理1小 时后的大肠杆菌形态FESEM图像，其放大率为10000倍和40000倍(比例尺分别表示5μm长度 和1μm长度)。

图11B是QC和GO-QC(1:5)引起的三磷酸腺苷(ATP)随时间泄漏的图表。

图11C是GO,QC和GO-QC系列：GO-QC(1:1)；GO:QC(1:2.5)；GO:QC(1:5)；GO:QC(1:10)的 动作电位(mV)图表。

图11D展示了荧光试验。离心分离的菌粒与QC溶液接触后染色，但与GO-QC接触后不染 色。GO-QC和QC分子均用荧光染料标记(TexasRed-X)。

图12A是大肠杆菌细胞与GO-QC(1:5)接触第0分钟的FESEM观测图像。

图12B是大肠杆菌细胞与GO-QC(1:5)接触1小时后的FESEM观测图像。如图所示，大肠杆 菌细胞的形态发生变化。

图12C是离心去除GO-OC纳米复合物后的大肠杆菌细胞FESEM观测图像。箭头表示细菌 膜上的损伤。

具体实施方式

本申请提供一种由氧化石墨烯纳米材料与阳离子季铵化壳聚糖的共价结合组成的复 合纳米材料。本文所公开的复合纳米材料显示出对微生物，如革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌 和真菌的广谱抗微生物活性。该复合纳米材料具有协同效应，其中该复合纳米材料的抗微 生物功效优于其组成成分氧化石墨烯和季铵化壳聚糖。此外，壳聚糖基团赋予该复合纳米 材料良好的生物相容性，表现为降低的溶血活性。

根据上述考虑，本发明的第一方面涉及由氧化石墨烯纳米材料与阳离子季铵化壳聚糖 共价结合组成的复合纳米材料。

本申请所述术语“复合纳米材料”是指由至少两种由一个或多个化学键相互连接的组 分形成的纳米级材料，所述纳米材料的功能和/或结构特性不同于单个组分。纳米材料，本 申请中又称为纳米级材料，是指至少一个维度在纳米范围内的材料。

该复合纳米材料由氧化石墨烯纳米材料与阳离子季铵化壳聚糖的共价结合组成。。

本申请所称术语“石墨烯”一般是指石墨碳的一种形式，其中碳原子彼此共价键合，使 得键合的碳原子形成两维片层。碳原子可以通过sp2键彼此键合，并且可以形成6元环作为 重复单元，并且还可以包括5元环和/或7元环。在其晶体形式中，两片或多片石墨烯可以堆 叠在一起，以形成多个堆叠层。通常，石墨烯的侧端部被氢原子所饱和。

氧化石墨烯(GO)指的是石墨烯的氧化形式，并且可以包括含氧基团，如羟基，环氧基， 羧基，和/或酮基。术语“氧化石墨烯”还包括还原后的氧化石墨烯，其为氧化石墨烯的还原 形式，诸如已经进行还原处理从而部分地或基本还原的氧化石墨烯。

氧化石墨烯纳米材料与阳离子季铵化壳聚糖共价结合，其中所述阳离子季铵化壳聚糖 可表示为式(I)

其中，每个X独立选自–NH-C(O)-CH₃,-N(R¹)(R²)和-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)，其中至少一个X为- N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)；R¹,R²,R³,R⁴和R⁵独立选自H和C_1-18烷基；以及k为3～3000之间的整数。

术语“壳聚糖”，也称为聚-D-葡糖胺或聚葡糖胺，指的是一种衍生自几丁质的生物聚合 物，它由β-1,4-糖苷连接的葡糖胺以及可选地还由N-乙酰葡糖胺残基(2-乙酰氨基-2-脱 氧-β-D-吡喃葡萄糖残基)所组成，其中葡糖胺与N-乙酰葡糖胺残基的比例大于1，即X＝-N (R¹)(R²)和X＝-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)的单体与X＝–NH-C(O)-CH₃的单体的比例大于1。

壳聚糖具有良好的生物降解性，生物相容性和抗微生物活性，使其可用于生物医学应 用。季铵化壳聚糖，在此也称为季铵壳聚糖，是指通过在壳聚糖的游离羟基或氨基上引入季 铵基团而制备所得的壳聚糖衍生物。作为氨基季铵化的结果，季铵化壳聚糖的多糖主链上 具有永久的正电荷。由于这个永久正电荷的存在，季铵化壳聚糖也可以称为阳离子季铵化 壳聚糖。

参照式(I)，式中每个X独立地选自–NH-C(O)-CH₃,-N(R¹)(R²)和-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)，其中 至少一个X为-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)；R¹,R²,R³,R⁴和R⁵独立选自H和C_1-18烷基；以及k为3～3000之间 的整数。

术语“C₁-C₁₈烷基”是指具有1至18个碳原子的完全饱和脂肪族烃，例如，这意味着该烷 基包含1个碳原子，2个碳原子，3个碳原子等等直到包括18个碳原子。所述C₁-C₁₈烷基可以是 直链或支链的，并且可以被取代或未取代。示例性的取代基包括，但不限于，C_1-6脂族基团， 羟基，烷氧基，氰基，卤素基，硝基，甲硅烷基和氨基，包括单-和双-取代的氨基。具体的示例 性取代基包括C₁-C₁₀烷氧基，C₅-C₁₀芳基，C₅-C₁₀芳氧基，巯基，C₅-C₁₀芳基，硫代，卤素如氟、 氯、溴、碘，羟基，氨基，磺酰基，硝基，氰基，和羧基。烷基的例子可以是，但不限于，甲基，乙 基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，s-丁基，叔丁基，正己基，正庚基，正辛基，正壬基或正 癸基等。

参照式(I)，k为3～3000的整数。例如，k可以是从3至2500，3～2000，3～1500，3～1000， 3～500，100～2500，为500～3000，为500～2000，1000～3000，1000～2000，1500～3000， 2000～3000，或2500～3000的整数。

在多个实施例中，所述R¹和R²选自H和C_1-18烷基，优选为H；R³,R⁴和R⁵各为独立的C_1-10烷 基。在特定实施例中，所述R¹和R²为H，且R³,R⁴和R⁵各为独立的C_1-10烷基。

在多个实施例中，所述R³和R⁴为甲基；R⁵为C_1-10烷基，优选为甲基，乙基，正丙基，正丁 基，正戊基，正己基，正庚基，正辛基，正壬基或正癸基。在特定实施例中，所述R³和R⁴为甲基； R⁵为甲基，乙基，正丙基，正丁基，正戊基，正己基，正庚基，正辛基，正壬基或正癸基。

X＝-N(R¹)(R²)和X＝-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)的单体与X＝–NH-C(O)-CH₃的单体的比例范围为 2：1～5：1，优选为约4:1。例如，X＝-N(R¹)(R²)和X＝-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)的单体与X＝–NH-C(O)- CH₃的单体的比例范围可以是约2：1～约4：1，约2：1～约3：1，约3：1～约4：1，或约3：1～约5： 1；约2：1，约3：1，约4：1，或约5：1。在特定实施例中，X＝-N(R¹)(R²)和X＝-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)的 单体与X＝–NH-C(O)-CH₃的单体的比例为约4：1。

所述X＝-N(R¹)(R²)的单体与X＝-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)的单体的比例范围为1：4～4：1，优选 为约1:2～1:1。例如，X＝-N(R¹)(R²)的单体与X＝-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)的单体的比例范围可以是 在约1：3～约4：1，约1：2～约4：1，约1：2～约3：1，约1：2～约2：1，约1：2～约1：1；约1:2，或约 1:1。在特定实施例中，X＝-N(R¹)(R²)的单体与X＝-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)的单体的比例范围为约 1：2～约1：1。

该氧化石墨烯纳米材料共价结合到阳离子季铵化壳聚糖。术语“共价结合”是指氧化石 墨烯纳米材料和阳离子季铵化壳聚糖之间形成一个或多个共价键。阳离子季铵化壳聚糖可 以通过酰胺键共价结合到所述氧化石墨烯。

如上所述复合纳米材料的抗微生物功效优于其构成成分氧化石墨烯和季铵化壳聚糖。 通过结合氧化石墨烯与阳离子季铵化壳聚糖，原始氧化石墨烯的抗微生物效力提高。在不 受到理论束缚的前提下，可以推测，季铵化壳聚糖上的阳离子电荷在与带负电荷的包膜接 触，带来了静电驱动。阳离子复合纳米材料和负电荷微生物细胞之间的吸引力，提高了复合 纳米材料与微生物细胞之间接触或碰撞的发生率。由此，所述氧化石墨烯纳米材料的锐边 被驱动到微生物细胞包膜，破坏微生物细胞膜。膜完整性损失和内部成分的泄漏最终导致 细胞死亡，从而提高复合纳米材料的抗微生物功效。

要提高抗微生物功效，也可以通过以季铵化壳聚糖修饰氧化石墨烯，促进复合纳米材 料在水性环境中的分散，从而克服氧化石墨烯在溶液中的聚集倾向。此外，季铵化壳聚糖还 赋予复合纳米材料良好的生物相容性。

在一个实施例中，所述阳离子季铵化壳聚糖包含如通式(II)所示的二甲基癸基铵壳聚 糖，或基本由其组成：

其中，

R选自–CH₂(CH₂)₈CH₃和–CH₃；以及

m:n:p比例为3:5:2。

所述复合纳米材料中，氧化石墨烯与所述阳离子季铵化壳聚糖的重量比例范围为约1： 2～约1:3。例如，所述复合纳米材料中，氧化石墨烯与所述阳离子季铵化壳聚糖的重量比例 范围为约1:2～约1:2.8,约1:2～约1:2.5,约1:2～约1:2.3,约1:2.05～约1:2.25,或约1: 2.05～约1:2.2,约1:2.07,约1:2.1,约1:2.15,或约1:2.2。在特定实施例中，所述复合纳米 材料中，氧化石墨烯与所述阳离子季铵化壳聚糖的重量比例范围为约1：2.05～约1:2.2。

在本申请的第二方面中，提供用于制备氧化石墨烯纳米材料与阳离子季铵化壳聚糖共 价结合组成的复合纳米材料的方法，其中，所述阳离子季铵化壳聚糖可表示为式(I)：

其中，每个X独立选自–NH-C(O)-CH₃,-N(R¹)(R²)和-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)，其中至少一个X为- N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)；R¹,R²,R³,R⁴和R⁵独立选自H和C_1-18烷基；以及k为3～3000之间的整数。

如上所述，R¹和R²选自H和C_1-18烷基，优选为H；R³,R⁴和R⁵各为独立的C_1-10烷基。在特定实 施例中，R³和R⁴为甲基；R⁵为C_1-10烷基，优选为甲基，乙基，正丙基，正丁基，正戊基，正己基， 正庚基，正辛基，正壬基或正癸基。

在多个实施例中，所述X＝-N(R¹)(R²)和X＝-N⁺(R³)(R⁴)(R⁵)的单体与X＝–NH-C(O)-CH₃的单体的比例范围为2：1～5：1，优选为约4:1。所述X＝-N(R¹)(R²)的单体与X＝-N⁺(R³)(R⁴) (R⁵)的单体的比例范围为1：4～4：1，优选为约1:2～1:1。

在特定实施例中，所述阳离子季铵化壳聚糖包含如通式(II)所示的二甲基癸基铵壳聚 糖，或基本由其组成：

其中，R选自–CH₂(CH₂)₈CH₃和–CH₃；以及m:n:p比例为3:5:2。

所述方法包括，在偶联剂的存在下，使用式(I)的阳离子季铵化壳聚糖与氧化石墨烯反 应，以令所述阳离子季铵化壳聚糖与所述氧化石墨烯共价结合。

偶联剂可以是能够共价结合阳离子季铵化壳聚糖和氧化石墨烯纳米材料的任何合适 化合物。在多个实施例中，该偶联剂是碳二亚胺化合物。本申请所称术语“碳二亚胺化合物” 是指具有至少一种通式为-N＝C＝N-的碳二亚胺功能团的水溶性有机化合物。在特定实施 例中，所述偶联剂包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。

可以使用允许阳离子季铵化壳聚糖与氧化石墨烯纳米材料共价结合的任何合适的碳 二亚胺化合物量。在多个实施例中，碳二亚胺化合物的浓度为约100mM至约2000mM，诸如约 100mM至约1500mM，约100mM至约1000mM，约100mM至约500mM，约5001mM至约2000mM，约500mM 至约1500mM，约500mM至约1000mM，约1000mM至约2000mM，约1000mM至约1500mM，约500mM至 约1500mM，或约1000mM至约1500mM。

在一些实施例中，所述偶合剂包含1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，可以在N-羟 基琥珀酰亚胺的存在下，进行阳离子季铵化壳聚糖与氧化石墨烯纳米材料的共价结合反 应。优选地，使用N-羟基琥珀酰亚胺作为稳定剂，以稳定该反应过程中形成的活性中间体。

在多个实施例中，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度在约100mM至约2000mM的范围内。

所述阳离子季铵化壳聚糖通过酰胺键与所述氧化石墨烯共价结合。

可以使用任何合适量的氧化石墨烯和阳离子季铵化壳聚糖来形成复合纳米材料。在多 个实施例中，所述氧化石墨烯与所述阳离子季铵化壳聚糖的重量比例范围为约1：1～约1: 10。例如，氧化石墨烯与所述阳离子季铵化壳聚糖的重量比例范围可以在约1：1至大约1：8， 约1：1至约1：5，约1：1至约1：3，约1:3至约1:10，约1:5至约1:10，或约1:8至约1:10。

在本申请的第三方面中，提供含有根据第一方面所述的复合纳米材料或根据第二方面 所述方法制备的复合纳米材料的抗微生物组合物。

抗微生物组合物中的复合纳米材料的量可以根据预期应用而改变。在多个实施例中， 所述组合物中的复合纳米材料浓度范围为about20μgml^-1toabout3000μgml^-1。例如， 所述组合物中的复合纳米材料浓度范围可以是约20μgml^-1～约3000μgml^-1_,约100μgml^-1～约3000μgml^-1,约500μgml^-1～约3000μgml^-1,约1000μgml^-1～约3000μgml^-1,约1500μ gml^-1～约3000μgml^-1,或约2000μgml^-1～约3000μgml^-1.在特定实施例中，所述组合物中 的复合纳米材料浓度范围可以是约250μgml^-1～约350μgml^-1。

本申请的又一方面中，提供根据第三方面所述的抗微生物组合物用于抑制环境微生物 生长的用途。术语“微生物(microorganism)”和“微菌(microbe)”在本文可互换使用，并且 是指单细胞或生活在如细菌，真菌，抗议，或古细菌的细胞生物群落中的生物体。

在多个实施例中，微生物选自革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，真菌，及其组合。所述抗微 生物组合物可以用于治疗或预防对象或生物体的细菌或真菌感染，或细菌和真菌感染的方 法中。在此情况下，所述真菌感染可以由酵母菌或非酵母菌真菌引起。所述真菌感染可以例 如由以下种类的真菌引起：白色念珠菌(Candidaalbicans),热带念珠菌(Candida tropicalis),葡萄牙假丝酵母菌(Candida(Clasvispora)lusitaniae),季也蒙假丝酵母菌 (Candida(Pichia)guillermondii),长孢洛德酵母菌(Lodderomyceselongisporus),汉逊 德巴利酵母菌(Debaryomyceshansenii),树干毕赤酵母菌(Pichiastipitis),烟曲霉菌 (Asperigillusfumigatus),皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis),斑替枝孢霉菌 (Cladophialophorabantiana),粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis),隐球菌 (Cryptococcusneoformans),镰孢属(Fusariumspp.),小孢子菌属(Microsporumspp.), 马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)或毛癣菌(Trichophytonspp)。

细菌感染可以是由革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌引起的。术语“革兰氏阳性细菌”是指 在革兰氏染色测定中染成紫色(阳性)的细菌细胞。革兰氏燃料与革兰氏阳性菌的细胞壁中 富含的肽聚糖结合。与此相反，“革兰氏阴性细菌”的细胞壁肽聚糖含量低，因此革兰氏阴性 细菌在革兰氏染色测定中染上的是复染色。细菌感染可以是，例如，由以下细菌属引起：不 动杆菌属(Acinetobacter)，放线菌属(Actinomyces)，气单胞菌属(Aeromonas)，博带式杆 菌属(Bordetella)，包柔氏螺旋体属(Borrelia)，布鲁氏菌属(Brucella)，伯g氏菌属 (Burkholderia)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，衣原体属(Chlamydia)，梭菌属 (Clostridium)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，肠球菌属(Enterococcus)，欧文氏菌属 (Erwinia)，埃希氏菌属(Escherichia)，弗朗西斯氏菌属(Francisella)，嗜血杆菌属 (Haemophilus)，螺杆菌属(Helicobacter)，g雷伯氏杆菌属(Klebsiella)，军团杆菌属 (Legionella)，钩端螺旋体属(Leptospira)，李斯特菌属(Listeria)，分枝杆菌属 (Mycobacterium)，支原体属(Mycoplasma)，奈瑟氏菌属(Neisseria)，假单胞菌属 (Pseudomonas)，立g次体属(Rickettsia)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属 (Shigella)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，链球菌属(Streptococccus)，密螺旋体属 (Treponema)，韦荣氏球菌属(Veillonella)，或耶尔森氏菌属(Yersinia)。在特定实施例 中，感染是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)，绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，洋葱伯g霍尔德菌(Burkholderia cepacia)，肺炎g雷伯菌(Klebsiellapneumonia)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)，菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)，或大肠杆菌(Escherichiacoli)引起的。

在特定实施例中，所述微生物包括革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌或其组合，或由革兰氏 阴性菌，革兰氏阳性菌或其组合组成。如上所述，复合纳米材料的季铵化壳聚糖上的阳离 子，与带负电荷的微生物细胞包膜接触后，产生静电驱动。由此一来，所述氧化石墨烯纳米 材料的尖锐边缘被驱动到微生物细胞包膜，进一步破坏微生物的细胞膜。膜完整性损失和 内部成分泄漏导致细胞最终死亡，从而提高复合纳米材料的抗微生物功效。

对氧化石墨烯的敏感性差异，可通过微生物之间的细胞壁结构差异来解释。与真菌相 比，对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性菌的抗微生物效力更好，这是因为细菌细胞具有外膜 和胞质膜(革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌)或由一层肽聚糖保护的胞质膜(革兰氏阳性菌，如 金黄色葡萄球菌)，这使得它们更容易受到氧化石墨烯纳米材料的锐利边缘的攻击和破坏。 另一方面，真菌，诸如白色念珠菌的胞质膜，被厚碳水化合物细胞壁保卫，这很可能给予细 胞针对氧化石墨烯纳米材料的物理应力的更多保护，从而解释了其对氧化石墨烯-阳离子 季铵化壳聚糖复合纳米材料的较低敏感度。

在特定实施例中，所述微生物选自大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，及其组合。

受到细菌和/或真菌感染的对象可以是哺乳动物，例如人类。有利的是，已证明，复合纳 米材料能够在盐的存在下保持抗微生物活性，这使它适用于在离子生理环境中。在不受理 论束缚的前提下，可以推断，该复合纳米材料不会因为水溶性壳聚糖季铵盐侧链的存在，而 在盐的存在下发生聚集，从而稳定了该复合纳米材料。这种稳定性对于保持复合纳米材料 的抗微生物活性是重要的。

本文所公开的混合式纳米材料的另一个有利特征在于，其具有可重复使用的性质。本 申请已经证明，复合纳米材料能够反复发挥杀生物效果，因其不会被微生物吸收。通过随后 从微生物分离该复合纳米材料，例如，在含由该抗微生物组合物和细菌细胞的样品溶液中 进行离心分离，可以令该复合纳米材料从所述微生物中分离并悬浮在溶液中。复合纳米材 料不被微生物吸收，因此也不与细菌细胞共沉淀，能在重复使用后保持其抗微生物功效。

本文所公开的抗微生物组合物可用于各种环境中，如私人和公共区域，用于阻遏革兰 氏阴性菌或革兰氏阳性菌和/或真菌，以防止和/或治疗细菌定殖。

所述抗微生物组合物可单独用于环境中以抑制微生物生长，或与其它材料共用，如常 规表面活性剂，优选为十二烷基硫酸钠，或洗涤剂，杀生物剂，杀真菌剂，抗生素，pH调节剂， 香料，染料或着色剂。

该抗微生物组合物可作为抗微生物剂用于喷雾形式或液体分配形式的外用清洗和处 理溶液，如消毒剂，清洁剂，家用清洁剂和洗涤粉末制剂。例如，所述抗微生物组合物可以施 加到窗户，地板，衣服，厨房和浴室表面，以及其它食品制备和个人卫生区域的表面。

抗微生物组合物还可以作为抗微生物成分用于个人卫生制品，洗漱用品和化妆品中。 这类用品的例子包括口腔卫生制品，它是指其用于口中以促进口腔卫生的任何组合物。所 述组合物可以是水溶液的形式，例如漱口剂组合物；或凝胶剂，例如牙膏或洁牙剂组合物。 在这种情况下，洁牙剂指用来帮助维持合意的口腔清洁的膏体，液体或粉末。示例性个人卫 生制品包括但不限于，肥皂，洗发水，沐浴露，软膏，霜剂，洗剂，除臭剂，消毒剂和隐形眼镜 储藏液。化妆品的例子包括但不限于，粉底，眼线笔，唇膏和唇彩。

所述抗微生物组合物还可以用于工业生产中，如船体，造纸，石油回收和食品加工。该 化合物也可以用于水加工厂或水分配系统，如水管，水喷射器，热交换器和冷却塔。

下文中，将参考附图，并展示示范性实施例，来全面叙述本发明。但是，本发明可以实现 为为许多不同的形式，且不应被解释为限于本文所阐述的示例性实施例中。相反，提供所述 实施例是为了使得本公开彻底和完整，并且向本领域技术人员所熟知充分表达本发明的范 围。本申请中所用的术语“和/或”涵盖一种或多种相关列举项目的所有组合。本文所用的术 语仅用于描述特定实施例的目的，并非意在限制本发明。本申请中所用的单数形式“一”， “一个”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。还应当理解，术语“包括” 和/或“包含”在本说明书中使用时，指定所陈述的特征，整数，步骤，操作，要素和/或组分的 存在，但不排除还存在或附加一个或多个其它特征，整数，步骤，操作，要素，组分和/或其组 合。

除非另有定义，本申请使用的所有术语(包括技术和科学术语)的含义与本领域技术人 员在本发明所属领域中通常理解的定义相同。还应当理解，术语，诸如在常用词典中有所定 义的术语，除非另有明确说明，否则应该被解释为具有与相关领域背景一致的含义，而不应 解释为理想化或过于正式的含义。

本申请所描述的发明可以在任何要素、限制缺席的情况下适当实施，在此不再具体阐 述。因此，例如，“包括”，“包含”，“含有”等术语应被宽泛且非限制性地理解。另外，本申请所 用的术语和表达是描述性而非限制性的，且使用所述术语和表达无意排除所述和所示的特 征的任何等同形式或其部分，但是，应当理解，还可以在所述发明的范围内，对其进行各种 改进。因此，应该理解的是，尽管公开了本发明的优选实施例和可选特征，本领域技术人员 仍可以对本申请所公开的发明进行改进和变形，且所述改进和变形应当看作是包含在本发 明的范围之内。

在此对本发明进行了广泛和一般性的描述。落入一般性公开范围内的每一种更窄种类 和分组也构成本发明的一部分。这包括本发明中带有从属类中排除任何主题的附带条件或 否定性限制的一般描述，无论所去除内容是否在本申请中具体列举。

其它实施方式包含在下面的权利要求和非限制性实施例中。此外，本发明的特征或方 面以马库什(Markush)群组的方式描述，本领域的技术人员可以理解，本发明也由此包含马 库什群组中的任何单个构件或亚组。

实验例

本申请的实施例中，制备纳米材料-聚合物结合物，其基于以季铵化壳聚糖(QC，具体而 言为二甲基癸基铵壳聚糖(DMDC))功能化的氧化石墨烯功能的纳米材料，以提高其抗微生 物性能。在多个实施例中，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥 珀酰亚胺(NHS)，通过羧基和胺基之间的简单一步连接反应，将QC分子共价接枝到GO纳米 片。

GO-QC纳米片展现出对于革兰氏阴性和革兰氏阳性菌以及真菌的广谱抗微生物活性。 研究原始GO，QC和GO-QC对三种微生物的抗微生物活性：革兰阴性杆菌大肠杆菌(E.coli, ATCC8739)，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC6538)，和真菌白色念珠菌 (C.albicans，ATCC10231)。GO-QC显示了对这些病原体的广谱抗微生物活性，甚至低于单独 的QC聚合物(16-60μg/mL)或GO自身(大于5000μg/mL)的最低杀菌浓度(MBC，5-30μg/mL)对 5-30微g/ml比QC聚合物本身(16-60微g/ml)，从而表明GO-QC的抗微生物疗效优于单独的GO 或QC。

FESEM分析表明，GO-QC带来的微生物细胞壁/细胞膜损伤显著多于GO和QC，其中通过 GO-QC处理的细胞上可以观察到明显的孔洞。QC似乎仅具有令膜起皱的效果，而GO仅带来了 相对较小的形态变化。还评估了在盐(如NaCl，多至150mM)的存在下的微生物杀灭百分比例 (％)。扫描电子显微镜(SEM)和三磷酸腺苷(ATP)泄漏试验表明，该微生物细胞的包膜被损 坏。还展示了GO-QC的可复用性。使用所述试剂的荧光染料染色，展示了QC聚合物和纳米复 合物与细菌的相互作用的差异。

GO和QC的协同组合赋予了GO-QC纳米片独特的性能：它包括季铵化壳聚糖的浓缩载体， 其中所述QC基团的阳离子电荷在静电驱动下接触带负电荷的微生物细胞被膜，单原子层纳 米片的尖锐边缘进一步加强对膜的破坏。重要的是，从GO纳米片降低的溶血活性可知，壳聚 糖基团赋予了GO-QC纳米片良好的生物相容性。所述具有改进抗微生物活性的共价功能化 GO-聚合物混合材料尚未记载于现有技术中。

实施例1：GO-QC纳米片的制备

基于以季铵化壳聚糖(QC，具体为二甲基癸基铵壳聚糖(DMDC))接枝的GO，制备GO-接 枝-阳离子聚合物纳米悬浮剂。

实施例1.1：季铵化壳聚糖(QC)的制备

图4展示了季铵化壳聚糖(二甲基癸基铵壳聚糖)的合成示意图。

首先，取壳聚糖(1g，6.2mmol)预溶于乙酸(1％，100ml)，然后加入癸醛(0.97g， 6.2mmol)并在室温下搅拌1小时。在此之后，将pH值提高至4.5，随后加入硼氢化钠 (9.3mmol)并再搅拌混合物1.5小时。然后通过添加氢氧化钠(NaOH)溶液(1M)，将pH进一步 提高到10。过滤所形成的白色沉淀物并用蒸馏水洗涤到中性。用乙醇和乙醚混合物进行索 氏提取，以除去未反应的试剂。然后，将所得的N-癸壳聚糖(1g，6.2mmol)加入到N-甲基吡咯 烷酮(NMP)(50ml)和NaOH溶液(1.5M，15ml)中。在50℃下搅拌30分钟后，如下进行甲基化反 应：取碘化钠(1.08g，7.2mmol)和甲基碘(11.2g，78.7mmol)加入到壳聚糖/NMP/氢氧化钠混 合物中，然后在50℃下搅拌反应24小时。抽滤溶液。滴加滤液入丙酮(400ml)中，然后将获得 的沉淀物过滤，在真空下干燥，得到产物。

实施例1.2：GO纳米片的制备

通过剥离氧化石墨制备的GO纳米片含有丰富的氧化功能团，如羧基，羰基，酚羟基和环 氧基(图1B)。GO上的羧基可通过碳化二亚胺活化，并与伯胺基团发生反应形成酰胺键。

简言之，使用改进的赫默斯方法(Hummersmethod)，向GO纳米片引入大量氧化功能团， 如羧基基团，从而从天然石墨粉末上化学剥离GO纳米片。GO纳米片的平均厚度为约1纳米， 平均直径为746±308纳米(图6A，6B和图7)。

反应后，将悬浮液离心(20000×g，2小时)以除去未反应的GO纳米片，然后用聚酰胺膜 (0.2μm，Sartorius)过滤并使用去离子水彻底洗涤，以除去未反应的试剂。将固体残余物分 散在水中，使用纤维素膜(Sigma公司，MWCO14000)透析3天，然后冷冻干燥。使用傅里叶变 换红外光谱(FTIR，Nicolet5700)和热重分析法(TGA，NetzschSTA409)对合成所得的GO- QC进行表征。

实施例1.3：GO-QC纳米片的制备和表征

合成重量比为GO：QC＝1：1至1:10(w/w)的系列GO-QC衍生物。

使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，Sigma)和N-羟基琥珀酰亚 胺(NHS)，通过羧基和胺基的连接反应，将QC分子共价接枝至GO纳米片(图1A和图1B)。合成 的QC(图4)的季铵化度为56％，分子量为38kDa(图5)。

从元素分析估计并从以下关系式计算壳聚糖衍生物的季铵化程度：

图6A和图7显示，GO和GO-QC复合物均为独立纳米片。GO-QC(1：5)的AFM成像(图6B)表 明，其平均厚度增加至约2nm，而平均直径没有太大改变(573±160nm)。

图。6C显示了原始GO，QC和典型GO-QC(1：5)的FITR谱。GO-QC图谱的1535cm^-1处的峰值 不存在于GO图谱中，该峰值对应GO和QC之间新形成的-NHCO-键，证实该QC分子已通过酰胺 键接枝到GO上。在QC的图谱中，也有1535cm^-1处的峰值，这是壳聚糖脱乙酰化不完全的弱峰。

在氮气保护下，以10℃min^-1的加热速度，在50至600℃下进行TGA分析(图6D)。

GO在低于100℃时损失了4％重量，这是由于其π共堆叠结构中所吸收的水分的蒸发。 165℃至215℃之间，观察到GO大量减重，这可能是由于易于含氧基团的裂解。

相比之下，QC在低于100℃时损失的重量小于2％，但在210℃至250℃之间损失了35％ 的重量，这是由于取代基的分解和吡喃葡萄糖环的裂解。

GO-QC的重量损失曲线分为两个阶段，分别可以归因于GO(165℃到195℃)和QC(210℃ ～250℃)的大量损失。在这两个主要机制下的重量损失中，可以推断GO与QC的实际重量比, 且所述值不同于设计值(表1)。

表1:最低杀菌浓度(MBC)和溶血活性

设计比例.*选择性＝HC₅₀/MBC

对于1:1至1:5的GO:QC反应物重量比设计值，测得的GO：QC比例分别为1：0.54至1： 2.07，这表明约50％的QC分子成功接枝到GO纳米片。然而，对于1：10的GO：QC重量比设计值， TGA测定的GO：QC比例为1：2.20，这表明只有22％的QC接枝到GO纳米片。似乎，所测得的GO： QC比例在约1：5的比例左右达到稳定。这可能归因于GO纳米片上的羧基的可用性有限。通过 如下酸滴定证实GO上的羧基消耗到接近零值。

实施例2：GO和GO-QC的羧酸基团的含量测定

GO和GO-QC的羧酸基团含量是由酸-碱滴定法测定。取50mgGO或GO-QC，与10ml氢氧化 钠溶液(0.1M)在超声处理下混合30分钟，然后搅拌2天。然后，将混合物放入透析管(Sigma 公司，MWCO14000)，透析直至透析液的pH呈中性。使用旋转蒸发器将合并的透析液浓缩，并 用0.1MHCl滴定至中性(pH值＝7.00)。由GO或GO-QC消耗的NaOH量估计羧酸基团含量。

原始GO上的羧酸基团的测定含量为约5.1mmol/g，对于GO-QC(1：5)和(1:10)，该含量分 别0.6mmol/g和0.5mmol/g。留在GO-QC复合纳米材料上的少量羧酸基团可以通过嫁接QC分 子来屏蔽，从而防止进一步的接枝反应。

实施例3：最低杀菌浓度(MBC)的测定

最低杀菌浓度GO，QC(MBC)和GO-QC使用无营养的协议，以消除细菌的复制确定。的两倍 系列稀释的100μl的抗微生物试剂溶液是在96孔微板，接着在106mlCFU-1的浓度的加入100 μl细菌/真菌悬浮液。将板在37℃培养℃(28℃用于真菌)6小时。培养后的样品处理过的细 菌/真菌悬浮液使用氢/YM琼脂电镀。MBC被确定为最低浓度没有在营养平板细菌/真菌的生 长。该试验独立地重复两次。

实施例4：微生物形态学研究

使用场发射扫描电子显微镜(FESEM，JEOLJSM-6701F)检测QC、GO和GO-QC引起的微生 物形态变化。

令微生物细胞与100μgml^-1的QC，GO和GO-QC共培养1小时。通过离心(1000×g，10分 钟)收集培养后的微生物，再用2.5％戊二醛固定4小时，接着用1％四氧化锇溶液在4℃下固 定4小时。将样品在从20％到100％的梯度乙醇系列中各脱水15分钟，然后在氮气流下干燥。 将样品真空干燥并涂上铂，用FESEM观察微生物形态的变化。

实施例5：ATP泄漏检测

通过三磷酸腺苷(ATP)的泄漏检测来观察膜破坏活性。使用BacTiter-Glo微生物细胞 活力检测试剂盒(Promega公司，美国)和光度计(GloMax20/20Promega公司，美国)测定从 细菌细胞中释放的ATP。

简言之，离心收获(1000×g，10分钟)对数生长中期的大肠杆菌，并用磷酸盐缓冲盐水 (PBS)洗涤三次。用PBS将细菌悬浮液稀释至1-1.5×10⁶CFUml^-1，并添加抗微生物试剂中至 100μgml^-1的终浓度。在所需的时间点，收集50μl样品，并用BacTiter-Glo试剂盒和光度计 测定释放的ATP浓度。

实施例6：Zeta电位测量

使用动作电位分析仪(ZetaPALS,BrookhavenInstrumentsCorporation,US)测定GO， QC和GO-QC的100μgml^-1水溶液的电荷状态。

实施例7：抗微生物和溶血评估

选择三种临床显著微生物，即大肠杆菌(革兰氏阴性菌)，金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性 菌)和白色念珠菌(真菌)作为模型病原体，用于研究GO和GO-QC的抗微生物活性。

所用的细菌和真菌菌株，即大肠杆菌(ATCC8739)，金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，白色念 珠菌(ATCC10231)，来自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)。 所有的液体或琼脂培养基购自BectonDickinson公司(FranklinLakes,US)。

对于细菌，在Luria-BERTANI(LB)液体培养基中接种单个菌落，并在37℃下以200rpm振 荡过夜。在对数生长中期收货细菌，以1000×g离心10分钟，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液 洗涤，以除去残留的营养。将真菌接种在酵母麦芽(YM)液体培养基中，在28℃下培养2天，收 获，离心，并通过与细菌细胞相同的方式洗涤。

将细菌或真菌细胞离心，并将沉淀物再悬浮于水中，并稀释至所需的浓度。取10⁸CFU细 胞接种到1ml的GO/GO-QC分散系中，然后在摇动的条件下以37℃(真菌为28℃)、200rpm培养 希望的时间。由平板菌落计数方法测定细胞数。简言之，将100μl10倍液移到10cm培养板并 以50℃的LB琼脂(真菌为YM琼脂)扩散。将板在37℃(真菌为28℃)过夜(18-36H)，以形成菌 落。对菌落数进行计数，并利用下式计算杀灭百分比。该实验重复三次。

首先，微生物分别以10⁸CFUml^-1的浓度接种到GO/QC/GO-QC分散系(100微gml-1)，培 养1小时后，进行平板菌落计数。

原始GO对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的杀灭百分比(％)分别为24.8± 3.7％，34.9±4.5％和18.6±2.2％(图8)，表明GO的细菌和真菌杀灭效果差。QC衍生物本身 具有优异的抗微生物活性，对这三种细菌和真菌微生物的杀灭百分比(％)分别是97.5± 2.1％，96.9±2.5％和98.8±1.2％。据观察，与原始GO相比，两种QC含量更高的GO-QC纳米 复合物对三种模型病原体具有显著更高的抗微生物活性(图8)。

对于GO-QC(1：5)，对三种微生物的杀灭百分比(％)分别是93.6±4.2％，97.8±1.8％ 和99.3±0.4％，与QC本身统计相似(p>0.05，无显著差异)。对于GO-QC(1:10)，相应的杀灭 百分比(％)是93.7±1.9％，98.4±1.5％和98.2±1.7％，与GO-QC(1：5)统计相似(P>0.05， 无显著差异)。

似乎,抗微生物活性在超过GO-QC(1：5)的范围内进入稳定，所测量的GO：OC比例的该稳 定趋势由TGA证实(表1)。GO-QC复合物的杀灭百分比(％)值似乎非常接近QC，但显著高于 GO。

还研究了大肠杆菌杀灭曲线的时间依赖性(图9)。QC和GO-QC的杀灭百分比(％)4小时 后达到近100％，而GO的杀灭百分比(％)增加更具有渐进性，并在超过12小时后约70+％杀 灭后趋于稳定。

还测定了GO，QC和GO-QC的最低杀菌浓度(MBC)(图8B和表1)。QC溶液对大肠杆菌和金黄 色葡萄球菌分别在60μgml^-1和30μgml^-1显示了良好的抗微生物活性MBC；对于白色念珠 菌，其在16μgml^-1显示了更好的抗真菌活性MBC。原始GO在高达5000μgml^-1的浓度下也未 显示杀菌活性。对于GO-QC(1：5)纳米复合物，其MBC的值在5–30μgml^-1范围内，低于QC分子。

GO-QC纳米复合物的MBC结果令人惊讶地优于单独的QC聚合物，这与通常固定观察到的 相反。这可能是由于固定密度大，QC聚合物与细胞壁的化学相容性以及固定聚合物的“风 筝”性质。如同杀灭百分比(％)，GO-QC的MBC在(1：5)和(1:10)趋于稳定。QC与GO结合于纳米 复合物中，提高了杀菌效力。

实施例8：在盐的存在下的抗微生物活性

能够在盐的存在下保持抗微生物活性，在扩大GO纳米片在各种抗微生物应用中的用途 是重要的，例如，在离子生理环境中。例如，抗微生物肽受到其不耐盐性质的强烈制约，这阻 碍了它们作为涂层剂的发展。虽然GO纳米片上的亲水性氧化基团可以有助于其在水中的分 散稳定性，片材之间存在的范德华相互作用仍可以容易地诱导其聚集。在抗衡离子如Na+的 存在下，抗衡离子能够结合阴离子氧化基团并将其中和，从而导致聚集。

与GO不同，在生理学上重要的盐，包括氯化钠(图8C)和KCl、CaCl₂和MgCl₂(图10A至图 10C)的存在下，GO-QC(1：5)和QC还保留其抗微生物活性。

与NaCl类似，随着从0mM至150mM的KCl的添加，GO如图10A所示失去其抗微生物活性。在 KCl浓度高达150mM的情况下，GO-QC和QC的抗微生物活性仍得到保持。二价离子例如Mg²⁺/ Ca²⁺的生物浓度比单价离子要低得多；所述两种二价离子的测试范围为0至5mM。添加直至 5mM的Mg²⁺/Ca²⁺并未影响抗微生物活性，而GO对大肠杆菌的杀灭百分比(％)随着二价离子 增加而稍微减少，如图10B和图10C所示。

GO-QC复合物对盐不敏感，就像原始QC一样，因为微生物杀伤作用不依赖于次级构象， 而是依赖于其阳离子电荷。

实施例9：作用机理研究

QC涂层的石墨烯支架纳米复合物的杀灭机理，被认为是通过膜破裂及物理损伤。通过 场发射扫描电子显微镜(FESEM)，研究大肠杆菌细胞与QC，GO和GO-QC(1：5)溶液/分散液 (100μgml^-1)接触前后的形态变化(图11和图12)。

相比未处理的对照细胞的光滑表面(图11A(i))，QC处理的大肠杆菌细胞(图11A(ⅱ)) 显示出起皱的细胞表面。在另一方面，发现GO处理的大肠杆菌细胞在细胞两端具有物理缺 陷(如11A(ⅲ)箭头所示)，这很可能是锐利的纳米片造成的。GO-QC(1：5)处理的细胞，相比 于QC和GO的单独处理，甚至显示出更剧烈的形态学变化：在细胞上可以清楚地看到显著损 伤(或孔洞)(如图11A(iv)箭头所示)，且细胞包膜出现严重坍塌，暗示细胞内容物流失到环 境中。细胞膜的破坏可以通过用BacTiter-Glo发光试剂盒对释放到细胞外环境的ATP进行 染色来检测。如图11B所示，与QC和GO-QC接触后发光显著增加，更证实了FESEM观察到的表 明膜破坏的形态变化。因此，FESEM研究和ATP泄漏检测均证实，GO-QC纳米复合物能破坏微 生物的细胞膜。

在不受理论束缚的前提下，可以推测，GO-QC纳米复合物的改进的MBC(和选择性)，来源 于固定在GO上的QC向细胞壁呈现的更高面积电荷密度，其高于与QC溶液接触所产生的电荷 密度。对GO-QC动作电位测量结果表明其携带负电荷(-45.78±1.93mV)，但GO-QC则携带正 电荷。随着GO:QC比例从1：1提高到1：10，分别为1至1:10，GO-QC的动作电位从9.31±1.04mV 提高到44.49±0.97mV，证实阳离子聚合物成功接枝到了GO纳米片。

更有趣的是，GO-QC(1：5)和(1:10)的动作电位(分别为43.37±1.18mV和44.49± 0.97mV)更高于QC(20.01±4.20mV)，证实了面电荷密度更高的假设。相比于被均匀地分布 在QC溶液中的QC分子,存在于GO-QC表面的QC分子具有更高的表面浓度。可以推测，GO-QC纳 米复合物上的高QC面积浓度，使得微生物细胞壁的静电诱导破坏更有效，从而令其MBC值降 低到甚至低于纯QC的MBC值。

虽然QC和GO-QC中的杀灭都是源于静电驱动，GO-QC/QC两种材料的穿透深度仍存在显 著差异，通过荧光试验研究GO-QC/QC与细菌细胞之间的相互作用。首先，GO-QC和QC分别结 合荧光色素(德州红-X)，然后将标记后的材料与细菌共培养。培养1小时后，将细菌通过离 心(2000×g，10分钟)分离，并且在荧光显微镜下观察。有趣的是，与QC-德州红共培养的细 菌被荧光染料染成了红色，而GO-QC-德州红没能对细胞染色(图11D)。这一结果表明，细菌 细胞壁吸收QC分子，但没能吸收2DGO-QC纳米复合物。QC分子为溶液形式，并可被吸收到细 菌细胞壁。2DGO-QC纳米复合物不能物理穿透细菌细胞胞浆膜；相反，它可能在距离膜一定 距离处施加静电效应，导致胞质膜破坏。由于GO-QC不是由细菌内吞，它可以保留在悬浮液 中，并通过离心从细菌中分离，由此使悬浮液在多次使用后仍保持其抗微生物功效。

实施例10：人红细胞的溶血活性

人红血细胞(RBC)的溶血活性是抗微生物材料的生物相容性判定的重要标准。已知GO 具有显著溶血活性，这限制了它在生物医学领域的应用。

通过离心(1000×g，10分钟)从健康供体(男性，25岁)的5ml新鲜血液中收集人红细胞。 将分离的红细胞用Tris缓冲液洗涤三次，然后稀释至5％的终浓度(v/v)。系列取浓度GO和 GO-QC溶液(50μl)与红细胞储藏液(50μl)混合并加入到96孔板。将样品以150rpm的振动速 度和37℃下在培养箱中培养1小时。培养后，将微板孔内容离心(在1000×g)10分钟。离心 后，将上清液(80μl)添加到新96孔板的孔中，并用等量Tris缓冲液稀释到160μl最终体积。 微板分光光度计(BIO-RADBenchmarkPlus,US)读取该溶液的540nm吸光度。用0.1％的 TritonX-100作为阳性对照，Tris缓冲液作为阴性对照。从下面的等式得到溶血百分比：

Hemolysis(％)＝[(A_p–A_b)/(A_t–A_b)]x100％

溶血反应(％)＝[(A_p–A_b)/(A_t–A_b)]x100％

其中A_p是含有样品的GO或GO-QC的吸光度值，A_t为阳性对照的吸光度值，A_b为阴性对照 的吸光度值。

测量了招致50％红细胞溶血需要的GO和GO-QC的浓度(HC₅₀)(表1)。原始GO的HC₅₀是310 μgml^-1，而GO-QC系列均表现出高得多的HC₅₀。GO-QC(1：1)和(1：2.5)的HC₅₀分别为2500和 5000μgml^-1，较高的QC比例(1：5)和(1:10)的HC₅₀也较大，为>5000μgml^-1。我们此前的结果 表明，季铵化壳聚糖是低溶血活性的生物相容性材料，其嫁接到GO进一步降低了GO纳米片 的溶血活性。与其抑制90％以上微生物生长的最低抑制浓度(MIC₉₀)相比，期望的GO-QC(1: 5)纳米片的选择性计算值大于125。

实施例11：GO-QC涂层的制备和抗微生物活性

GO-QC纳米片通过溶胶-凝胶方法制作为透明的纳米多孔抗微生物表面涂层，其中，GO- QC溶胶旋涂在处理过的氧等离子体玻璃表面上，并且通过随后的凝胶化形成涂层(图2)。

典型地，向含有的乙醇(1ml)和GO/GO-QC水悬浮物(1ml)的混合物的5ml小瓶中，加入 0.1ml原硅酸四甲酯(TMOS，Sigma-Aldrich公司)，来制备溶胶。。将小瓶加盖，并将所得溶胶 在室温下放置一天，然后再用于涂层制备。先NaOH(1M)后丙酮地超声洗浴清洁玻璃盖玻片 歌30分钟。在氮气流下干燥后，以13.56MHz射频，100sccm气体流速，500mTorr压力和200W功 率用氧等离子体活化玻片表面10分钟。然后，以6000rpm进行2分钟旋涂，将几滴GO或GO-QC/ TMOS溶胶沉积在等离子体激活的盖玻片上。涂覆的薄溶胶膜在70℃的空气烘箱中过夜凝胶 化，随后在受控的氩气流的管式炉中以130℃固化2小时(2℃/分钟的加热速率和5℃/分钟 的冷却速率)。

在此GO和GO-QC涂层上，进行抗微生物测定，并使用等离子体处理过的玻璃片作为对 照。将GO/GO-QC涂覆的玻璃盖玻片置于24孔板上，并在UV光下灭菌1天。取10μl细菌接种物 置于涂层表面，然后再覆盖一层涂层玻片，使得接种体在涂层之间均匀地展开并解除。使用 洁净玻璃载玻片作为对照。将接种玻片在37℃(真菌为28℃)和不低于90％的相对湿度下培 养1小时。培养后，将1ml中和肉汤加入到每个孔中，以回收幸存微生物。制备一系列10倍稀 释的样品并在LB琼脂(真菌为YM琼脂)中铺板。将板在37℃下(真菌为28℃)培养过夜，对形 成的菌落单位进行计数。由如下等式计算细胞对数去除率：

对数去除率＝Log(对照细胞计数)–Log(样品幸存菌计数)

通过菌落平板计数来记录三种微生物的对数去除率。GO的对数去除率仅我0.18±0.01 至0.30±0.04，而GO-QC的对数去除率高得多；GO-QC(1：5)和GO-QC(1:10)的对数去除率高 于2，表明抑制值大于99％(图2E)。

GO纳米片上的羧基使其带负电荷，与微生物膜的电荷状态一致。因此，GO和微生物细胞 之间存在静电斥力，阻碍其接触速度，这也解释了GO对细胞膜更为渐进性的损害。季铵化壳 聚糖是阳离子多糖，当用其功能化GO纳米片时，令GO的电荷状态从带负电荷变为带正电荷。 在阳离子GO-QC分散系中，阳离子纳米片被静电吸引到阴离子微生物细胞，其中所述阳离子 电荷和GO-QC纳米片的尖锐边缘协同，快速有效地破坏负电荷微生物膜。GO-QC因此表现出 比原始GO更强的抗微生物活性。GO-QC电荷状态的增加，并没有损害纳米片的生物相容性， 这可以通过相对于单独的GO,GO-QC系列的相比HC₅₀改善看出。GO-QC涂层具有有效的抗微生 物性，且透明，使其可用于生物医学和其他领域的抗微生物应用的GO-QC纳米片。

由此制得的氧化石墨烯接枝的季铵化壳聚糖(GO-QC)纳米片，有超越原始GO的几个优 点。首先，用QC聚合物修饰GO，能提高该材料在水性环境中的分散，从而克服GO在溶液中的 聚集倾向。此外，使用阳离子季壳聚糖旨在增加GO的电荷，以进一步增强它的抗微生物活 性。壳聚糖及其衍生物是生物相容的材料，因此，使用壳聚糖来修饰氧化石墨烯，可避免GO 纳米片带来的毒性。

在所进行的实验中，研究了原始GO，QC和GO-QC对三种微生物的抗微生物活性：革兰阴 性杆菌大肠杆菌(EscherichiaColi)，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，和真菌白色念珠菌(Candida.albicans)。

研究结果表明，GO与QC共价结合后，抗微生物效力显著增强。通过溶胶-凝胶法在玻璃 表面上制备了GQ-OC纳米片透明涂层，其能够有效地抑制革兰氏阴性/阳性细菌和真菌。

实施例12：体外生物相容性研究

使用前，GO-QC(1:5)涂布的玻璃盖玻片在70％乙醇中灭菌1小时。取人主动脉平滑肌细 胞(HASMCCC-2571，Lonza)以0.5×105个细胞cm^-2的密度接种到24孔培养板上。在培养基中 补充100μgml^-1GO-QC(1:5)。将GO-QC(1:5)涂覆的玻片置于孔中，令GO-QC涂覆的一侧在细 胞附着到板上后(约4-5小时)面向细胞培养物。每2天更换培养基。在指定的日子，用CCK-8 试剂盒(Sigma，US)以450nm处的吸光度分析测定细胞的细胞活力。使用不含GO-QC涂覆玻片 的TCPS孔中的细胞作为对照。SMC的活力还通过LIVE/DEAD分析进行检测。

在特定细胞培养时间段后，除去GO-QC涂覆玻片，用LIVE/DEAD试剂盒(Invitrogen，US) 进行细胞染色。45分钟培养后，PBS漂洗除去LIVE/DEAD染料，用倒置光学显微镜(Zeiss， Germany)观察荧光下的细胞形态。

实施例13：QC-GO复合物的可复用性

测试了QC-GO复合物的可复用性，发现其远远显著优于单独的QC或GO。

令候选材料反复对抗10⁸CFUml^-1浓度的大肠杆菌。病原体与材料共培养后，通过离心 分离，使得细菌细胞在悬浮液中沉降。原始GO在离心中与大肠杆菌细胞共沉降，从而在第二 次使用时(图8D)失去其可复用性。相同浓度的QC溶液(100μgml^-1)只在前两次使用中保持 了超过90％的杀灭百分比效率，其与细菌接触5次后，抗微生物功效下降到接近0％。与此相 反，GO-QC(1：5)可反复使用至少10次。与大肠杆菌接触并离心后，GO-QC(1：5)纳米复合物仍 很好地分散在水中(图8D)，并且可以被回收。在每一轮的测试中，GO-QC(1：5)杀灭超过90％ 的大肠杆菌，并在重复使用10次后仍保留了其功效。在每一轮的测试中，GO-QC(1：5)杀灭超 过90％的大肠杆菌，并在重复使用10次中，其疗效没有显著下降。纳米混悬剂的可重用性似 乎是该复合物的独特优越性质。

GO-QC系列的50％溶血浓度(HC₅₀)通常在两个对照(QC和GO)之间(表1)。

例如，GO-QC(1：5)和(1:10)显示出高HC₅₀值，为10,000μgml^-1，而原始QC和原始GO的 HC₅₀值分别为15000μgml^-1和1250μgml^-1。QC-QC(1：5)对各种病原体的选择性(定义为HC₅₀/ MBC)为QC的大约两倍(图8E)。GO的显著溶血活性是由于原始GO的尖锐边缘预期有害于哺乳 动物细胞。

本申请中的壳聚糖衍生物，如QC，具有低溶血活性和低哺乳动物细胞毒性。围绕GO-QC 纳米复合物的QC分子，可能充当了降低对哺乳动物细胞的物理损害的生物相容性保护层， 使得GO-QC显示了与原始的GO相比大大改进的HC₅₀。结果显示，与GO-QC(1：5)(100μgml^-1) 接触的人主动脉平滑肌细胞(SMC)可存活，且与接触组织培养聚苯乙烯(TCPS)的对照相比 无显著统计差异(图8F，p>0.05，无显著差异)。

实施例14：讨论

阳离子QC接枝的GO纳米材料提供了各种功能。首先，以水溶性阳离子QC修饰的GO提高 了所得纳米复合物在水性环境中的分散性，因此克服了GO在溶液中的聚集倾向。其次，GO纳 米片的细胞毒性被接枝在它的锋利边缘的生物相容性壳聚糖衍生物所掩盖。GO纳米片通过 尖锐的边缘破坏微生物细胞膜，导致膜完整性损失和内部成分泄漏，并最终导致细胞死亡。 再次，用阳离子季铵化壳聚糖对GO进行功能化，将GO的电荷状态从带负电荷改变为带正电 荷，赋予了GO-QC纳米复合物正电荷，由此，该阳离子GO-QC和负电荷细菌细胞胞浆膜之间的 静电引力破坏菌膜。最后，QC与细胞壁肽聚糖多糖含量的化学相似性，促进GO-QC渗入细胞 壁，将阳离子电荷带到微生物细胞质膜附近。

阳离子QC分子固定到高比面积的GO纳米片上，导致比溶解QC更高的正电荷，由此，GO的 高面电荷密度在增强的抗微生物性质中起重要作用。阳离子QC分子在小面积中的浓度导致 动作电位和电荷密度的提高。当GO-QC纳米复合物与微生物细胞的接触时，纳米复合物上的 高浓度阳离子QC分子，比溶液中的QC更强烈地与负电荷微生物膜相互作用。由此，小尺寸纳 米片上的QC分子浓度，使得与溶液中的纯QC相比，GO-QC(1：5)和(1:10)的MBC更为改善。另 外，纳米复合物显示出333-2000左右的优异选择性，且对人细胞没有明显的体外细胞毒性。

已知以自组装可生物降解嵌段共聚物制成的抗微生物纳米颗粒，但胶束形成所必需的 共聚物的显著非活跃部分，导致最低抑菌浓度较高(5-15μM左右)。另外，对于许多非生物医 学应用，也需要考虑再利用和回收。与均匀地分布在溶液形式中的QC游离分子不同，GO-QC 纳米复合物中的QC分子集中在单层纳米片。阳离子QC分子集中在一个小区域，从而提高动 作电位和电荷密度。当GO-QC纳米复合物与微生物细胞的接触时，纳米复合物上的高浓度阳 离子QC分子，比溶液中的QC更强烈地与负电荷微生物膜相互作用。由此，小尺寸纳米片上的 QC分子浓度，使得与溶液中的纯QC相比，GO-QC(1：5)和(1:10)的MBC更为改善。

更有趣的是，本申请还展示了，本申请的阳离子纳米混悬剂，能够反复发挥生物杀灭效 果，这对该阳离子聚合物的相应溶液形式是不可能的。

当溶液中的游离QC分子与细菌相互作用时，所述分子被吸收并插入到细菌细胞壁。溶 解的QC分子与细菌细胞在离心下沉淀，消耗溶液中的抗微生物剂，从而使剩余的溶液在重 复使用后失去其抗微生物效力。不同于游离QC分子，GO-QC纳米复合物中的QC分子被固定在 GO纳米片上，防止它们被微生物吸收。

离心时，纳米复合物从细菌细胞分离，保持悬浮并且不与细菌细胞一起沉淀，因此在重 复使用后保留其抗微生物功效。这种纳米材料(使用2DGO)利用了纳米级厚度，微米级横向 尺寸，GO的不溶性质(以使它们不被细胞吸收)，以及高电荷密度。当柔性GO-QC纳米片环绕 细菌细胞时，它们的高电荷会在距离胞浆膜一定距离处，对负电荷细胞质膜外叶产生强大 吸引力。由于QC分子被限制在GO纳米片上，GO-QC纳米复合物无法插入到胞质膜中。负电荷 细菌细胞质膜外叶可能因静电相互作用而变形，或各阴离子分子可以被拉出膜外，导致细 胞死亡。杀灭剂(在此情况下为阳离子聚合物)在纳米材料(在此具体为石墨烯)上的接枝， 似乎真正利用了纳米级厚度和微米级的大横向尺寸和2DGO材料的不溶性质，使得纳米复 合物称为一种具有高的阳离子电荷密度的稳定悬浮液。

本申请首次提供了所述具有优异广谱抗微生物作用、良好的体外生物相容性和优良的 选择性、易检索性和可复用性的阳离子纳米混悬剂。其它抗微生物纳米混悬剂基于可浸出 活性材料例如Ag。GO-QC纳米复合物的MBC和选择性值高于阳离子纳米颗粒的其他报告值。 本文所公开的纳米混悬剂广谱抗微生物，无污染性，且生物相容。与单个成分(单独的GO或 QC)相比，GO-QC纳米复合物具有更好的MBC和选择性值，这可能是高面电荷密度的结果。后 者和纳米复合物的不溶形式，使得纳米复合物具有更高的可复用性，这迄今尚未在阳离子 聚合物的溶液形式中被展示或观察到。另外，该悬浮液还展示了基于静电的“远距”膜破坏， 其无需涉及插入到双分子层中。具有高功能性的原子层GO，具有高表面接枝密度和GO载体 的低质量分布，使该纳米复合物具有优异的MBC。QC与GO的结合还掩盖了GO纳米片的细胞毒 性，并令GO-QC纳米复合物显示出相比于单独的GO的改进生物相容性。此外，纳米复合物的 不溶性使其具有卓越的可复用性。此类抗微生物GO-QC纳米混悬剂在生物医学，环境，个人 护理等领域中具有优秀的抗微生物应用前景。

尽管本发明中描述了具体细节并引用了示例实施例，但是本领域技术人员可以理解， 可以在不脱离本发明如下列权利要求所限定的范围和思路的前提下，对本发明进行形式和 细节上的各种改变。