抗人血管性血友病因子A3区的人鼠嵌合单克隆抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了抗人血管性血友病因子A3区的人鼠嵌合单克隆抗体及其制备方法和应用。具体而言，本发明的嵌合单抗包括鼠源重链可变区、鼠源轻链可变区、人源重链恒定区、人源轻链恒定区；其中鼠源重链可变区如SEQ ID NO:1所示，鼠源轻链可变区如SEQ ID NO:2所示，人源重链恒定区为选自IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中的任意一种的重链恒定区，人源轻链恒定区为选自kappa或 lambda中的任意一种的轻链恒定区。本发明的嵌合单抗既能抑制vWF与胶原的结合，又能抑制血小板的聚集，具有良好的抗血栓作用，不易在人体内产生抗鼠的免疫反应，并且大大降低了临床出血风险的发生。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有高特异性、高亲合力结合特性以及高抗血栓活性的抗人血管性血友病因子（vWF）A3区的人鼠嵌合单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

流行病学研究表明，近几十年来，随着物质生活的提高及人口的老龄化，血栓性疾病的危害日益凸显。在特定的病理条件下，血栓能够抑制或者完全阻止血液流动，从而导致细胞性坏死，严重威胁人类健康。

血小板在血栓的形成中起着关键性作用，血小板粘附和聚集是血栓形成的必要过程。发生在动脉粥样硬化斑块处的血小板粘附和聚集以及随后的血栓形成，在心绞痛、急性心肌梗塞以及血管成形术后的血栓再形成等疾病的发病过程中起着重要作用。

近年来，针对血小板在血栓形成过程中的分子机制研究促进了分子靶向药物的发展，其中以针对血小板糖蛋白（GP）IIb/IIIa的单克隆抗体阿昔单抗（abciximab）为代表，临床应用已取得了良好的抗血栓治疗效果。然而，由于阿昔单抗也存在引起严重出血的潜在危险，特别是在亚洲人群中更为严重，因此尚未在亚洲推广应用，在一定程度上阻碍了这类药物的临床应用。

为了克服抗血栓药物存在出血副作用这一缺陷，抗血小板粘附作为新的抗血栓治疗手段正在兴起。血小板与内皮下胶原的粘附是血小板血栓形成的开始步骤，抗血小板粘附药物通过抑制胶原-vWF-血小板GPIb轴来阻断血小板与胶原的起始粘附（即在血栓形成的早期阶段阻止血小板的粘附和活化），可以实现既能对抗血栓形成，又能减少出血副作用的目的。因此，这类药物在对其他血管阻塞以及血栓栓塞性疾病的治疗中具有良好的应用前景。

中国发明专利CN101597595A中公开了针对胶原-vWF-血小板GPIb轴这一新靶点的鼠源性单抗SZ-123和SZ-125，其能够与人以及猕猴血管性血友病因子A3区发生高特异性、高亲合力结合，进而阻止血小板在胶原表面的粘附和活化。但是，由于鼠源性单抗在人体内可能会诱导产生人抗鼠免疫反应，因此这种免疫反应不但会减弱或者破坏治疗效果，甚至可能会在患者体内引起变态反应或超敏反应，极大地限制了临床应用。另外，在治疗血栓栓塞性疾病时，通常需要反复给药，这样就更加增大了上述免疫反应的发生概率。

发明内容

针对上述情况，本发明提供了一种抗人血管性血友病因子A3区的人鼠嵌合单克隆抗体（MHC-SZ123），其不仅能够从血栓形成的早期阶段阻断血栓的形成，而且能够减少药效的降低和出血副作用以及由免疫反应引起的变态反应或超敏反应的发生概率。

具体而言，本发明的抗人血管性血友病因子A3区的人鼠嵌合单克隆抗体包括鼠源重链可变区、鼠源轻链可变区、人源重链恒定区、人源轻链恒定区；其中：

所述鼠源重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；

所述鼠源轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；

所述人源重链恒定区为选自IgG（γ）、IgM（μ）、IgA（α）、IgE（ε）、IgD（δ）中的任意一种的重链恒定区；

所述人源轻链恒定区为选自kappa（κ）或lambda（λ）中的任意一种的轻链恒定区。

由于抗体分子中重链的不同亚型与其效应功能密切相关，因此如果希望嵌合单抗产生所需的效应功能，就要选择相应的重链恒定区。优选的，在上述人鼠嵌合单克隆抗体中，所述人源重链恒定区为选自IgG1（γ1）、IgG3（γ3）、IgG4（γ4）中的任意一种的重链恒定区；更优选的，所述人源重链恒定区为IgG1的重链恒定区。

优选的，在上述人鼠嵌合单克隆抗体中，所述人源轻链恒定区为kappa（κ）的轻链恒定区。

另一方面，本发明提供了上述抗人血管性血友病因子A3区的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：

（1）采用cDNA末端快速扩增（RACE，rapidamplificationofcDNAend）技术，利用一对引物HGSP1和KGSP1，分别扩增出编码鼠源功能性抗体中重链和轻链可变区的核苷酸序列；其中：

所述引物HGSP1和KGSP1的核苷酸序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；

（2）采用基因工程的方法，利用两对引物p-VH-F和p-VH-R以及p-VK-F和p-VK-R，分别将步骤（1）中获得的编码鼠源抗体中重链和轻链可变区的核苷酸序列与编码人源抗体中重链和轻链恒定区的核苷酸序列对应连接，经测序确认后，获得嵌合单抗的重链和轻链表达载体；其中：

所述引物p-VH-F、p-VH-R、p-VK-F、p-VK-R的核苷酸序列分别如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示；

（3）将步骤（2）中获得的表达载体共转染至高效表达目标嵌合单抗的受体细胞，经多次克隆和特异性筛选，获得高效表达目标嵌合单抗的细胞株，收集细胞培养液上清，经纯化获得抗人血管性血友病因子A3区的人鼠嵌合单克隆抗体。

优选的，在上述制备方法中，所述高效表达目标嵌合单抗的受体细胞为鼠骨髓瘤细胞或中国仓鼠卵巢（CHO，Chinesehamsterovary）细胞，优选CHO细胞。这些细胞不仅可以合成、装配和分泌免疫球蛋白，同时还拥有免疫球蛋白糖基化的功能。

再一方面，本发明提供了一种高效表达抗人血管性血友病因子A3区的人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞株MHC-SZ123，其能够悬浮培养，而不同于普通CHO细胞的贴壁生长，这一特性对于提高嵌合单抗的表达量具有重要意义。上述人鼠嵌合抗体CHO细胞株MHC-SZ123的保藏信息如下所述：保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2016年1月20日，保藏编号为CCTCCNO:C2015184。

最后一方面，本发明提供了上述抗人血管性血友病因子A3区的人鼠嵌合单克隆抗体在制备抗血栓药物中的应用。本发明的嵌合单抗（以及相应的片段）不仅可以在体外抑制血小板粘附和血栓形成，还可以在实验动物体内抑制由于血小板异常粘附和血小板血栓形成而引起的循环血流改变。该抗体可以应用于防止各种原因导致的血小板血栓形成以及血管成形术后再形成血栓的情况。例如：该抗体可用于哺乳动物或人体，可防止肺栓塞，短暂的缺血性中风，深部静脉血栓，冠状动脉搭桥术后，手术植入修复瓣膜或血管（自体来源的，异体来源的，或人工合成的）等情况下血栓的形成；该抗体还可以用于预防球囊扩张术、冠状动脉粥样斑块旋切、激光或者采用其他适当方法进行的血管成形术中的血小板聚集和血栓形成。给药时间可以在血管成形术前、术中和术后。这样处理后可以防止血栓形成，因此相应减少了血管成形术后血栓形成导致的死亡、心肌梗死以及必须再次实施PTCA或冠状动脉搭桥手术治疗等并发症的发生。

优选的，在上述应用中，所述抗血栓药物中的活性成分既可以为单独使用的嵌合单抗，又可以为嵌合单抗与其他溶栓药物的联合。所述其他溶栓药物包括（但不限于）纤溶酶原激活剂（如组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶、链激酶、重组组织型纤溶酶原激活剂）、抗凝或抗血小板药物（如阿斯匹林、肝素、或香豆素类抗凝药）。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

（1）由于抗体分子的免疫反应性主要由恒定区产生，因此含有人源恒定区的嵌合单抗不易在人体内产生抗鼠的免疫反应，改善了患者的用药依从性；

（2）本发明的人鼠嵌合单克隆抗体可以与人以及猕猴vWFA3区进行高特异性、高亲合力的结合，并且利用经典的FOLTS模型证实了该单抗在猕猴体内具有抗血栓作用；

（3）本发明的人鼠嵌合单克隆抗体既能抑制vWF与胶原的结合，又能抑制血小板的聚集，其抗血栓生物活性更强，因此可以用于PTCA和/或不稳定性心绞痛时，防止急性血栓的形成，减少心脏缺血事件的发生；

（4）本发明的人鼠嵌合单克隆抗体所针对的新靶点是vWF，而不是血小板，因此在给药后不会引起血小板的下降和出血时间的延长，大大减少了临床出血风险的发生。

附图说明

图1为实施例一中5’-RACE产物的电泳图，其中L表示轻链结果，H表示重链结果，M为DL2000DNAMarker。

图2为实施例一中嵌合单抗表达质粒图谱，其中重链表达质粒表示为pMH3-MHC-SZ123VH，轻链表达质粒表示为pMH3-MHC-SZ123VK。

图3为实施例一中嵌合单抗表达质粒酶切鉴定图。

图4为实施例二中摇瓶流加表达嵌合单抗的SDS-PAGE电泳图，其中A表示阳性对照（50μg/mL），B表示培养液上清，H表示重链，L表示轻链。

图5为实施例三中鉴定纯品嵌合单抗的SDS-PAGE电泳图，其中1表示第一批产品（浓度为1g/L），2表示第二批产品（浓度为2g/L），3表示第三批产品（浓度为1.5g/L）。

图6为实施例四中嵌合单抗体外抑制人血浆中vWF与胶原的结合的效果曲线图，其中SZ-123表示鼠源性单抗，MHC-SZ123表示人鼠嵌合单抗。

图7为实施例四中嵌合单抗体外抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集的效果曲线图，其中a表示MHC-SZ123（浓度为8μg/mL），b表示MHC-SZ123（浓度为5μg/mL），c表示MHC-SZ123（浓度为3.5μg/mL），d表示阴性对照IgG。

图8为实施例五中不同剂量的嵌合单抗及生理盐水对猕猴CFRs发生的抑制作用效果图。

图9为实施例五中不同剂量的嵌合单抗对猕猴体内vWF与胶原的结合的抑制作用效果图。

图10为实施例五中不同剂量的嵌合单抗对猕猴体内瑞斯托霉素诱导的血小板聚集的抑制作用效果图。

图11为实施例五中不同剂量的嵌合单抗对猕猴体内血小板计数的抑制作用效果图。

图12为实施例五中不同剂量的嵌合单抗对猕猴体内出血时间的抑制作用效果图。

具体实施方式

以下将结合附图及具体实施例对本发明中的技术方案做出进一步的描述。除非特殊说明，下列实施例中所使用的材料、试剂、仪器等均可通过商业手段获得。

实施例一：人鼠嵌合单克隆抗体真核表达质粒的构建。

1、单克隆抗体SZ-123重链和轻链可变区cDNA的构建：

采用5’-RACE技术，从分泌抗人vWFA3区的鼠单抗的杂交瘤细胞株SZ-123中克隆功能性抗体的重链和轻链的可变区序列，其中以分泌鼠单抗SZ-123的杂交瘤细胞株的mRNA为模版，并设计一套重链和轻链的逆转录特异性引物HGSP1和KGSP1，其核苷酸序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。5’-RACE产物的电泳图如图1所示，其中右侧为轻链（L）结果，左侧为重链（H）结果。

根据核苷酸序列与氨基酸编码序列的相应关系，分析PCR产物的阅读框架，确定相应可变区的氨基酸序列，其重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。根据免疫球蛋白基因的特点验证其为抗体序列。

2、表达质粒pMH3-MHC-SZ123VH和pMH3-MHC-SZ123VK的构建：

以5’-RACE测序结果所得的序列为模板，设计两对引物（其核苷酸序列如SEQIDNO:5至SEQIDNO:8所示），分别用PCR方法将鼠源功能性抗体基因的可变区序列及信号肽序列扩增，并将重链可变区基因和轻链可变区基因用EcoRI和NotI酶切后连接到用相同酶酶切的含上述人源抗体IgG1和kappa链恒定区的表达载体pMH3中，获得嵌合单抗的重链表达质粒pMH3-MHC-SZ123VH和轻链表达质粒pMH3-MHC-SZ123VK。表达质粒经测序鉴定序列正确，其质粒图谱如图2所示，酶切鉴定图如图3所示。

实施例二：嵌合单抗的表达、筛选、悬浮驯化和摇瓶流加表达。

1、CHO-S细胞电转染方法：

20μg重组质粒（pMH3-MHC-SZ123VH，pMH3-MHC-SZ123VK）共转入3×10⁶个CHO-S细胞，电转反应体系：200μL，CHO-S细胞悬液+20μg质粒+10μg鲑鱼精DNA，电转反应条件：500V、500us、4次。

2、高表达细胞株的筛选：

将电转细胞悬液铺于含10mL培养基（DMEM/F12=1:1，含10%FBS）的培养皿中。采用2.4mg/LG418（Geneticin）对细胞进行加压筛选，挑选单克隆至96孔板。待克隆长至铺满80%孔底时，撤含FBS培养液，以100μL/孔的剂量添加D/F培养液（表达培养液），48h后检测表达情况。样品稀释10倍，ELISA检测一次克隆，挑选高表达克隆至24孔板，样品稀释30倍，ELISA检测，最高表达量为5μg/mL。将高表达克隆消化后单细胞铺二次克隆，按一次克隆筛选方法挑选二次高表达克隆。样品稀释100倍，ELISA检测孔板48h最高表达量为23μg/mL。该克隆细胞株（命名为CHO细胞株MHC-SZ123）作为原始细胞库进行后续工作。

3、悬浮驯化：

将高表达细胞株进行悬浮驯化，高表达二次克隆CHO细胞株MHC-SZ123转移至T75培养瓶中培养，待细胞汇合度至90%左右时，将T75中细胞消化，换用B001培养基，置于培养箱中静置培养36h后，收集细胞并计数，将1.0×10⁶个/mL细胞转移至100mL摇瓶中，加入30mL悬浮培养液B001，准备悬浮驯化。待细胞每天翻倍且状态良好，表示悬浮驯化成功。

4、高表达细胞克隆摇瓶流加表达：

将CHO细胞株MHC-SZ123的细胞密度调整为1.0×10⁶个/mL，接种于250mL三角瓶中（含30mLB001），进行批次实验。选择最具表达优势的克隆进行3L摇瓶流加表达。接种密度为2×10⁶个/mL，每天观察细胞状态，检测细胞密度，使细胞密度一直保持在2.0×10⁶个/mL，直至总体积扩至1L。待细胞密度长至4.0~6.0×10⁶个/mL时，细胞转移至34℃培养，开始流加F001（补充培养基），每天保持糖浓度在3.0g/L左右。流加表达7天，离心收集发酵液上清，表达量约为200mg/L。摇瓶流加表达嵌合单抗的SDS-PAGE电泳图如图4所示。

5、高表达细胞株的稳定性实验：

取适应悬浮培养的CHO细胞株MHC-SZ123作为实验用细胞，并进行如下操作：

（1）计算细胞数以及细胞活率；

（2）调整细胞浓度为3×10⁵细胞/mL，共15mL，加入到100mL摇瓶中，置于37℃摇床上以128rpm的速度进行培养，3天为一代；

（3）取3天后摇瓶中的细胞悬液再进行细胞计数，计算每毫升悬液中的细胞浓度、细胞总数、细胞倍增数、细胞活死百分比以及每毫升悬液中的抗体浓度；

（4）再调整细胞加入摇瓶中为第2代；以此类推，一直培养到第30代。

实施例三：嵌合单抗的纯化。

采用proteinA亲和层析法纯化嵌合单抗，具体步骤如下所述：

（1）用3~5倍柱体积的水清洗proteinA亲和层析柱；

（2）用20mM磷酸缓冲液（PBS）（pH=7.0）平衡proteinA亲和层析柱；

（3）将含有所需纯化单抗的细胞培养液上清用0.45μm的滤膜过滤，泵入已用PBS平衡的proteinA亲和柱；

（4）用20mMPBS（pH=7.0）洗柱，直至OD₂₈₀<0.01；

（5）用0.1M甘氨酸-HCl缓冲液（pH=3.0）洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，并用1MTris-HCl缓冲液（pH=9.0）调节收集的抗体溶液，直至pH值为中性；

（6）用10mMPBS（pH=7.2）透析脱盐，即得纯品嵌合单抗。

上述嵌合单抗的SDS-PAGE检测结果如图5所示。采用Bradford法测定纯化后嵌合单抗SZ-123的浓度，样品稀释20倍后的A₅₉₅为0.5327，根据标准曲线（Y=0.0044X+0.1395，R²=0.9963）计算，目的蛋白的浓度为1.01~2.04g/L。

实施例四：嵌合单抗的体外生物学功能测定。

1、嵌合单抗抑制人血浆中vWF与胶原的结合：

共采集14份正常人血浆（3.8%枸橼酸抗凝）用于进行体外抗凝实验。将乙酸酸化的人胎盘III型胶原包被于96孔板上，然后将100μL正常人血浆（1:50稀释）与嵌合单抗同时加入已包被胶原的孔中，于37℃保温2h，洗涤后将结合的vWF用辣根过氧化物酶标记的兔抗人vWF抗体测定。体外实验表明，嵌合单抗能剂量依赖性地抑制人血浆中vWF与胶原的结合（如图6所示）。

2、嵌合单抗抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集：

采集正常健康人全血（3.8%柠檬酸钠抗凝），100g离心10min。取PRP，将各种浓度（8μg/mL、5μg/mL、3.5μg/mL）的嵌合单抗分别与PRP预先室温保温10min，然后分别用瑞斯托霉素（1.25mg/mL）诱导血小板聚集。结果显示，嵌合单抗能剂量依赖性地抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集（如图7所示）。

实施例五：嵌合单抗的体内抗血栓形成功能测定。

Reopro抗体为嵌合型抗人血小板表面GPb/IIIa抗体，目前临床上主要用于在PTCA和/或不稳定性心绞痛时防止急性血栓的形成，减少心脏缺血事件的发生（N.Engl.J.Med.,1997(336):p1689-1697）。为了明确抗人血管性血友病因子A3区的人鼠嵌合单克隆抗体的体内抗血栓作用，采用能够良好反映机体血栓形成过程的Folts模型来进行试验。

1、实验动物：

云南猕猴（购自苏州西山中科实验动物有限公司），20只，雌雄各半，4~8岁龄，实验开始时体重为7.2~10.5kg。

2、实验设计：

以目前临床应用的，以生理盐水（N.S.）为阴性对照，通过体内抗血栓实验来证明嵌合单抗的药效及相应的量效关系。

3、观测指标：

建立Folts模型，观察单次静脉注射给药前后1小时内周期性血流减低（CFR）发生次数的改变，并观察给药前后血小板计数（PLT）、出血时间（BT）、血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（Fg）等凝血指标，结合血浆中的vWF水平、血浆中vWF与胶原的结合情况以及瑞斯托霉素诱导的血小板聚集定量结果，综合考察嵌合单抗的体内抗血栓作用。分别在给药前30min，给药后15、30、60、120min以及24小时采集血样，检测上述指标。所有血样以终浓度0.38%的枸橼酸钠抗凝。

4、体内实验：

（1）在20只猕猴体内建立了Folts模型，实验共分4组，即生理盐水组（阴性对照）、嵌合单抗低（0.1mg/kg）、中（0.3mg/kg）、高（0.6mg/kg）三个剂量组，每组5只，给药途径为单次静脉推注给药。

（2）针对CFR的抑制作用：给药1小时后，生理盐水组、嵌合单抗低、中、高剂量组抑制率分别为0.0%、29.4%、58.0%、73.1%，其结果如图8所示。经单因素方差分析（ANOVA）可知，不同剂量的嵌合单抗组与生理盐水组相比，对于CFR抑制率的差异非常显著（P<0.01），并且嵌合单抗对CFR的抑制作用呈现出明显的剂量相关性。该实验表明，本发明的嵌合单抗在动物体内能够发挥显著的抗血栓作用，具有开发成抗血栓药物的巨大潜力。

（3）针对血浆中vWF与胶原的结合的抑制作用：在给药后的15分钟至1小时以内，嵌合单抗低、中、高剂量组对于血浆中vWF与胶原的结合的抑制作用均保持在峰值，其抑制率分别接近33%、51%和92%；在2小时以内，其抑制率分别保持在最高值的一半以上（如图9所示）。

（4）针对血小板聚集的抑制作用：在给药后的30分钟以内，嵌合单抗低、中、高剂量组均达到最大抑制率，分别为25.8%、43.4%和62.1%，在该时间点，嵌合单抗对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集的抑制作用存在明显的剂量相关性（如图10所示）。

（5）其它指标：关于PLT、BT、PT、TT、APTT、Fg和vWF水平等检测指标，各实验组均未观察到具有统计学差异的改变（如图11和12所示）。