通过使用邻近条形编码分析分子复合物的概况的方法

摘要

本发明涉及用于通过用分子构建体的至少一个集合标记属于相同复合物的分子而研究个别分子复合物的组分的方法，其中所述集合的各成员包含独特标识序列(UIS)和至少一个共同标签序列(CTS)，所述独特标识序列是对于所述集合的各成员独特的核酸序列，所述共同标签序列是所述集合的所有成员共同的核酸序列，所述方法通过以下实现：?通过将所述分子构建体连接或杂交至所述复合物的核酸分子、或将所述标签连接或杂交至与特异性结合至所述复合物的组分的亲和结合剂连接的核酸而将所述分子构建体连接至所述复合物，?通过在核酸聚合反应中使用所述分子构建体标签作为引物或模板而标记属于所述相同复合物的分子，和?通过分析UIS和CTS的组合来分析所述分子复合物的组成。

说明书

发明领域

本发明涉及分子生物学方法，并且尤其涉及研究分子诸如DNA、RNA和蛋白的复合物或研究单细胞中的这些分子的方法。

发明背景

目前存在几种可用于研究分子复合物(例如蛋白复合物、蛋白-DNA复合物)的技术。共-免疫沉淀(共-IP)使用不同的捕获抗体和检测抗体来分析相互作用蛋白复合物。邻近连接测定(PLA)或邻近延伸测定(PEA)使用以下理念：仅当两个或更多个亲和探针结合至相邻或相互作用蛋白时，使抗体上缀合的结合的DNA寡核苷酸邻近，且因此允许酶促连接或延伸和形成新的可扩增的报告DNA分子。在染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)中，使用抗体来捕获具有其结合的DNA片段的目标蛋白。然后将DNA片段测序以揭示蛋白在染色质上结合的位置。

当在分子水平研究生物调节时，这些方法已经提供了有用知识。然而，所有这些方法都具有不能鉴定和定量来自各个别复合物的所有组分、特别是分析所述复合物的概况的限制。例如，Chip-seq能够揭示蛋白结合至染色质的位置，但它无法揭示两个或更多个蛋白是否同时结合至染色质上的相同区域。

对于单细胞研究，流式细胞仪允许细胞流过细通道和以高达几千个细胞/秒的速度逐个检测来自单细胞的信号。为了平行分析几种蛋白，不同抗体可以用不同荧光团标记。然而，当同时检测许多荧光信号时，可以出现光谱重叠。为了避免该问题，质谱流式细胞仪(masscytometer)，通过使用质量同位素来标记抗体，可以最小信号重叠分析多于30种蛋白。然而，多重容量(multiplexing capacity)在基于流的测量中仍然受限，并且它们还不适合于核酸分析。一种针对单细胞实现高度多重分析的方式是通过将细胞分选入分离的反应孔中，且分别分析各单细胞的组分。例如，在单细胞RNA-Seq中，手动或在自动化帮助下将单细胞分选至单一孔中，所述自动化例如，荧光活化细胞分选(FACS)，随后细胞裂解，逆转录(RT)和测序具有样品条形码的文库制备物。然后，可以将不同细胞的条码编码产物合并在一起且通过下一代测序(NGS)进行测序。通过该程序，可能分析几百个细胞，但分选许多单细胞，例如多于10 000个单细胞且个别进行随后的文库制备仍然是非常费力的。甚至使用自动化系统，如C1™单细胞自动制备系统，制备许多细胞的测序文库仍然是困难的任务。

WO2012/042374目的在于提供用于使用具有独特序列的核酸分子标签测定样品中的分子的数目或浓度的方法。

Hindson等人,Analytical>, 2011, 83, 8604-8610公开了用于DNA拷贝数的绝对定量的高通量液滴数字系统。

WO2012/048341目的在于提供用于高通量单细胞分析的方法和组合物。所述方法和组合物可用于基因组和转录组分析，以及抗体发现、HLA分型、单体型分析和药物发现。

Binladen等人(PLoS ONE 2(2):e197)使用用59-核苷酸标签化的引物的常规PCR 以便从多个样本生成同源DNA扩增产物，随后通过高通量DNA测序系统进行测序。随后通过59标签分析将各DNA序列回溯至其个别来源。

Landegren等人(J. Mol. Recognit. 2004; 17:194–197)讨论了使用称为扣锁探针和邻近连接探针的基于连接的试剂的集合，以满足涉及基因组计划过程中鉴定的所有大分子的特异性检测的挑战。所述探针包括分别对特定核酸和蛋白分子具有亲和力的元件，连同编码识别的目标分子的身份的独特标识DNA序列元件。

发明概述

本发明采用以下概念：属于相同分子复合物或细胞的分子是邻近的，使得它们具有更高的机会被相同独特标识序列(UIS)或独特标识序列(UIS)的相同集合条形编码。

本文所述的方法使用一个或多个UIS来标记属于相同分子复合物的组分各自的寡核苷酸。属于相同复合物(邻近)的寡核苷酸将被相同UIS或UIS的相同集合条形编码。使用UIS分选所有测序的读取值和分析结合序列的身份之后，可以鉴定各复合物的分子组分。

简言之，本发明涉及用于通过用分子构建体的至少一个集合标记属于相同复合物的分子而研究所述分子复合物的组分的方法，其中各集合的各成员包含独特标识序列(UIS)和至少一个共同标签序列(CTS)，所述独特标识序列是对于所述集合的各成员独特的核酸序列，所述共同标签序列是所述集合的所有成员共有的核酸序列，所述方法通过以下实现：

-通过将所述分子构建体连接或杂交至所述复合物的核酸分子、或将所述分子构建体连接或杂交至与特异性结合至所述复合物的组分的亲和结合剂连接的核酸而将所述分子构建体连接至所述复合物；

-通过在核酸聚合反应中使用所述分子构建体作为引物或模板而标记属于所述相同复合物的所有分子，和

-通过分析UIS和CTS的组合和如果适用组分的核酸序列来分析所述分子复合物的组成。

根据本发明的方法具有给出复合物中的所有分子的组合概况、而不是现有技术方法中从各复合物鉴定两个分子的结合对的优点。

根据本发明的方法可以应用于分析包含寡核苷酸的任何分子复合物(例如，DNA复合物)或其组分可以经由亲和结合剂用寡核苷酸标记的复合物(例如，蛋白复合物、蛋白-DNA复合物和还有微囊泡或单细胞中的这些分子或复合物)的概况。

为了使上述通用程序起作用，本发明的几个优选实施方案记载于从属权利要求中且描述于附图中。

附表和附图的简述

表1描述图1-12中使用的寡核苷酸。N = 简并碱基(A或T或G或C)。

图1是本发明的第一实施方案的说明。

图2说明使用图1中描述的实施方案的实例。

图3是本发明的第二实施方案的说明。

图4说明使用图3中描述的实施方案的实例。

图5说明使用图3中描述的实施方案的另一个实例。

图6是本发明的第三实施方案的说明。

图7说明使用图6中描述的实施方案的实例。

图8说明图6中描述的实施方案的第二实例。

图9说明图6中描述的实施方案的第三实例。

图10是本发明的第四实施方案的说明。

图11说明使用图10中描述的实施方案的实例。

图12说明使用图10中描述的实施方案的另一个实例。

图13说明来自图2的结果。

图14说明来自图4的结果。

图15说明来自图8的结果。

图16进一步说明来自图8的结果。

图17说明来自图11的结果。

定义

术语“分子复合物”是指其组分包含寡核苷酸或可以用寡核苷酸标记的任何实体。

术语“亲和结合剂”应被解释为能够选择性结合至目标分析物的任何分子实体。亲和结合剂可以是多克隆或单克隆抗体，其片段，诸如F(ab')₂、Fab、Fab'、Fv、Fc和Fd片段，其可以被引入单结构域抗体、单链抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体(intrabodies)、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv。亲和结合剂还包括结合分子诸如凝集素、链霉抗生物素、生物素、受体和酶配体及其类似物、分子印迹聚合物、亲和体或任何其他亲和结合剂。如果目标分析物是核酸，则所述亲和结合剂可以是能够与分析物核酸杂交的核酸。在本发明的使用抗体的方面，适用时，所述抗体可以被取代为其他类型的亲和结合剂。

两个实体之间的亲和力意指至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹M^-1、或10¹⁰>-1的亲和力。优选大于10⁸>-1的亲和力。

术语“抗体”是指完整抗体或其结合片段。抗体可以包含完整抗体分子(包括多克隆、单克隆或嵌合)，或包含其抗原结合片段。抗体片段包括F(ab')₂、Fab、Fab'、Fv、Fc和Fd片段，且可以被引入单结构域抗体、单链抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体(intrabodies)、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见例如，Hollinger和Hudson,>

术语“标签”是指核酸分子，例如DNA、RNA。

术语分子的“标记”是指已知核酸序列(“标记”)与待标记的分子结合，其促进通过核酸的测序或其他鉴定来鉴定和/或定量分子。待标记的分子和核酸标记可以物理连接，例如通过化学键，或物理未连接，只要所述分子和标记可以与彼此明确结合。

本发明的优选实施方案的详述

如上所述，本发明涉及用于通过用分子构建体的至少一个集合标记属于相同复合物的分子而研究分子复合物中的组分的方法，其中各集合的各成员包含独特标识序列(UIS)和共同标签序列(CTS)，其通过以下实现：

-将分子构建体标签连接至所述复合物，

-通过在核酸聚合反应中使用分子构建体作为引物和模板而标记属于相同复合物的分子，

-通过分析UIS、CTS的组合和如果适用组分的核酸序列来分析所述分子复合物的组成。

本发明现在将参考附图进行描述。

图1说明通过重复使用连接至复合物的独特标签而用相同且独特的标签标记复合物的所有组分的方法。

I. 待分析的复合物包含分子，也称为复合物的组分，各此类组分含有核酸分子序列，例如DNA、RNA或可以用此类核酸分子序列标记的组分，例如可以通过与核酸分子序列缀合的抗体标记的蛋白。复合物1包含核酸序列a、b和c；复合物m包含核酸序列b和d。II. 然后将各复合物连接至含有独特标识序列(UIS)(例如，简并碱基的15聚体)的分子构建体。将复合物1连接至包含UIS>1的标签，且将复合物m连接至包含UIS>m的标签。III. 然后重复使用各复合物的标签以标记属于该复合物的所有核酸序列，使得相同复合物的所有核酸序列用相同UIS标记。复合物1中的a、b和c都用UIS>1标记，且复合物m中的b和d都用UIS>m标记。IV.>

图2说明使用图1中描述的方法以获得长DNA分子的序列的实例。

I和II. 包含几千个碱基对的DNA分子是第一末端修复且dA-加尾的。III. 各DNA通过与含有形成UIS的简并碱基和充当引物杂交位点的共同标签序列(CTS)的分子构建体(201,202)连接而在其5'-末端用独特标签标记。DNA 1用包含UIS>1的标签标记，且DNA m用包含UIS>m的标签标记。两种标签均包含表示为P2的CTS。将进一步引物杂交序列P3连接至各DNA的3'-末端。IV. DNA然后通过使用P2和P3的引物进行扩增。通过使用过量的P2(或P3)，PCR产物以单链DNA为主。V. 单链PCR产物由具有表示为P1的共同5’-末端和3’-末端的简并碱基(203)(例如，随机6聚体)的引物杂交，使得所述引物在单链DNA上在多个位点杂交。VI. 然后，实施通过使用具有链置换活性的DNA聚合酶的DNA聚合反应，使得在相同单链DNA上的延伸产物含有靠近5’末端的不同序列和靠近3’-末端的相同UIS。来自DNA 1的延伸产物的延伸产物(204)都具有靠近3’-末端的相同UIS>1；且来自DNA m的PCR产物的延伸产物都具有靠近3’-末端的相同UIS>m。VII.>

实验方案的具体实例包括：

将UIS连接至DNA

将基因组DNA剪切且在1.5％琼脂糖凝胶上根据大小选择以取回约2000 bp的条带，且使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取DNA。使用NEBNext®末端修复模块(NEB)末端修复DNA。使用NEB Next dA-加尾模块(NEB)将末端修复产物dA-加尾。然后使用NEB QuickLigation™试剂盒(NEB)将产物与衔接子(adapter)(寡核苷酸1和寡核苷酸2，均为500 nM)连接。根据大小选择连接产物以通过使用E-凝胶(Life technologies)除去连接的衔接子二聚体。

扩增连接产物且条形编码

通过PCR扩增连接产物，所述扩增使用如下程序：95℃持续2分钟，随后30个循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟、72℃ 3分钟，其使用500 nM的浓度的一种引物(寡核苷酸3)和100 nM的浓度的另一引物(寡核苷酸4)以有利于PCR产物为单链DNA。纯化PCR产物且根据大小选择。然后纯化的PCR产物由在3’-末端含有简并碱基的引物(寡核苷酸5，500 nM)杂交。然后将dN(A、T、G、C)TP (200 μM)和Bst聚合酶(1个单位)掺入混合物，然后放入热循环仪中，程序为10℃ 45秒，20℃ 45秒，30℃ 45秒，40℃ 45秒，50℃ 45秒，65℃ 5分钟。

文库制备和测序

通过PCR扩增延伸产物，所述扩增使用如下程序：95℃持续2分钟，随后20个循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟、72℃ 3分钟，使用500 nM的浓度的引物(寡核苷酸3和寡核苷酸6)。纯化PCR产物且与衔接子(Illumina)连接，且在HiSeq (Illumina)上使用配对-末端测序进行测序。

图3说明通过在限定体积中使用独特标签连接的复合物的扩增产物而用相同且独特的标签标记复合物的所有组分的方法。

I. 待分析的复合物包含复合物组分，各此类组分含有核酸分子序列，例如DNA、RNA或可以用此类第一UIS核酸分子序列标记的组分，例如可以通过与核酸分子序列缀合的抗体标记的蛋白。复合物1包含UIS a、b 和c；复合物m包含UIS b 和d。II. 然后将各复合物连接至含有第二独特标识序列(例如，简并碱基的15聚体)的分子构建体。将复合物1连接至第二UIS>1，且将复合物m连接至第二UIS>m。III. 然后将复合物与它们连接的第二UIS一起放入液滴，例如油包水乳液，使得各液滴含有0或1个复合物。IV. 然后在各液滴中通过乳液PCR扩增各液滴中的包含第二UIS的分子构建体。V. 足够PCR循环之后，包含第二UIS的分子构建体的扩增产物可以充当引物以便在相同液滴中在复合物的组分的核酸序列上延伸，使得各液滴中的复合物上的所有第一UIS都用相同第二UIS标记。复合物1的a、b、c都用第二UIS>1标记，且复合物m的b、d都用第二UIS>m标记。VI.>

图4说明使用图3的方法以分析蛋白-DNA复合物的概况的实例。

I. 各蛋白-DNA复合物都含有一个基因组DNA片段和与之结合的蛋白。复合物1由基因组DNA片段g₁和蛋白A、B、C组成，且复合物m由基因组DNA片段g_m和蛋白B、D组成。II. 各基因组DNA片段在其两个末端与两个衔接子连接，一个(401)在5’-末端含有P2引物结合位点，而另一个是在3’-末端含有CTS引物结合位点(表示为P3)和还有包含第一UIS的独特序列标签的分子构建体的第一集合(403)。例如，复合体1的基因组DNA片段与含有UIS>1的标签连接，且复合物m的基因组片段与含有UIS>m的衔接子连接。然后各复合物上的蛋白通过与分子构建体的第二集合(402)缀合的抗体探测，所述分子构建体的第二集合(402)含有作为P1和P2的通用5'和3'-末端(也称为共同标签序列“CTS”)和还有作为a、b、c和d的第二UIS。分子构建体标签的第一集合包含子集，其中各子集的成员包含第一UIS(N_x)和CTS>1和UIS>1，且另一个液滴中的来自复合物m的b、d都获得相同基因组序列g_m和UIS>m。测序之后，通过经由第一UIS和结合基因组DNA序列和第二UIS分选所有读取值，可以将蛋白和基因组DNA片段绘制在一起。

为了易于改变缓冲液和除去未结合的材料，例如衔接子，抗体-寡核苷酸，反应优选在固体支持物上进行。由于复合物需要被放入液滴中，所以固体支持物应该能够被分离，例如珠粒。如果使用捕获抗体的可逆固定化(使用光可裂解的生物素)，也可能从固体支持物释放复合物。从固体支持物释放复合物可以避免引起假阳性相互作用的两个复合物在相同固体支持物上的风险。

实验方案的具体实例包括：

制备抗体-寡核苷酸缀合物

在室温添加1 μlNHS-酯交联剂(5 mM)/DMSO持续30分钟而活化各抗体(13.3 μM, 10 μl)。通过根据制造商的方案(Thermo Scientific)运行通过Zeba柱而纯化活化的抗体。纯化的抗体与3ul 100 μM 5’叠氮化物修饰的寡核苷酸(寡核苷酸48-55或寡核苷酸21之一)混合，且在4℃孵育过夜。在使用前将抗体-寡核苷酸缀合物置于4℃。

制备捕获珠粒

将抗体-寡核苷酸21缀合物(100nM, 100ul)与1 mg链霉抗生物素修饰的珠粒(Life Technologies)在室温孵育1小时，随后用含有0.05% Tween 20的1xPBS(PBST)洗涤两次。

染色质免疫沉淀

通过添加甲醛(1％)交联细胞，且在室温孵育10分钟。通过添加甘氨酸(0.125M)停止交联反应，且在室温孵育5分钟。将细胞从皿刮入1xPBS且通过离心浓缩。将细胞重悬于1ml细胞裂解缓冲液中，且在冰上孵育10分钟。将细胞离心以沉淀核。将核重悬于200 μl核裂解缓冲液中，且在冰上孵育10分钟。将染色质超声处理至约400 bp的平均长度。将染色质与捕获珠粒在4℃孵育过夜。

衔接子连接和探针结合

将珠粒上结合的DNA通过NEBNext末端修复模块进行末端修复，且通过使用NEB Next dA-加尾模块(NEB)进行dA-加尾。用PBST洗涤两次之后，添加50 μl含有500 nM衔接子(寡核苷酸56和57)、1个单位Quick T4 DNA连接酶的1x快速连接反应缓冲液(NEB)，且在20℃孵育15分钟。用100 μl PBST洗涤两次之后，添加50 μl含有各浓度为1 nM的抗体-寡核苷酸缀合物的抗体稀释缓冲液(Olink)，且在37℃孵育2小时。

从珠粒释放复合物和乳液PCR

用PBST洗涤两次之后，添加50 μl含有100正向引物1 (寡核苷酸3)、25 nM正向引物2 (寡核苷酸58)和100 nM反向引物(寡核苷酸6)的1x ddPCR Supermix for Probes (Bio-rad)。然后通过在室温暴露于UV光(360 nm)15分钟而从珠粒释放复合物。然后从珠粒移取上清液，且实施以下乳液PCR：95℃持续10分钟和60个循环的95℃ 15秒，60℃ 1分钟。然后破坏液滴，且提取PCR产物。

测序

纯化PCR产物且与衔接子(Illumina)连接，且在HiSeq (Illumina)上使用配对-末端测序进行测序。

图5说明使用图3的方法以绘制长DNA分子的片段的实例。

I. 将长DNA分子(501)末端修复、dA-加尾且在两个末端与衔接子连接。3'末端(502)包含用于引物结合的通用P1序列，UIS (Np或Nq)。II. 将具有连接的衔接子的长DNA分子放入具有包含作为P3 (503)、P4-P1 (504)、P2(rc) (505)的引物的3个不同集合的PCR试剂的液滴。III. 通过液滴融合或注射将具有P3和P4衔接子序列的转座体(transpososome)复合物引入液滴。IV. 在液滴中，将长DNA分子通过转座体复合物片段化，且同时将P3、P4连接至DNA片段的末端，形成P3-基因组DNA-P4构建体(507)。V. 然后开始PCR反应，其中可以通过引物P4-P1和P2(rc)扩增衔接子的3'末端(502)。通过使用过量的引物P2 (rc)，PCR产物主要是作为P2 (rc)-Np (或Nq)-P4(rc)的单链DNA (509)，其3’末端与P4互补。VI. 从V足够PCR循环之后，单链PCR产物和引物P3可以充当引物对以扩增液滴中的P3-基因组DNA-P4 (508)，生成P3-基因组DNA-P4-Np (或Nq)-P2的PCR产物。最后，可以将来自所有液滴的PCR产物合并在一起且进行测序。通过经由UIS(例如，Np (或Nq))分选读取值，可以将来自相同长DNA的基因组DNA序列绘制在一起。

图6说明通过使用连接至各复合物的相同且独特的标签的克隆而用相同且独特的标签标记复合物的所有组分的方法。

I. 待分析的复合物包含复合物组分，各此类组分含有第一UIS核酸分子序列，例如DNA、RNA或可以用此类UIS核酸分子序列标记的组分，例如可以通过与核酸分子序列缀合的抗体标记的蛋白。复合物1包含UIS a、b 和c；复合物m包含UIS b 和d。II. 然后将各复合物连接至分子构建体。集合的各成员含有相同拷贝的第二UIS，例如简并碱基的15聚体。将复合物1连接至包含标签N₁的集合，且将复合物m连接至包含标签N_m的集合。III.>1标记，且复合物m中的b和d都用独特标签N_m标记。IV.>

图7说明使用含有简并碱基的核酸构建体以制备图6中的独特标签的集合的实例。

含有UIS(例如简并的15聚体)和通用5’和3’末端的标签可以通过其5’和3’-末端与另一寡核苷酸(701)杂交以连接至环状寡核苷酸中。然后环状寡核苷酸可以通过滚环扩增(RCA)扩增以形成DNA连环体。各DNA连环体含有相同拷贝的UIS。该DNA连环体是独特标签的克隆。

图8说明使用图6的方法以分析个别蛋白复合物的概况的实例。

I. 在所示两个蛋白复合物中，一个由蛋白A、B和C组成，而另一个由蛋白B和D组成。蛋白复合物通过分子构建体的集合探测，所述分子构建体包含与含有第一UIS(分别为a、b或c)和通用3’末端序列(CTS)的寡核苷酸(801)缀合的分别特异性结合至蛋白A、B或C的抗体。II. 除去未结合的缀合物之后，添加分子构建体标签的第二集合，其中标签的第二集合的成员是DNA连环体，例如来自图7的RCA产物，其具有相同拷贝的寡核苷酸(802)，其包含与分子构建体标签的第一集合的3’末端CTS互补的序列(803)和第二UIS(804)，作为引物结合位点的通用序列(805)，和作为阻断寡核苷酸(807)结合位点的另一通用序列。允许所述DNA连环体在分子构建体的寡核苷酸的3’-末端上杂交，使得一个DNA连环体覆盖一个蛋白复合物。III. 除去未结合的DNA连环体之后，进行DNA聚合；在相同复合物中制备核酸分子获得来自杂交的DNA连环体的相同独特的标签，和还有在3’末端的通用序列，其可以用作引物结合位点。优选的是，延伸产物不含多种独特的标签序列。这可以通过在DNA连环体上使用无链置换活性的DNA聚合酶如硫化叶菌DNA聚合酶IV或T4 DNA聚合酶连同阻断寡核苷酸(807)以避免过度延伸来实现。IV. 然后将所有延伸产物合并和测序。a-标签1、b-标签1和c-标签1的测序读取值将揭示含有一个蛋白A、一个蛋白B和一个蛋白C的一个复合物，而a-标签 m、b-标签 m的读取值将揭示含有一个蛋白A和一种蛋白B的另一个复合物。

合并所有延伸产物之前。通过原位测序，例如使用连接法测序(sequencing by ligation)直接从其结合位置获得各DNA连环体的第二UIS(例如，标签1、标签2)也是可行的。然后各DNA连环体中的UIS将与独特位置或坐标关联(例如，标签1与X1-Y1，标签2与X2-Y2)。将延伸产物测序之后，a-标签1、b-标签1和c-标签1的测序读取值将揭示在X1-Y1的位置的含有一个蛋白A、一个蛋白B和一个蛋白C的一个复合物，而a-标签 m、b-标签 m的读取值将揭示在X2-Y2的位置的含有一个蛋白A和一个蛋白B的另一个复合物)。

详细实验方案的实例包括：

在固体支持物上固定抗体

将抗体首先以1ug/ml的浓度稀释至1xPBS中，然后将20 μl抗体稀释液添加至Roboscreen PCR条的各反应孔，且在4℃孵育过夜。然后各反应孔用100 μl含有0.05% T20的1xPBS(PBST)洗涤两次，然后添加50 μl含有0.1% BSA的1xPBS (NEB)用于封闭和保存。

制备抗体-寡核苷酸缀合物

将各抗体与寡核苷酸(寡核苷酸7-21之一)缀合，如图4中所述。

制备链霉抗生物素-寡核苷酸复合物(STV-寡核苷酸)

将1x PBS中的链霉抗生物素(200 pM, 5 μl)与生物素化的寡核苷酸(4 nM, 5 μl)(寡核苷酸23-26之一，或寡核苷酸23-26的混合物)混合，且在使用时保持在4℃。

制备携带相同拷贝的独特标签的DNA连环体

在100 ul的体积中，在具有1mMATP、1个单位T4连接酶的1x phi29缓冲液(33 mMTris-乙酸盐(pH 7.9，在37℃)，10 mM 乙酸镁，66 mM乙酸钾，0.1% (v/v) Tween 20, 1 mM DTT)中，将扣锁寡核苷酸(100 nM)(寡核苷酸27)首先连接至模板寡核苷酸(100 nM) (寡核苷酸28)上的环中。连接在37℃进行30分钟。然后将1 μl 25mM dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)和1 μl phi29聚合酶(10个单位/ul)掺入连接混合物中以起始连接环的滚环扩增(RCA)。RCA在室温进行15分钟，且通过在65℃加热15分钟而终止。

探测通过抗体-寡核苷酸缀合物探测的蛋白复合物

将蛋白复合物稀释于100 μl含有抗体-寡核苷酸(各10nM)的抗体稀释缓冲液(Olink)中，且在37℃孵育2小时。

在固体支持物上捕获抗体-寡核苷酸结合的复合物

首先将复合物以低于1000个复合物/1ul的浓度稀释于含有0.1% BSA的1xPBS中。然后将10 μl复合物稀释液添加至具有捕获抗体的孔，且在室温孵育30分钟。各反应孔用PBST洗涤两次。

将复合物条形编码

在含有200nM阻断寡核苷酸(寡核苷酸62)的1x ThermoPol反应缓冲液(2mM Tris-HCl, 1mM (NH4)₂SO₄,>4,>

扩增延伸产物。

将50ul含有100 nM正向引物(寡核苷酸3)和100 nM反向引物(寡核苷酸29)、200 μM dNTP (dATP、dUTP、dGTP、dCTP)、1.5个单位Taq聚合酶、1个单位尿嘧啶-DNA糖基化酶(Thermal Scientific)的1xPCR缓冲液添加至各反应孔，且在37℃孵育30分钟以切割含有尿嘧啶碱基的DNA连环体和环。然后进行如下PCR反应：95℃ 2分钟，随后40个循环的95℃ 15秒、60℃ 1分钟。

引入测序衔接子和样品条形码

将1μl含有一对引物(各5μM)(寡核苷酸30-37之一，和寡核苷酸38-45之一)的水掺入各PCR混合物中，随后2个循环的95℃ 15秒和60℃ 1分钟，和1个循环的70℃持续7分钟。然后从各PCR混合物取1 μl PCR混合物，且添加至含有50 μl PCR混合物的新孔，所述PCR混合物含有100 nM正向引物(寡核苷酸46)和100 nM反向引物(寡核苷酸47)、200 μM dNTP (dATP、dUTP、dGTP、dCTP)、1.5个单位Plantinum Taq聚合酶。然后进行如下PCR反应：20个循环的(95℃ 15秒，60℃ 1分钟)。然后在掺入1 μl引物对(10 μM)(寡核苷酸46和47)之后进行额外循环以使PCR产物完全成为双链。然后，通过下一代测序(NGS)，例如IonTorrent，Illumina，对产物测序。

图9说明使用图6的方法以绘制长DNA分子的实例。

I. 通过共价交联或使用针对共同DNA结合蛋白(例如组蛋白)的抗体(902)在表面上固定长DNA分子(901)。II. 将长DNA分子片段化，且片段(903)仍然保持邻近。III. 然后将所有片段在两个末端与具有通用5’末端(905)和3’末端(904)的共同衔接子连接。IV. 然后，相同拷贝的单元(906)的DNA连环体(例如，来自图7中的RCA反应)，包含与衔接子的3’末端互补的序列(908)，UIS(909)，引物结合位点(910)，和用于阻断寡核苷酸的另一个引物结合位点(911)。允许所述DNA连环体在分子构建体的寡核苷酸的3’-末端上杂交，使得各DNA连环体优选覆盖来自相同原始长DNA分子的DNA片段。V. 然后如图8中实施DNA聚合反应，以使来自相同长DNA分子的各DNA片段获得来自相同DNA连环体的相同UIS。然后将产物合并且通过NGS测序。通过用UIS分选读取值，可以获得来自相同长DNA的序列。

图10说明用相同且独特的标签的相同集合标记复合物的所有组分的方法。

I. 待分析的复合物包含复合物组分，各此类组分含有第一UIS核酸分子序列，例如DNA、RNA或可以用此类UIS核酸分子序列标记的组分，例如可以通过与核酸分子序列缀合的抗体标记的蛋白。复合物1包含UIS a、b 和c；复合物m包含UIS b 和d。II. 然后将复合物放入含有标签的两个集合的PCR混合物。所述两个集合两者的成员含有简并碱基的片段(例如，15聚体)作为UIS，集合1具有第二UIS作为n₁、n₂…>i、n_j、n_k…，且集合2具有第三UIS作为N₁、N₂、N₃ …>p、N_q。然后将复合物与标签的两个集合一起放入液滴，使得各液滴含有0或1个复合物，和随机数目的集合1和集合2标签的成员。例如，含有复合物1的液滴中，存在集合1的两个成员作为n₁、n₂，且存在集合2的三个成员作为N₁、N₂、N₃，并且在含有复合物m的液滴中，存在集合1的三个成员作为n_i,、n_j、n_k，且存在集合2的两个成员作为N_p、N_q。III.>1、n₂)用N₁、N₂和N₃标记，并且在含有复合体m的液滴中，集合1的所有核酸和成员(b、d、n_i,、n_j、n_k)用N_p和N_q标记。V.>1-N₁、n₁-N₂、n₁-N₃的读取值将表明N₁、N₂、N₃在一个液滴中。然后使用含有N₁或N₂或N₃的读取值，例如a-N₁、b-N₂、c-N₃的读取值将表明身份寡核苷酸(第一UIS)a、b和c在相同液滴中(或者在其含有的复合物上)。因此，通过经由集合1和集合2标签分选读取值，可以解码各复合物上的分子构建体标签的核酸部分。

图11说明使用图8的方法以定量单细胞上的几种蛋白的实例。

I. 一个细胞具有一个蛋白A、一个蛋白B和一个蛋白C，且另一个细胞具有一个蛋白B和一个蛋白D。各细胞上的蛋白通过分子构建体标签的第一集合探测，所述分子构建体标签包含特异性结合至各自蛋白且与寡核苷酸(1101)缀合的抗体，所述寡核苷酸(1101)各自包含用于引物结合的通用序列P1，对应于所述抗体对其特异性的蛋白的第一UIS (a、b、c或d)，和用于引物结合的另一通用序列P4。II. 然后将具有结合的抗体-寡核苷酸的各细胞稀释至含有标签的两个集合(集合1 (1102)和集合2 (1103)标签)的PCR混合物中，然后放入液滴(例如，油包水乳液)，使得一个液滴含有0或1个细胞和随机数目的集合1和集合2标签。例如，在含有细胞的一个液滴中，存在两个集合1标签和三个集合2标签，而在含有细胞的另一个液滴中，存在三个集合1标签和两个集合2标签。集合1和集合2标签两者均含有简并碱基的片段(例如，15聚体)作为UIS，集合1具有第二UIS作为n₁、n₂…>i、n_j、n_k…，且集合2具有第三UIS作为N₁、N₂、N₃ …>p、N_q。所述标签进一步包含充当引物的两个CTS。在本图中，这些对于集合1表示为P1和P4且对于集合2表示为P2和P3。在液滴中，额外引物P4-P2>

详细实验方案包括：

制备抗体-寡核苷酸缀合物

将各抗体与寡核苷酸(寡核苷酸7-21之一)缀合，如图4中所述。

探针结合

悬浮液中的细胞通过PBST洗涤两次。除去洗涤缓冲液之后，将500 μl含有探针的抗体稀释缓冲液(各自以1nM的浓度)添加至细胞且在室温在旋转器上孵育2小时。细胞用1xPBST洗涤三次。

乳液PCR

除去PBST之后，将细胞在200 μl 1x ddPCR Supermix for Probes (Bio-rad)中稀释至约10个细胞/μl的浓度，所述1x ddPCRSupermix for Probes (Bio-rad)含有100 nM正向引物1 (寡核苷酸3)、25 nM正向引物2 (寡核苷酸59)和100 nM反向引物(寡核苷酸6)、1fM集合1标签(寡核苷酸60)、1fM集合2标签(寡核苷酸61)。然后将混合物转移至DG8盒(Bio-rad)中的样品孔。然后将70 μl液滴生成油添加至盒中的各油孔。然后将该盒置于QX100液滴发生器(Bio-Rad)上。然后将液滴转移至96孔PCR板，且放在热循环仪上，程序为95℃ 10分钟，60个循环的95℃持续30秒、60℃ 1分钟。然后破坏液滴，且提取PCR产物。

测序

纯化收集的PCR产物，且通过下一代测序(NGS)(例如Miseq、Hiseq 2500、Ion torrent)测序。

图12说明使用图10的方法以计数单细胞上的RNA分子的实例。

I. 将各细胞中的mRNA分子(1201)首先固定在细胞上。II. 然后使包含5’末端的通用序列(1204)、UIS(1203)和RNA特异性序列(1202)的cDNA引物结合在RNA分子上。III. 通过使用逆转录酶在细胞上合成cDNA。在反应中，具有胺基的dUTP与正常dUTP一起使用，使得cDNA含有胺基。IV. 将cDNA通过其胺基至细胞中的其他胺基(例如来自蛋白)而交联至细胞。V. 然后通过使用RNase H除去RNA。VI. 然后使包含通用5’末端(1205)和3’末端的序列特异性引物(1206)的DNA引物杂交在cDNA上。VII. 实施DNA聚合反应，生成包含通用5’末端序列、cDNA序列、UIS和通用3’末端的DNA分子。然后在与图11类似的程序中，可以将具有结合的产物的细胞放入液滴，随后进行乳液PCR用于条形编码。测序和分选读取值之后，可以将来自相同细胞的测序读取值放在一起。可以使用UIS(1203)连同相同读取值中的相关cDNA序列来获得各RNA的绝对数目分子。

通过使用针对特定类型的RNA分子的特异性cDNA引物可以大大节省用于各细胞的测序读取值。但使用非特异性cDNA引物(例如寡聚dT引物，在3’末端的简并碱基)以通过逆转录酶合成所有RNA分子的cDNA和通过链转换反应引入3’末端通用序列是可行的。

图13说明来自图2的假想结果。

基于分子构建体标签的UIS分选测序读取值。一个UIS是‘TGGGGTTAGCAAGTC’ (SEQID NO:63)，且将在它们的3’-末端共享该序列的读取值放在一起且绘制它们的5’-末端读取值以获得长DNA片段序列。

图14说明根据图4的方法的实验的假想结果。

UIS a、b、c、d和e作为TTTAGG、ATTCCA、GCTCAA、CATCCC和AAGCGG给出。基于分别作为GCACCCTAAACGATG(SEQ ID NO:64)和TTGAAGACTCGCGAT (SEQ ID NO:65)给出的UIS>1或N_m分选测序读取值。然后可以将蛋白标签(a、b、c、d 或e)和共享相同UIS>1或N_m的基因组序列一起绘制至基因组中。

图15说明来自根据图8的方法的结果。

为了模拟蛋白复合物，将链霉抗生物素与4种不同分子构建体标签的混合物孵育，所述混合物由具有UISs a、b、c 和d的生物素化的寡核苷酸标签组成。即，使用生物素来模拟与蛋白特异性结合的抗体，在该情况下，所述蛋白由链霉抗生物素模拟。然后通过图8中所述的方法分析链霉抗生物素-寡核苷酸复合物的概况。测序之后，将如x-柱上所示共享第二集合的相同标签的读取值放在一起。通过使用生物素化的寡核苷酸上的标签的第一集合的UIS，可以计数各链霉抗生物素上的寡核苷酸的绝对数目。结果显示各链霉抗生物素由4个不同的生物素化的寡核苷酸的随机组合结合。由于链霉抗生物素可以形成四聚体，所以它可以结合最多4个生物素化的寡核苷酸，这与实验制备一致。

图16说明来自根据图8的方法的进一步结果。

与图15类似，但链霉抗生物素与仅一种类型的生物素化的寡核苷酸孵育，然后混合且通过图8中所述的方法分析概况。测序之后，将共享相同独特标签的读取值放在一起。通过使用生物素化的寡核苷酸的另一种随机条形码，可以计数各链霉抗生物素上的寡核苷酸的绝对数目。结果显示各链霉抗生物素含有仅一种类型的生物素化的寡核苷酸，这与实验制备一致。

图17说明来自根据图11的方法的结果。

为了模拟细胞上的抗体-寡核苷酸缀合物结合。链霉抗生物素包被的磁珠与不同浓度(d<c<b<a)的作为集合1标签(图9中)的生物素化的寡核苷酸孵育。将四种不同的制备珠粒与相同浓度的集合2标签稀释于PCR混合物中。在开始PCR循环中，扩增集合2标签，且4个反应的扩增曲线给出类似的Ct(循环阈值)。在以下PCR循环中，开始PCR的第二阶段以扩增集合1标签，其中四个反应的曲线给出不同的Ct值，这与集合1标签的浓度一致。

当实施本发明时，本领域技术人员可以进一步利用药物化学、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、转基因动物和重组DNA技术的领域中的常规技术，如即(i.a.)公开于Sambrook等人 “Molecular cloning: A laboratory manual”, 第3版 2001; Ausubel等人 “Short protocols in molecular biology”, 第5版 1995; “Methods inenzymology”, Academic Press, Inc.; MacPherson,Hames and Taylor (编). “PCR 2: A practical approach”,1995; “Harlow and Lane(编) “Antibodies,a laboratory manual” 1988; Freshney(编) “Cultureof animal cells”, 第4版 2000; Hogan等人 “Manipulating the Mouse Embryo: ALaboratory Manual”, Cold SpringHarbor Laboratory, 1994; 或这些书本的后续版本，和Ke R, MignardiM, Pacureanu A,等人 In situsequencing for RNA analysis in preserved tissue and cells.Nat>2013;10:857-60，和Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J,等人 Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.Science2014;>

本发明不限于上述优选实施方案。可以使用各种替代、修改和等同方案。因此，上述实施方案不应被视为限制本发明的范围，本发明的范围通过随附权利要求定义。

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