一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法

摘要

本发明提供一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法，其是利用特异性消化酶抑制剂分别处理对Bt蛋白敏感和对Bt蛋白具有抗性的棉铃虫，然后进行生物测定，通过比较所述消化酶抑制剂对抗、感品系棉铃虫的Bt蛋白毒力的抑制效果，来评价所述消化酶抑制剂对应的消化酶在参与Bt蛋白抗性形成中的作用。本发明方法直观、简单，可操作性强，可用于初步分析不同消化酶参与棉铃虫对Bt蛋白抗性形成的作用，为研究昆虫抗性机制及抗性治理提供思路。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地说，涉及一种评价消化酶 在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)属革兰氏阳性细菌，能 产生多种类型的伴孢晶体蛋白，即δ-内毒素或称为杀虫晶体蛋白 (insecticidalcrystalprotein,ICPs)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(D iptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目 (Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫， 以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀虫活性。

关于Bt毒素作用机理的假说有很多，穿孔模型是被广泛认可的一 种。穿孔模型包括以下几个步骤：(i)摄入的毒素晶体在昆虫中肠特 殊的碱性条件下水解，前毒素释放出来；(ii)前毒素在中肠蛋白酶的 作用下水解为有活性的毒素单体分子；(iii)经过中肠上皮细胞糖基磷 脂酰肌醇(GPI)锚定的受体分子定位，毒素单体分子与中肠上皮细胞 上的钙粘蛋白受体结合；(iv)在中肠特定的蛋白酶的作用下，毒素单 体分子结构域Ⅰ中的α-1螺旋被剪切掉，毒素单体分子寡聚化；(v)寡 聚化的毒素分子结合锚定在中肠上皮细胞的氨肽酶(aminopeptidaseN, APN)和碱性磷酸酯酶(alkalinephosphatase,ALP)，大量聚集的毒素分 子导致上皮细胞穿孔,最终导致昆虫死亡。

中肠蛋白酶在Bt前毒素的活化中起着重要作用，由于蛋白酶的缺 失使前毒素的活化程度降低而产生的抗性是抗性品系中较普通的机 制。Oppert等人发现,印度谷螟的(Plodiainterpunctella)中肠因缺少 胰蛋白酶(trypsin)的活化作用而对Cry1A毒素产生了抗性；在玉米螟 (Ostrinianubilalis)和烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)的抗性品系中也 发现了类似的情况。刘晨曦等报道在棉铃虫的一个Cry1Ac抗性品系 中，类胰蛋白酶的突变引起了棉铃虫对Cry1Ac的抗性；Rajagopal等 也报道在棉铃虫的抗性品系中,一种丝氨酸蛋白酶HaSP2(serine protease2)的缺失致使前毒素不能正常水解与活化。

发明内容

本发明的目的是提供一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作 用的方法。

Bt蛋白的活化在Bt作用模型中是非常关键的一步，同时也是昆虫 对Bt产生抗性的重要因素。鉴于目前尚未建立一套行之有效的、快速 的评价各种消化酶参与Bt抗性的方法，本发明提供一种评价消化酶在 棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法，利用特异性消化酶抑制剂分别处理 对Bt蛋白敏感和对Bt蛋白具有抗性的棉铃虫，然后进行生物测定(分 析其抗性倍数和抑制效率)，通过比较所述消化酶抑制剂对抗、感品 系棉铃虫的Bt蛋白毒力的抑制效果，来评价所述消化酶抑制剂对应的 消化酶在参与Bt蛋白抗性形成中的作用。

本发明所述特异性消化酶抑制剂对应于棉铃虫中肠消化酶中一 种特定的消化酶，例如所述特异性消化酶抑制剂包括类胰蛋白酶的抑 制剂N-tosyl-L-lysinechloromethylketone(TLCK)。

具体地，本发明的一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的 方法，包括以下步骤：

1)配制一定浓度的特异性消化酶抑制剂溶液；

2)选抗、感品系棉铃虫，将步骤1)配制的消化酶抑制剂溶液点 滴在每头棉铃虫背部，然后饲喂含不同浓度Cry1Ac的饲料，饲喂一段 时间后，进行生物测定，比较抗、感品系棉铃虫对Bt蛋白毒力的变化。

前述的方法，选2日龄的抗、感品系棉铃虫幼虫进行点滴处理。

前述的方法，步骤1)中用适当溶剂(例如，二甲基亚砜DMSO) 溶解所述特异性消化酶抑制剂，配制浓度为10mg/mL的溶液，并以 溶剂为对照。

前述的方法，步骤2)中用微量点滴器将约1μL所述消化酶抑制 剂溶液点滴在每头棉铃虫背部，然后饲喂含不同浓度Cry1Ac的饲料， 饲喂7d后，进行生物测定。

本发明方法直观、简单，可操作性强，可用于初步分析不同消化 酶参与棉铃虫对Bt蛋白抗性形成的作用，为研究昆虫抗性机制及抗性 治理提供思路。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

实施例1类胰蛋白酶在Cry1Ac抗性棉铃虫中的作用分析

配制类胰蛋白酶(棉铃虫中肠消化酶中的一种蛋白酶)的特异性 酶抑制剂TLCK，用DMSO将其溶解，配制成浓度为10mg/mL的酶抑 制剂溶液，并以DMSO为对照；选Cry1Ac抗、感品系棉铃虫(即对 Cry1Ac具有抗性或敏感的棉铃虫，本实施例中以LF做为敏感品系棉 铃虫，LF120作为抗性品系棉铃虫)，分别准备72头2日龄棉铃虫(分3 次重复)；配制含不同浓度Cry1Ac的人工饲料；用微量点滴器将准备 好的约1μL酶抑制剂溶液，点滴在每头棉铃虫背部；将抑制剂处理后 的幼虫转移到含Cry1Ac的人工饲料上进行生物测定；7日后对生测结 果进行统计分析，分析其抗性倍数和抑制效率，通过比较抗、感品系 棉铃虫对抑制剂的反应，来初步评价类胰蛋白酶在Cry1Ac抗性形成中 作用。

根据7日后的生物测定结果(表1)，与敏感品系LF相比，LF120 品系棉铃虫对Cry1Ac产生了1601.72倍的抗性。类胰蛋白酶抑制剂对 敏感品系的抑制效率是2.34倍，说明类胰蛋白酶参与了棉铃虫对 Cry1Ac的活化作用。抑制剂对LF120的抑制效果是1.78倍，说明类胰 蛋白酶在一定水平上参与了LF120品系对Cry1Ac抗性的形成；同时加 入抑制剂后，棉铃虫对Cry1Ac的抗性倍数也从1601.72ng/cm²降为了 888.62ng/cm²，说明其他的消化酶也可能参与毒素的消化过程，另外 受体蛋白的变化等可能也是抗性产生的原因。

表1类胰蛋白酶抑制剂对抗、感品系棉铃虫的抑制效果

注：/：无处理或不分析；DMSO：溶剂为对照，生测前进行点滴处理；TLCK：生测 前进行抑制剂点滴处理；抗性倍数：LF120的LC₅₀除以LF的LC₅₀抑制率：在同一品系 中，TLCK处理的LC₅₀除以DMSO的LC₅₀。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

Oppert,B.；Kramer,K.J.；Beenman,R.W.；Johnson,D.；McGaughey,W.H.Proteinase-mediated insectresistancetoBacillusthuringiensistoxin.J.Biol.Chem.1997,272,23473-23476

Liu,C.X.；Xiao,Y.T.；Li,X.C.；Oppert,B.；Tabashnik,B.；Wu,K.M.Cis-mediated down-regulationofatrypsingeneassociatedwithBtresistanceincottonbollworm.Scientific Reports2014,4,DOI:10.1038/srep07219

Rajagopal,R.；Arora,N.；Sivakumar,S.；Rao,N.G.V.；Nimbalkar,S.A.ResistanceofHelicoverpa armigeratoCry1ActoxinfromBacuillusthuringiensisisduetoimproperprocessingofthe protoxin.Biochem.J.2009,419,309–316