基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗

摘要

基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，以重组汉逊酵母胞内表达的HBsAgVLP和和HBcAgVLP为抗原，重组汉逊酵母表达的HBsAg的氨基酸序列中共含有19个CTL表位。重组汉逊酵母表达的HBcAg的氨基酸序列中共含有19个CTL表位，以热失活全重组汉逊酵母细胞为佐剂。热失活全重组汉逊酵母细胞为最主要专职抗原递呈细胞(DC)Dectin?1受体的高效激动剂。HBV特异性CTL细胞，靶向感染HBV的肝细胞释放IFN?γ：第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上cccDNA分子池，第二步提高了过程中损伤受HBV感染的肝细胞，并触发HBV免疫逆转。

说明书

技术领域

本发明属基因工程领域,涉及疫苗为热失活全重组汉逊酵母细胞表达HBsAg和 HBcAg治疗乙肝疫苗。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。据世 界卫生组织(WorldHealthOganization,WHO)报道,全球60亿人口中，约20亿人曾感染过 HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和 原发性肝细胞癌(肝癌)。全球肝癌患者中，75％以上是由HBV所致。我国属HBV感染地方性流 行区。我国卫生部于1992年将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理。2001年12月国务院正式批 准将乙型肝炎疫苗纳入儿童计划免疫,要求各省市自治区从2002年起,除收取少量手续费 外,给所有新生儿免费接种乙型肝炎疫苗。按照2005年3月制订的计划免疫条例,自2005年6 月1日起,所有新生儿乙型肝炎疫苗免疫完全免费。经过近15年的努力,我国一般人群,尤其 是15岁以下儿童,乙型肝炎病毒感染率明显下降。据2006年全国乙型肝炎血清流行病学调 查表明,全人群乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带率己由1992年9.75％降至7.18％,5岁以下 儿童的乙型肝炎表面抗原携带率已由原来9.67％降至0.96％。据此推算,我国现有的慢性 HBV感染者约9300万人,其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。每年因HBV导致的肝硬化和肝 癌死亡30余万例,新发乙型肝炎病例50万-100万例。因此,本病是我国当前和今后相当长时 期内危害人民健康、阻碍社会发展、影响社会稳定的重要因素,是一个严重的公共卫生问 题,也是我国在建立以人为本的和谐社会过程中,需要优先解决的一个重大健康问题。我国 人群HBV感染的流行率高,给国家带来了沉重的经济负担。据调查.我国每年因慢性乙肝(包 括肝硬化、肝癌)的直接和间接医疗费用约6800亿元。乙肝疫苗免疫预防与治疗是降低疾病 负担最有效的方法。

基因重组技术是现代生物技术的核心技术；也是规模化生产乙肝疫苗主要组 份——病毒样颗粒乙肝表面抗原(HBsAgVLP)的唯一技术。本专利权人从1995年开始从事 汉逊酵母重组乙肝疫苗研发工作。1998-2002年在大连高新生物制药有限公司，主持开发的 汉逊酵母重组HBsAgadw2乙肝疫苗，HBsAgVLP抗原纯品(原液)产率为40mg/升；于2002年 起经国家审批上市。2003-2006年本人为北京天坛生物制品股份有限公司协议开发的重组 汉逊酵母HBsAg-adr2乙型肝炎疫苗。其HBsAgVLP抗原纯品(原液)产率为85mg/升以上；已 于2015年申报国家新药审评，以该疫苗为基础申请的中国专利公开号为CN104232661A。

根据现有技术查明的乙型肝炎发病机制如下：人感染HBV后,一般可分为免疫耐受 期、免疫清除期和非活动或低(非)复制期。免疫耐受期的特点是HBV复制活跃,血清HBsAg和 HBeAg阳性,HBVDNA滴度较高(＞10⁵拷贝/ml),血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平正常,肝 组织学无明显异常。免疫清除期表现为血清HBVDNA滴度＞10⁵拷贝/ml,但一般低于免疫耐 受期,天门冬氨酸氨基转移酶(AST)持续或间歇升高,肝组织学有坏死炎症等表现。非活动 或低(非)复制期表现为HBeAg阴性,抗-HBe阳性,HBVDNA检测不到(PCR)法或低于检测下 限,水平正常,肝组织学无明显炎症。但在青少年和成人期感染HBV,一般无免疫耐受期,一 开始即为免疫清除期,表现为急性乙型肝炎,其中仅5％-10％发展成慢性。但其确切的发病 机制仍不了解。

抗乙型肝炎病毒治疗是目前对乙肝病毒感染者及乙肝患者的主要治疗手段。目前 抗乙型肝炎病毒药物主要有以干扰素类为主的免疫调节剂和针对HBVDNA多聚酶的核苷酸 类似物两大类,虽有一定疗效,但尚不满意,多数患者不能被治愈。干扰素虽可使少数患者 HBsAg消失或血清学转化,但费用较高,需要注射,且有一定副作用；核苷酸类似物则作用于 HBVDNA聚合酶,只能抑制病毒复制,不能彻底清除HBV和cccDNA,且长期应用易导致病毒耐 药变异。

因此,为了彻底清除HBV和cccDNA，亟待开发新的更有效的HBV治疗乙肝疫苗。人体 肝脏为一免疫耐受器官；肝脏移植免疫排斥反应低充分表明这一点。乙型肝炎病毒(HBV)感 染人的部位为肝脏；因此对HBV的免疫耐受为其主要特征。逆转HBV免疫耐受是开发慢性乙 型肝炎患者(CHB)免疫治疗疫苗的立足点。HBV免疫耐受不仅体现在肝脏局部anti-HBV免疫 应答不能有效清除病毒，导致持续感染；也体现在HBV持续存在，进而诱导全身性免疫系统 对HBV无应答，如HBV耐受期病人对HBsAg疫苗无应答。这也是当前治疗性疫苗在CHB病人中 难以成功的主要原因。肝脏诱导的免疫耐受及其逆转机制研究将为研制治疗乙肝疫苗提供 了理论依据。

2005年Bowen提出：肝内的免疫环境与诱导耐受性相关，但仍保持了维持对病原体 有效反应的能力。这种二分法的机制尚不清楚。最近的数据表明，初始CD8+T(CTL)细胞活化 在肝脏内发生，同时肝脏预先有炎症(即天然免疫活化)；则存活的CTLs增多，CTLs更有效， 导致肝脏免疫应答，清除感染的HBV；而在预先肝脏无炎症(即天然免疫未活化，如婴幼儿 时)，则CTL功能受损和CTL半寿命短，导致肝脏对HBV免疫耐受。然而，初始HBV抗原相遇免疫 诱导高效的主要激活HBVCTLs存在于肝脏外的淋巴结内，然后再进入肝脏，则也使存活的 CTLs增多，CTLs更有效，也导致肝脏免疫应答，清除感染的HBV。这一关于两个部位的免疫机 制为研制皮下、肌肉注射治疗乙肝疫苗，导致肝脏免疫应答、清除感染的HBV提供了理论依 据。

2014年美国ThomasH.King报道：“AWholeRecombinantYeast-Based TherapeuticVaccinethatiscomprisedofheat-inactivated,wholerecombinant Saccharomycescerevisiaeyeastcellsexpressingdisease-relatedantigens”；为 一种由热失活、全重组酿酒酵母细胞-表达与疾病相关抗原为基础的治疗性疫苗。该研究开 创了以胞内重组表达蛋白为抗原，以酿酒酵母细胞为佐剂的治疗性疫苗平台。在此平台下 已有编号为GS4774为乙型肝炎治疗性疫苗，其他表达的HBV抗原为一种作为融合蛋白的x- s-core抗原。这一酵母载体可以提供多种抗原进入MHCI类和II类抗原提呈途径，刺激强有 力的CD4+和CD8+细胞反应，并能打破免疫学小鼠模型中抗原的耐受性。该酵母载体也不容 易在体内被中和，因此适合于重复用药，使之获得长期的免疫压力，理想地清除慢性细胞内 感染，如HCV和HBV。

2010年Huang报道：啤酒酵母细胞壁纯化而得的β-葡聚糖颗粒(GPS)，其中具有1, 3-D-glucan聚合物>85％，2％甲壳素，1％脂类和蛋白质，与其余的大部分是灰和水分。进行 的体外T细胞增殖实验中，将卵清蛋白(OVA)复合至空心GPS壳内(GP-OVA)组成的疫苗，并采 用游离OVA为对照抗原。GPS-OVA在从0.03到0.5μ克/毫升的浓度范围内，刺激OT-I或OT-II T细胞增殖；相反，游离OVA未能刺激OT-I或OT-IIT细胞性增殖。为了实现GP-OVA相似的刺 激效应，要求游离OVA浓度提高百倍至数百倍。这些结果表明：(1)病毒样颗粒GPS是Dectin- 1受体的高效激动剂；(2)病毒样颗粒GP-OVA传递的抗原与游离OVA抗原相比，能被DCs(树突 细胞)更高效地处理和提呈。

2003-2005年期间美国科学家报道了：乙肝病毒感染黑猩猩系列研究结果。控制疾 病的机制是肝细胞核HBV池的共价闭合环状DNA(cccDNA)。由于产生IFN-γ的HBV特异性CD8 +T，即CTL细胞，大量涌入肝内，靶向感染HBV的肝细胞；对cccDNA的清除、肝细胞感染HBV逆 转都与肝脏CD8+T细胞产生的IFN-γ涌入等相关。集合这些结果表明，cccDNA的清除是一个 由细胞免疫反应介导的两步的过程：第一步非细胞损伤地减少90％以上cccDNA分子池，从 而消除HBV松弛的环状脱氧核糖核酸的前体。第二步提高了这个过程中损毁受感染的肝细 胞，并触发免疫逆转。

2014年中国科技大学博士曾筑天报道：通过水动力法建立了HBV持续携带小鼠来 模拟HBV慢性感染者的免疫耐受状态，发现IL-12预处理与IL-12同HBsAgVLP疫苗共注射的 联合治疗方式,称为基于IL-12的疫苗疗法,可以有效逆转HBV系统性免疫耐受,进而导致 HBV清除。发现HBV小鼠经历过基于IL-12的疫苗疗法之后,淋巴结内滤泡样辅助T细胞(Tfh) 以及生发中心B细胞(GCB)都发生显著扩增,与之相对应地,脾细胞中HBsAg特异性IgG生成 细胞也显著增加,大部分小鼠在治疗后期血清中出现保护性抗体anti-HBs；此外,T细胞体 外对HBsAg刺激的增殖能力在IL-12联合疫苗治疗之后也得到显著恢复。这些结果充分证实 HBV耐受小鼠在IL-12联合治疗过程中,对外周HBsAg疫苗的应答得以恢复,从而提示HBV诱 导的系统性免疫耐受已被逆转。基于现有技术文献可以得出提供一种具有更好疗效的乙肝 治疗疫苗成为现有技术中亟待解决的问题。

发明内容

为解决前述技术问题，提供一种具有更好疗效的乙肝治疗疫苗，本发明采用的技 术方案为：

提供一种基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗， 其特征在于：所述乙肝治疗疫苗以重组汉逊酵母细胞内表达的HBsAg及HBcAg为抗原；含有 19个HBsAg特异性CTL表位和19个HBcAg特异性CTL表位；所述乙肝治疗疫苗以热灭全重组汉 逊酵母细为佐剂。

所述乙肝治疗疫苗，其特征是所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为adw亚型，所述重 组汉逊酵母表达HBsAg的DNA序列如SEQIDNO:1所示；所述重组汉逊酵母表达的HBsAg的氨 基酸序列如SEQIDNO：2所示。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征是所述重组汉逊酵母表达HBcAg的DNA序列为SEQID NO：3所示；所述重组汉逊酵母表达的HBcAg的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为病毒样颗粒 结构，由HBsAg插入汉逊酵母类脂组成，所述HBsAg的14个半胱酸中有9～12个形成二硫键； 所述重组汉逊酵母表达的HBcAg为病毒样颗粒结构。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于的热失活重组汉逊酵母的热失活条件为：热失 活温度52℃-56℃，热失活时间1小时-3小时。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg共含有如下19 个CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、 LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、 VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBcAg共含有如下19 个CTL表位：SFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIRDLL、SYVNVNMGL、SYVNVNMGLKI、 YVNVNMG、YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、 AYRPPNAPI、AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTVVRR、RGRSPRRRTP。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述乙肝治疗疫苗的剂型选自预充式注射液 剂、注射液剂或冻干粉针剂。

所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于还含有HBsAg原液或铝佐剂HBsAg中的一种。

本发明还提供了一种重组多形汉逊酵母菌，所述的重组多形汉逊酵母菌中含有 SEQIDNO:1所示DNA序列。优选所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中整合有SEQIDNO: 1所示DNA序列。

本发明还提供了一种重组多形汉逊酵母菌一种重组汉逊酵母菌，所述的重组多形 汉逊酵母菌中含有SEQIDNO:3所示DNA序列。优选所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中 整合有SEQIDNO:3所示DNA序列。

以上任一所述重组汉逊酵母的宿主多形汉逊酵母细胞株为HU-11，保藏编号为 CGMCCNo.1218，所述宿主多形汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被破坏的DNA序列 如SEQIDNO：5所示。

本发明提供的乙肝治疗疫苗，在一种每10⁸细胞中含有6-10μgHBsAg的重组汉逊 酵母菌基础上，可以在现有的作为佐剂的全重组汉逊酵母细胞的人体注射上限范围内，最 大限度提高HBsAg的注射量，提高其扭转乙肝患者免疫耐受状态的效果。失活全重组汉逊酵 母细胞为最主要专职抗原递呈细胞(DC)的Dectin-1受体的高效激动剂。HBsAg特异性CTL细 胞靶向感染HBV的肝细胞释放IFN-γ：第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上cccDNA分子 池，第二步提高了过程中损毁受感染的肝细胞，并触发HBV免疫逆转。同时我们提供的重组 汉逊酵母细胞表达的作为抗原的HBsAg中至少含有19个CTL表位，可以提高HBsAg的免疫原 性和反应性。在优选的技术方案中的通过优选表达HBsAg的DNA序列(SEQIDNO：1)，优选了 21个CTL中的19个CTL表位，进一步提高了优选HBsAg的免疫原性和反应性。

同时采用了能够产生HBcAg重组汉逊酵母热失活细胞与产生HBsAg的重组汉逊酵 母的热失活细胞进行配伍，采用的HBcAg(高免疫反应活性)优选码基因与C2基因型、亚型双 代表序列AF100309.1比较；缺失59-69位：ILCWGELMNLA共11个氨基酸。根据冷冻电镜图像重 建技术确定HBcAg颗粒结构；显示HBcAg二聚体各包含4条α螺旋,即每个HBcAg亚基通过两个 长α螺旋形成二聚体界面；其中位于第51～78位氨基酸的长α螺旋,头尾被第50和79位保守 的Pro所限制。深埋在二聚体内部，不存在CTL表位。α螺旋即所谓的3.6螺旋,其中每个氨基 酸旋转100°，3.6个氨基酸旋转360°原来的51～78位共18个氨基酸形成旋转5周的α螺旋；缺 失59-69位：ILCWGELMNLA共11个氨基酸后，剩余的7个氨基酸形成旋转2周的α螺旋。而另一 个形成HBcAg二聚体界面的长α螺旋，即位于第82-110位的纽结状α螺旋,终止于第111位Gly 没有任何改变。因此本专利基本未改变两个长α螺旋形成二聚体界面,上述缺失11个氨基酸 的HBcAg在重组汉逊酵母细胞中仍能组装成病毒样颗粒(VLP)；仍保持其热稳定性。免疫反 应检测结果表明：上述缺失氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg工程菌株(HC-40-25，172个氨基 酸)与全长氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg工程菌株(183个氨基酸)HC-43相比：前者免疫反应 原性为后者的三倍以上。在优选了CTL表位、表达序列及重组汉逊酵母工程菌株的基础上， 本发明还优选了重组汉逊酵母细胞的热失活工艺，保证了疫苗的疗效与安全性。

预期本发明提供的基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝 治疗疫苗将具有更高的免疫原性，能够更好的用于乙肝的治疗。

附图说明

图1为质粒pMPT-HBS-adw的构建过程示意图；

图2为pMPT-HBC质粒的物理图谱；

图3为筛选得到工程菌株HS604-5的PCR扩增产物电泳照片；

图4为重组汉逊酵母得到的重组HBsAg的纯品(原液)的电镜照片；

图5为实施例2中重组汉逊酵母HBsAg工程菌株的构建中重组汉逊酵母的转化与筛 选步骤流程图。

具体实施方式

汉逊酵母胞内质粒pMPT-02的开发：

汉逊酵母表达系统包括两个主要元件：

(1)启动外源基因高效表达的载体系统(质粒)；(2)具有特定筛选标记的宿主细 胞。

应用基因合成技术，将汉逊酵母MOX(甲醇氧化酶)启动子1.5kb、汉逊酵母MOX(甲 醇氧化酶)终止子350bp、汉逊酵母自主复制序列HARS，1.0kb、和酿酒酵母脲嘧啶基因 ScURA31.1kb；将以上5部分基因元件紧密相连后，再插入pBluescripⅡ质粒中，构建成穿梭 质粒pMPT-02。为本申请人的非独占专有技术。

脲嘧啶营养缺陷型URA3^-宿主细胞株HU-11的开发：

利用同源序列介导的同源整合构建了乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破 坏的重组多形汉逊酵母菌株HU-11(CGMCCNo.1218)。该菌株与目前国内外所用由诱变产生 的营养缺陷型宿主菌株相比，具有遗传稳定性高，回复突变率低的特点；便于进行遗传转化 和重组菌株的筛选，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重组菌株培养和外源蛋 白的高效表达，具有较高的工业应用价值。汉逊酵母基因被破坏宿主菌HU11株URA3基因的 DNA测序结果表明：基因被破坏结果导致第31位碱基后，插入GAAGT五个碱基。GAAGT五个碱 基的插入产生移码突变。移码突变导致第11位后的254个密码子全部被置换。GAAGT五个碱 基同时产生回复突变的概率极小，实验检测也证明宿主菌HU11株的回复突变率为零；这种 “0”回复突变率的宿主菌对转化筛选特别有利。应用上述基因敲除技术建立的URA3^-营养缺 陷型宿主细胞株HU-11(CGMCCNo.1218)本专利权人已申请的发明专利为CN1651570A。宿主 汉逊酵母菌HU-11乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破坏的DNA序列为SEQIDNO：5。

重组汉逊酵母HBsAg-adw2优选码基因设计：

本发明提供的重组汉逊酵母表达乙肝表面抗原(HBsAg)的DNA序列基于HBsAg adw2亚型设计，如SEQIDNO：1所示，所述HBsAg的氨基酸序列为SEQIDNO：2。

本发明提供的重组汉逊酵母表达乙肝核心抗原(HBcAg)的DNA序列如如SEQID NO：3所示，所述HBcAg的氨基酸序列为SEQIDNO：4

汉逊酵母胞内型质粒pMPT-HBS-adw和pMPT-HBC的构建：

按照SEQIDNO：1所示序列的合成核苷酸序列(以下简称HBsAgadw2基因)；并构 建成含HBsAgadw2基因质粒的甘油菌；测序正确后的质粒用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，酶切产 物切胶回收701bp的目的片段DNA。

将酶切鉴定正确的质粒pHMPT-02用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，切胶回收后所得到的 载体DNA连接后得到汉逊酵母胞内型质粒pMPT-HBS-adw，将质粒pMPT-HBS-adw热转化至 E.coliCompetentCellJM109(CodeNo.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。从转化平板 上挑选单菌落，提取质粒DNA后用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，酶切结果表明均为阳性克隆。测序 证明质粒pMPT-HBS-adw结果正确。

HBsAgadw2基因插入汉逊酵母表达系统胞内型质粒pMPT-02的多克隆位点:EcoR Ⅰ和BamHⅠ之间。质粒pMPT-HBS-adw全长为7665bp。质粒pMPT-HBS-adw的构建过程示意图如 图1所示。

按照与构建质粒pMPT-HBS-adw同样的的方法，构建基于SEQIDNO：3所示序列的 质粒pMPT-HBC。pMPT-HBC质粒的物理图谱如图2所示。

重组汉逊酵母HBsAg工程菌株和重组汉逊酵母HBcAg工程菌株的构建：

为了构建重组汉逊酵母乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)工程菌株，应用申请人开 发的细胞电穿孔技术，经RC脉冲:幅度1500V,电容22μf,时间常数3-5ms电击1次，采用pMPT- HBS-adw质粒，转化已敲除URA3-基因的HU-11株(CGMCCNo.1218)的汉逊酵母细胞。在MD选 择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子，转接MD液体培养基后连续传代培养，使adw2亚 型HBsAg基因及相应调控组件多拷贝、外源整合入宿主汉逊酵母细胞染色体中。经过对一千 余株转化子单菌落进行如下三步筛选：

(1)转化子单菌落大、细胞生长快的克隆株为多拷贝的机率大。

(2)应用PCR技术对比HBsAg基因和单拷贝数MOX(甲醇氧化酶)基因的电泳条带亮 度，半定量地确定HBsAg基因拷贝数。

(3)检测经甲醇诱导、摇瓶培养72小时的转化子细胞破碎后释放出HBsAg的表达水 平。

将PCR技术应用于转化子筛选为本申请的一项新创造；对确定外源基因HBsAg多拷 贝、异源整合在汉逊酵母染色体中，而汉逊酵母染色体中MOX基因完整存在，未被破坏，都具 有重要作用；它们体现了汉逊酵母表达系统独优势。为此设计了一对引物可同时扩增汉逊 酵母染色体中MOX基因(单拷贝)和异源整合HBsAg外源基因(多拷贝)。通过比较扩增产物在 琼脂糖凝胶电泳中条带的亮度可大致判断HBsAg基因是否为多拷贝。此方法用于工程菌 HBsAg基因多拷贝菌株的初步筛选。所扩增的HBsAg片段长度为800bp，扩增的MOX片段长度 为2000bp。

设计使用引物序列：primerforward：5‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-’3

primerreverse：5‘-TACTGCTGCCAGTGCACGGTG-’3

PCR产物琼脂糖凝胶电泳：工程菌HBsAg基因扩增产物大小约800bp，汉逊酵母单拷 贝基因MOX基因扩增产物大小约2000bp。最终筛选得到的重组汉逊酵母乙型肝炎病毒表面 抗原(HBsAg)工程菌株编号为HS604-5。

采用质粒pMPT-HBC，以构建重组汉逊酵母HBsAgadw2亚型工程菌株同样的方法构 建并筛选得到的工程菌株PCR扩增产物电泳照片如图3所示，图3中1为Marker。最终重组汉 逊酵母HBcAg工程菌株编号为HBC-40-25。

重组汉逊酵母HBsAgadw2亚型工程菌株发酵液胞内HBsAgVLP表达量的测定

以天坛生物提供的adw2亚型HBsAg乙肝表面抗原冻干标准品10μg用稀释液溶解对 倍稀释成1024ng/mL、512ng/mL、256ng/mL、128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、 4ng/mL、2ng/mL、0ng/mL(稀释液)共11个标准点，放免试剂盒检测HBsAg反应。

重组汉逊酵母工程菌株进行中试规模发酵，发酵87小时取样10OD_600nm1mL,玻璃珠 破碎细胞(细胞破碎率为65％)后，样品稀释200倍与标准品同时参与放免试剂盒反应，由 γ-计数器自动完成拟合曲线得出的HBsAg抗原表达量为126.9(ng/mL)。以此计算重组汉逊 酵母胞内HBsAg抗原表达量为：

126.96(ng/mL)×200÷10×4.0×10⁷×65％/mL＝9.8μg/10⁸细胞

重组汉逊酵母HBsAgadw2亚型工程菌株发酵液得到的重组HBsAg的纯品(原液)的 电镜照片如图4所示。结果显示重组HBsAg的高纯度、高浓度和病毒样颗粒(VLP)结构稳定。

经同样方法测定重组汉逊酵母HBcAg工程菌株发酵液胞内HBcAgVLP的表达量，为8 ～12μg/10⁸细胞。

重组汉逊酵母HBcAg细胞内病毒样颗粒(VLP)的表达

近代分子生物学的中心法则为：DNA-＞RNA-＞氨基酸一级序列-＞蛋白分子高级 结构-＞蛋白分子功能；符号-＞表示：决定。

不同基因型乙肝病毒核心抗原HBcAg蛋白分子由183或185个氨基酸残基组成一级 序列，从而决定了HBcAg的二级结构、三级结构和四级结构。实验表明：不管是分离的乙肝病 毒颗粒、还是感染细胞内、重组大肠杆菌及重组酵母菌分离的HBcAg均发现其可装配成大小 两种颗粒：T＝3型由180个分子量21kD的相同蛋白质亚基即90个同型二聚体构成，直径为 30nm，4表面有90个刺突；T＝4型由240分子量21kD的相同蛋白质亚基即120个同型二聚体构 成，直径为34nm，表面有120个刺突。

本专利HBC-40-25工程菌细胞破碎液粗提液的透射电镜照片明显可见HBcAg病毒 样颗粒。上述缺失氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg工程菌株(HC-40-25，172个氨基酸)，与全长 氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg(183个氨基酸)的HBC-17等6个强阳性株相比(摇瓶培养甲醇 诱导3天的1OD_600nm.ml细胞，经玻璃珠破碎，1000倍稀释样品)，检测免疫反应原性(单位为 NCU/mL)结果如下：

HBC-40-25株的免疫反应原性为其它6个强阳性株的三倍以上。

优化的热失活重组汉逊酵母HBsAg和HBcAg细胞条件

为了确定热失活重组汉逊酵母的最佳条件，应满足以下要求：(1)热失活重组汉逊 酵母的成活率尽可降低；(2)保持全重组汉逊酵母细胞结构，酵母细胞内抗原不泄漏；(3)保 持重组汉逊酵母细胞内表达HBsAg病毒样颗粒(VLP)和HBcAg病毒样颗粒(VLP)热稳定，使其 抗原反应活性不下降。其中热失活重组汉逊酵母细胞内HBsAg和HBcAg病毒样颗粒(VLP)的 热稳定性成为首次要解决的问题。为此设计了16组不同温度(50℃、52℃、54℃、56℃和58 ℃)，及不同时间(1h、2h和3h)的重组HBsAg和HBcAg汉逊酵母的热失活试验，并设20℃为对 照组。通过检测：随着热失活温度、时间的昇高，导致细胞壁外层溶解度加大，细胞破碎率增 加，胞内HBsAgVLP抗原反应性在52℃、1h出现倍增的峰值；而HBcAg抗原反应性在56℃、1h出 现倍增的峰值。胞外HBsAg和HBcAg抗原反应性在热失活试验的全部温度与时间范围内均极 低，表明胞内VLP未外泄，保持热失活重组汉逊酵母细胞完整。热失活细胞成活率在56℃、3h 条件下已低至50,000之1。从而为优化热失活重组汉逊酵母细胞的条件提供了依据。

HBsAg及HBcAg特异性CTLT细胞非细胞损伤地触发免疫逆转

乙肝病毒感染黑猩猩系列研究结果表明：HBsAg特异性CTLT细胞，靶向感染HBV的 肝细胞释放IFN-γ；第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上cccDNA分子池，第二步提高了 这个过程中损毁受感染的肝细胞，并触发免疫逆转。依据CTL表位的实验综述、预测和专利 发明等三篇文报道：HBV衣壳抗原(Pre-S1-Pre-S2-HBsAg)不重复CTL表位共23个。本申请的 HBsAg氨基酸序列中共含有以下19个CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、 WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、 LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、 SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。本申请的HBcAg氨基酸序列中共含有以下19个CTL表位： SFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIRDLL、SYVNVNMGL、SYVNVNMGLKI、YVNVNMG、 YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、AYRPPNAPI、 AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTVVRR、RGRSPRRRTP。

本发明提供的乙肝治疗疫苗产品优先为预充式注射液剂：

实验证明常规分装重组乙肝疫苗(酵母)预充注射液剂，37℃放置45天的热稳定性 实验表明疫苗的体外相对效力(RP)均符合要求,而常规分装乙肝疫苗在相同保存条件下RP 均不符合要求。预充注射器分装的重组乙肝疫苗(酵母)可在短时间内脱离冷链运输、保存 和使用。

预充注射器1针1盒，使用方便、使用方法和要领易于掌握,为一次性注射器,不能 重复使用。疫苗接种时不需另备注射器,可防止使用玻璃注射器消毒不彻底造成感染或传 播传染病以及针头选择不当影响接种效果,避免一次性注射器被重复使用的危险。

预充注射器分装的乙肝疫苗全程接种具有良好的综合费用效益比。

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1

基于所述SEQIDNO：1构建的pMPT-HBS-adw质粒(即包含所述SEQIDNO：1的表达 载体)。质粒pMPT-HBS-adw的构建工作包含以下内容：

按照我们设计的SEQIDNO：1序列合成了HBsAgadw2基因；并构建成含HBsAg adw2基因质粒的甘油菌，将其命名为MC407B-16。

测序正确后的MC407B-16号质粒用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，酶切产物用TaKaRaPCR FragmentRecoveryKit(CodeNo.D301)切胶回收701bp的目的片段DNA称为InsetDNA6。

将酶切鉴定正确的质粒pHMPT-02用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，切胶回收后所得到的 载体DNA称为VectorDNA6。

使用TaKaRaDNALigationKit(CodeNo.D6022)中的Solution，将InsetDNA6与 VectorDNA6连接后，热转化至E.coliCompetentCellJM109(CodeNo.D9052)中，涂布平 板过夜培养菌体。从转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA后用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，酶切 结果表明：MC407A+B+C+D-77∽80均为阳性克隆。

将MC407A+B+C+D-77号质粒分别用引物RV-M，M13-47，MC407P1，MC407P2，MC407P3， MC407P4，MC407P5，MC407P6，MC407P7，MC407P8，MC407P9，MC407BF11，MC407BR11测序，证明 质粒pMPT-HBS-adw结果正确。

以同样的方法，基于所述SEQIDNO：3构建的pMPT-HBC质粒。

实施例2

重组汉逊酵母HBsAg工程菌株的构建。

重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的转化与筛选图示说明：重组汉逊酵母的转化与筛选 过程如图5所示：

具体包括

1)应用细胞电穿孔法，将pMPT-HBS-adw质粒，转化作为宿主细胞的URA3-营养缺陷 型汉逊酵母细胞株HU-11(CGMCCNo.1218)。采用选择培养基(MD液体培养基)平皿培养。在 MD选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子，转接MD液体培养基后连续传代培养，使 adw2亚型HBsAg基因及相应调控组件多拷贝、外源整合入宿主汉逊酵母细胞染色体中。

2)菌株筛选包括以下步骤

(1)选择尿嘧啶原养型转化子单菌落

挑选菌体生长速度快的菌落，应用PCR技术检测HBsAg基因条带亮度后，挑选拷贝 数多的菌落，采用选择培养基对单菌落进行摇瓶培养，连续传代培养20～400个世代；

(2)筛选多拷贝异源整合转化克隆株，

经过步骤(1)传代培养后，经甲醇诱导培养72小时后，采用/放射免疫分析(Radio immunoassayorradioimmunoassay，RIA)测定转化子细胞破碎后释放出HBsAg的表达水 平；

(3)筛选去除游离质粒的高拷贝、高表达克隆株

将经过步骤(2)筛选的克隆株，采用YPD完全培养基培养48小时后，转接选择培养 基平皿克隆化培养，并采用定量PCR检测HBsAg基因拷贝数，以RIA检测HBsAg表达水平。

(4)在步骤(3)的检测结果基础上，选择遗传稳定的重组汉逊酵母HBsAg工程菌的 原代菌株。

按照同样的方法，构建并筛选重组汉逊酵母HBcAg工程菌株。

实施例3、30升中试发酵(重组汉逊酵母HBcAg工程菌株和重组汉逊酵母HBsAg工程 菌株采用相同的发酵工艺方法)

主要工艺过程和操作要点：

1)以200ml种子培养基解冻贮存菌种，接种至培养基中，均分两个0.5L摇瓶，31℃ 培养22小时作为一级种子；

2)以1600ml种子培养基将一级种子转接入二级种子培养基中，均分6个1L摇瓶，31 ℃培20小时作为二级种子；

3)将12L发酵培养基调pH至5.5加入30L发酵罐中，将二级种子接入后，30-31℃经 甘油、甲醇两碳源，生长、去阻遏和诱导三时相，共培养85-96小时，在停止诱导2-3小时后收 获细胞。将冷冻的细胞匀浆。

操作要点：

(1)生长时相的补料操作要待溶氧有明显下降，基础培养基消耗时开始进行，并且 随着基础培养基消耗量的增加逐步提高流加速度，待溶氧回升前2-3小时流加完毕。

(2)生长时相的后期要注意溶氧回升，记录溶氧最低值，溶氧回升至70-80％时开 始流加，进入去阻遏时相。

(3)去阻遏时相后期，流加结束后，溶氧开始回升。溶氧回升至70-80％℅时开始流 加甲醇诱导溶液，将甲醇浓度控制在3-5‰，由甲醇检测流加控制器控制流加速度。

发酵结束前2-3小时停止甲醇流加，以减少细胞收获时甲醇残留。

培养基

1.氯化钙溶液的配制

准确称量CaCl₂11.33g，放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至 200ml。

2.微量元素溶液的配制

准确称量以下试剂：

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至200ml。

3.维生素溶液的配制

准确称量以下试剂：

d-Biotin6mg

ThiaminHCl2000mg

将生物素首先溶解在10ml的50％异丙醇中，待溶解后再加入ThiaminHCl，然后加 适量去离子溶解后水定容至100ml。

4.痕量元素溶液的配制

准确称量以下试剂：

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子溶解后水定容至50ml。

以上四种溶液分别除菌过滤备用。

5.种子盐溶液的配制

准确称量以下试剂：

将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至1600ml。

6.用2000ml三角瓶称取甘油27g，混合盐溶液360mL，加去离子水定容至1800ml,等 量分装于两个2000ml三角瓶中，110℃、30分钟高压蒸汽灭菌。

110℃、30分钟高压蒸汽灭菌空消500ml三角瓶2个，1000ml三角瓶6个，100ml和 500ml量筒各一个。

7.一级种子培养基在超净台中，无菌操作量取灭菌后的甘油水溶液各100ml，分别 置于灭菌后的2个500ml三角瓶中，并分别加入：

将加入的溶液摇匀。

8.二级种子培养基

在超净台中以无菌操作技术取灭菌后的甘油水溶液1600ml置于灭菌后的2000ml 三角瓶中，并分别加入：

9.发酵培养基

准确称量以下试剂并溶解于2000ml去离子水中。

取一个500ml小烧杯称取520g甘油，加泡敌10ml在线灭菌，然后加：

10.补料培养基

取一个1000ml三角瓶，量取87gNH₄H₂PO₄、260g甘油，加去离子水500ml，加入包裹 好的补料管线，110℃、30分钟灭菌。

11.去阻遏溶液

用5000ml三角瓶，量取甘油1800g，加去离子水660ml，加入包裹好的补料管线，110 ℃、30分钟灭菌，冷却后无菌操作加入过滤除菌的盐溶液540ml。

12.诱导溶液

用1000ml三角瓶，量取甘油400ml，加入包裹好的补料管线，110℃、30分钟灭菌，冷 却后无菌操作加入甲醇1600ml。

实施例4

纯化，HBsAg和HBcAg采用同样的纯化工艺，以HBsAg为例，工艺如下：

将实施例3得到的重组汉逊酵母HBsAg工程菌株发酵液经收获细胞并洗涤细胞，纯 化的详细步骤可参见参考文献：李津，孔艳.重组乙型肝炎疫苗生产工艺.见李津，俞詠霆， 董德祥主编：生物制药设备和分离纯化技术.第1版.北京：化学工业出版社，2003：348- 349.。其中可将上述收获的细胞经过匀浆器破碎，释放出HBsAg；以0.22μm微孔滤器过滤去 除细胞碎片；再以300K超微滤器超滤去除小分子杂质；以硅胶吸附处理法提取HBsAg；最后 以丁基琼脂糖疏水层析方法精制纯化。

实施例5

热失活重组汉逊酵母细胞最佳条件试验

为了确定热失活重组汉逊酵母的最佳条件应满足以下要求：

(1)热失活重组汉逊酵母的成活率尽可降低；使之小于5％。

(2)保持完整的细胞结构；发挥多价位热失活重组汉逊酵母佐剂活性作用；

(3)保持重组汉逊酵母细胞内表达的病毒样颗粒(VLP)完整，使其抗原性不下降。

以上三点是热失活重组汉逊酵表达HBsAg和HBcAg生产工艺主要条件；将为制定疫 苗制造及检定规程提供依据。其中热失活重组汉逊酵母细胞内病毒样颗粒(VLP)的热稳定 性成为首次要解决的问题。

(1)、优化条件的热失活重组汉逊酵母细胞制备。

重组汉逊酵母HBsAg工程菌(HS604-5株)细胞培养经发酵或摇瓶诱导培养结束后。 细胞用离心法在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤三次，将沉淀的汉逊酵母悬浮在计算体积的PBS 中。细胞使用OD_600nm计数，PBS稀释为10OD_600nm/毫升,每支试管2毫升；每试验组设破碎与不 破碎2支试管；16个试验组共需制备32支细胞样品试管。

放在设定温度水浴，经设定间时热失活重组汉逊酵母。

热失活重组汉逊酵母应在加有氯霉素完全培养基琼脂皿于37℃培养3天；计数其 成活率。

热灭活汉逊酵母储存在4摄氏度以供进一步使用。

(2)、重组汉逊酵母HBsAg工程菌(HS604-5株)细胞热灭活试验组设立：

共16个试验组。热灭活后采用放免HBsAg试剂检测HBsAg抗原活性；1：100稀释和1： 1000稀释，设复管。检测结果用于分析确定本项新乙肝疫苗汉逊酵母热失活的优化工艺条 件。

(3)、重组汉逊酵母HBcAg工程菌细胞热灭活试验组设立

共16个试验组。热灭活后采用放免HBcAg试剂检测HBcAg抗原活性；1：100稀释和1： 1000稀释，设复管。检测结果用于分析确定本项新乙肝疫苗汉逊酵母热失活的优化工艺条 件。

参考文献

1、齐小秋等，全国人群乙型病毒性肝炎血清流行病学调查报告，2011年4月第1版， 人民卫生出版社。

2、BowenDGet.al,Intrahepaticimmunity:ataleoftwosites？BowenDGet.al,TrendsImmunol.2005,26(10):512-7.

3、ThomasH.King1,et.al,AWholeRecombinantYeast-BasedTherapeutic VaccineElicitsHBVX,SandCoreSpecificTCellsinMiceandActivatesHuman TCellsRecognizingEpitopesLinkedtoViralClearance，2014,POLS。

4、HaibinHuanget.al,RobustStimulationofHumoralandCellular ImmuneResponsesfollowingVaccinationwithAntigen-Loadedβ-GlucanParticles， 2010，MBio.asm.org，1(3)：1-7。

5、RobertThimmeet.al,CD8+TCellsMediateViralClearanceandDisease PathogenesisduringAcuteHepatitisBVirusInfection，JOURNALOFVIROLOGY, 2003,p.68–76。

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8、ThimmeRet.al,CD8(+)Tcellsmediateviralclearanceanddisease pathogenesisduringacutehepatitisBvirusinfection；JVirol.2003Jan；77(1): 68-76。

9、曾筑天，肝脏诱导系统性免疫耐受及其逆转研究，中国科学技术大学博士学位 论文，2014。

10、申请人：复旦大学，一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗，2009年，申请公 布号：CN102038948.A。

11、FlorianKBihlet.al,SimultaneousassessmentofcytotoxicT lymphocyteresponsesagainstmultipleviralinfectionsbycombinedusageof optimalepitopematrices,anti-CD3mAbT-cellexpansionand"RecycleSpot"； JournalofTranslationalMedicine2005，3：201-19。

12、YujiSobaoet.al,IdentificationofhepatitisBvirus-specificCTL epitopespresentedbyHLA-A*2402,themostcommonHLAclassIalleleinEast Asia，JournalofHepatology，2001，34：922-929。

16、发明人吴玉章等；用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原及其制备方 法和用途；公开号：CN1483736A。

17、邓小燕，人全基因组乙型肝炎病毒基因(亚)型间重组体研究，重庆医科大学博 士学位论文，2012年5月。

SEQUENCELISTING

<110>汪和睦

<120>基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗

<160>5

<210>1

<211>681

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atggagaacatcacttcagggtttctaggacctctcctggtgttgcaggcgggcttcttc60

ctgttgacccgaatcctcaccataccgcagagtctggatagctggtggacgtctctcaac120

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tatctgtgggagtgggccagcgtcagattctcttggctctcccttctagtgccattcgtc540

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tggggtccatcgctctacagcattgttagtccctttatcccactgctgcccattttcttt660

tgcctttgggtttacatctaa681

<210>2

<211>226

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

MetGluAsnIleThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuGln

151015

AlaGlyPhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIleProGlnSerLeu

202530

AspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlySerProValCys

354045

LeuGlyGlnAsnSerGlnSerProThrSerAsnHisSerProThrSer

505560

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65707580

IleIlePheLeuPheIleLeuLeuLeuCysLeuIlePheLeuLeuVal

859095

LeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeuIleProGly

100105110

SerThrThrThrSerThrGlyProCysLysThrCysThrThrProAla

115120125

GlnGlyAsnSerMetPheProSerCysCysCysThrLysProThrAsp

130135140

GlyAsnCysThrCysIleProIleProSerSerTrpAlaPheAlaLys

145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

ValSerProPheIleProLeuLeuProIlePhePheCysLeuTrpVal

210215220

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225

<210>3

<211>519

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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tcggattttttcccttccattcgagaccttctcgacaccgcctctgccctgtatcgtgag120

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cgtcgcagacgttctcaatctcgggagtctcagtgctaa519

<210>4

<211>172

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

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151015

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65707580

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<212>DNA

<213>人工序列

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