抗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的重组抗原基因、重组抗原蛋白及亚单位疫苗组合物

摘要

本发明涉及一种抗猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)感染的重组融合抗原基因、重组融合抗原蛋白及含有其的亚单位疫苗组合物，其是将PRRSV的具有截短N’端诱饵表位的糖蛋白GP5、连接序列以及膜蛋白M融合为重组基因序列并进行密码子优化后，所得的重组融合抗原基因利用重组杆状病毒表达系统进行体外表达，不仅可提升其重组融合抗原蛋白的产量，所得的重组融合抗原蛋白在应用于亚单位疫苗组合物时，可向经免疫的动物提供较佳的疫苗保护力又不具排毒与返毒风险。

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物用的重组融合抗原基因、重组融合抗原蛋白及含有其的亚单位疫苗组合物，特别是涉及一种抗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的重组融合抗原基因、重组融合抗原蛋白及其在亚单位疫苗组合物的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome；PRRS)于1987年首度在北美发现，之后数年陆续于全球养猪场爆发，对于养豬产业造成极大损失，因此如何防治PRRS成为全球养猪产业亟待解决的问题。各年龄层的猪只皆可能感染PRRS，除了造成猪只繁殖障碍之外，还会发生呼吸道症状并死亡。PRRS由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；PRRSV)感染所造成，此病毒隶属动脉病毒科(Arteriviridae)，含正向(+)单链RNA基因组，具有包膜，其病毒直径约为50-70nm。PRRSV的基因组总长为15kb，共有10个开放读码框(ORFs)。其中ORF5能够翻译出26kDa的糖化蛋白GP5，而ORF6则可翻译出19kDa的非糖化膜蛋白(unglycosylatedmembraneprotein；M)。

目前市售PRRSV疫苗主要有三类，包括活毒减毒疫苗、死毒疫苗以及由大肠杆菌生产的亚单位疫苗。活毒减毒疫苗虽可同时诱发细胞性与体液性免疫反应，但其中和抗体力价偏低，保护效力不足且有排毒与返毒风险。死毒疫苗虽无返毒风险但只能诱发体液性免疫反应，需免疫两次才可达到保护效果，且对异源性病毒完全失去保护力。此外，目前并无确切数据显示由大肠杆菌生产的亚单位疫苗具备保护效力。

有鉴于PRRSV为RNA病毒，其演化突变速度相当迅速，亟需开发一种安全、不有排毒与返毒风险且具免疫保护力的疫苗，以克服现有的疫苗的种种缺点。

发明内容

本发明的一方面是提供一种分离的核酸，其包含如序列编号(SEQIDNO.)：1所示的重组融合抗原基因，其中此重组融合抗原基因是将猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；PRRSV)的具有截短N’端诱饵表位(truncatedN’-terminaldecoyepitope)的糖蛋白GP5、连接序列以及膜蛋白M融合为重组序列并进行密码子优化。

其次，本发明的另一方面是提供一种重组病毒载体，其包含如SEQIDNO.：1所示的重组融合抗原基因。

再者，本发明的又一方面是提供一种重组融合抗原蛋白，其包含如SEQIDNO.：1所示的重组融合抗原基因经重组杆状病毒表达系统表达的重组融合抗原蛋白，由此提升其重组融合抗原蛋白的表达量。

本发明的再一方面是提供一种抗PRRSV感染的亚单位疫苗组合物，其包含如SEQIDNO.：1所示的重组融合抗原基因经重组杆状病毒表达系统表达的重组融合抗原蛋白及医药学上可接受的载剂，以提供较佳的疫苗保护力又不具排毒与返毒风险。

根据本发明的上述方面，提出一种分离的核酸，其包含如序列编号(SEQIDNO.)：1所示的重组融合抗原基因。

根据本发明的上述方面，另提出一种重组病毒载体，其包含如SEQIDNO.：1所示的重组融合抗原基因。

根据本发明的上述方面，又提出一种重组融合抗原蛋白，其包含如SEQIDNO.：1所示的重组融合抗原基因经重组杆状病毒表达系统表达的重组融合抗原蛋白。

根据本发明的上述方面，再提出一种抗PRRSV感染的亚单位疫苗组合物，其包含如SEQIDNO.：1所示的重组融合抗原基因经重组杆状病毒表达系统表达的重组融合抗原蛋白及医药学上可接受的载剂。

依据本发明一实施例，上述的医药学上可接受的载剂包含佐剂及/或免疫增效剂。在一个例示中，前述免疫增效剂可例如为CpG增效剂，其序列如SEQIDNO.：2所示。

应用本发明的抗PRRSV感染的重组融合抗原基因及其重组融合抗原蛋白，其是将PRRSV的具有截短N’端诱饵表位的糖蛋白GP5、连接序列以及膜蛋白M融合为重组融合抗原基因并将此序列进行密码子优化后，再利用重组杆状病毒表达系统进行体外表达，可提升其重组融合抗原蛋白的产量。所得的重组融合抗原蛋白在应用于亚单位疫苗组合物时，可提供较佳的疫苗保护力又不具排毒与返毒风险，从而有效改善现有的PRRSV抗原产量低落、免疫保护力不佳以及具排毒与返毒风险等种种问题。

附图说明

为了使本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，提供附图详细说明如下：

图1A绘示根据本发明一实施例的重组病毒载体的载体图谱。

图1B示出根据本发明一实施例的重组载体经限制酶作用后的电泳分析照片。

图2示出根据本发明一实施例的重组病毒载体经PCR反应后的产物的电泳分析照片。

图3示出根据本发明一实施例的Hi-5细胞表达重组融合抗原蛋白的SDS-PAGE分析照片。

图4示出根据本发明一实施例的Hi-5细胞表达重组融合抗原蛋白的Western印迹分析照片。

具体实施方式

承前所述，本发明提供一种抗PRRSV感染的重组融合抗原基因及其重组融合抗原蛋白，其是将PRRSV的具有截短N’端诱饵表位的糖蛋白GP5、连接序列以及膜蛋白M融合为重组融合抗原基因并将此序列进行密码子优化后，再利用重组杆状病毒表达系统进行体外表达，可提升其重组融合抗原蛋白的产量。

本发明此处所称的「重组融合抗原基因」是指如序列编号(SEQIDNO.)：1所示的重组融合抗原基因序列。在一实施例中，将PRRSV的糖蛋白GP5的N’端诱饵表位截短后的基因序列，利用连接(linker)序列与膜蛋白M的基因序列融合为重组序列(或称为6LdN5)。

具体言之，PRRSV的糖蛋白GP5与膜蛋白M为病毒包膜(envelope)的主要成分，二者形成以双硫键结合的双聚体，其含量至少占总病毒蛋白的1/2。糖蛋白GP5与膜蛋白M均能诱发保护性免疫反应并诱发宿主产生中和抗体，但位于糖蛋白GP5的N-末端处的诱饵表位(decoyepitope)约30个氨基酸会减低中和抗体的产生及其反应性，因此本发明的特征之一就是截去糖蛋白GP5的N’端诱饵表位第1个氨基酸至第10个氨基酸，形成「截短N’端诱饵表位」的糖蛋白GP5，利用连接序列与膜蛋白M融合为重组序列，并对此重组序列进行密码子优化，由此不仅增加后续于重组杆状病毒表达系统中的产量，所得的重组融合抗原蛋白经过真核表达系统的后翻译修饰后，也具有正确的三级结构及折叠。

本发明此处所称的「连接序列」用以连接糖蛋白GP5以及膜蛋白M，其长度不限，可例如为6个碱基至30个碱基，然而以9个碱基至24个碱基为较佳，又以9个碱基至15个碱基为更佳。在一个例子中，所述连接序列可为12个碱基。

本发明此处所称的「密码子优化」指在不改变原氨基酸序列的前提下，根据重组杆状病毒表达系统对各氨基酸密码子的喜好，进行密码子优化，使重组蛋白可以进行正确的后翻译修饰，发挥免疫保护效果。其理由在于，大肠杆菌虽然是目前最普遍的蛋白质表达系统，具有生长周期快、产量高及成本低等优点，但无法进行正确的糖化作用等翻译后修饰，以致形成不溶性内涵体的机率较高。相较之下，重组杆状病毒表达系统可产生大量重组蛋白，而且可以进行正确的糖化作用等翻译后修饰。在一实施例中，由此表达所得的重组融合抗原蛋白具有正确的糖基以及折叠结构。

上述SEQIDNO.1所示的重组融合抗原基因序列(或称为6LdN5)，利用市售序列分析软件(例如DNAStar)，与原始基因(或称wild-type)比对后，其比对结果如表1所示。

表1

由表1的比对结果可知，SEQIDNO.1所示的重组融合抗原基因序列(或称为6LdN5)经密码子优化后，与原始基因(或称野生型)的相似度仅为89.5％。

本发明此处所称的「重组杆状病毒表达系统」指杆状病毒表达载体(baculovirusexpressionvector；BEV)及其宿主昆虫细胞所构成的基因表达系统。杆状病毒是一种感染无脊椎动物的大型DNA病毒，主要寄主为昆虫及部分节肢动物。由于人类及其它脊椎动物都不是杆状病毒的寄主，因此由杆状病毒所开发出的杆状病毒表达载体系统(baculovirusexpressionvectorsystem；BEVS)非常安全。所谓杆状病毒表达载体是指载有外源基因的重组杆状病毒(recombinantbaculovirus)。一旦杆状病毒表达载体感染宿主昆虫细胞，即可利用杆状病毒表达载体中的强启动子控制外源基因的表达，并生产出大量的重组蛋白。由杆状病毒表达载体系统所得的重组蛋白的翻译后修饰(post-translationalmodifications)，例如，与在哺乳动物细胞中所生产者相类似，因此利用杆状病毒表达载体系统所生产的重组蛋白，不论在抗原性、免疫原性以及生物活性上，大体上与原来蛋白质相似甚至几乎一致。

在一个例子中，前述重组融合抗原基因序列在构建于杆状病毒载体后，重组融合抗原基因序列的5'端更可选择性地与杆状病毒膜糖蛋白(membraneglycoprotein)gp64的信号肽的基因序列连接。由此表达具有gp64的信号肽的重组融合抗原蛋白，在细胞内的递送过程中，gp64的信号肽可被切除。

在应用时，可将本发明的重组融合抗原蛋白与医药学上可接受的载体，制成亚单位疫苗组合物，接种于猪只。在一实施例中，前述医药学上可接受的载剂包含佐剂及/或免疫增效剂，其中前述佐剂的种类不限，其具体例子可包括但不限于铝胶佐剂、油质佐剂(例如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等)或上述的任意组合。前述免疫增效剂可例如具有CpG岛的免疫刺激性寡核苷酸(或称CpG增效剂)等。在一例示中，前述CpG增效剂可例如SEQIDNO.：2所示的序列。在一实施例中，经上述含有CpG增效剂的亚单位疫苗组合物免疫的猪只，其对抗PRRSV感染的保护力可达100％。

由于本发明的重组融合抗原蛋白是将PRRSV的糖蛋白GP5的N-端诱饵表位(decoyepitope)截短并与膜蛋白M基因融合，中间加入连接序列，再将此重组融合抗原基因序列进行密码子优化，可强化其于昆虫细胞的表达。其次，当带有此重组融合抗原基因的重组病毒载体转染至重组杆状病毒表达系统进行表达时，可有效提高重组融合抗原蛋白的产量。

其次，本发明利用重组杆状病毒表达系统进行生产，可以进行悬浮培养，不仅操作简单、产率高、生产规模容易放大，而且宿主昆虫细胞具有与哺乳动物细胞相似的翻译后修饰作用，可生产保有原来生物功能的抗原蛋白。本发明经后续动物免疫实验证实，以此制得的亚单位疫苗组合物的保护效力高达100％，可提供受免疫动物较佳的疫苗保护力又不具排毒与返毒风险，故此技术可望应用在新剂型的PRRSV疫苗组合物，以防治猪繁殖与呼吸道综合症。

以下利用数个实施例说明本发明的应用，然而其并非用以限定本发明，本发明技术领域中的技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修改与改变。

实施例一：pBacF-gp-6LdN5重组病毒载体的建立

在此实施例中，依据NCBIGenbank所公开的含有PRRSVORF5(糖蛋白GP5)及ORF6(M蛋白)的序列AF035409，设计6LdN5重组融合抗原基因。

参阅SEQIDNo.：1的序列，首先，将ORF6(第145个碱基至第681个碱基)设计于ORF5(第694个碱基至第1266个碱基)的前端，中间加入连接序列(第682个碱基至第693个碱基)，并于ORF5及ORF6基因两端设计带有SalI(第121个碱基至第126个碱基)、多重限制酶切位点序列(第127个碱基至第144个碱基)、及NotI(第1288个碱基至第1295个碱基)的限制酶切位点。在上述SalI限制酶切位点的5’端，可进一步连接至后续由pBacF-gp转化载体(transfervector)提供的gp64信号肽的基因序列(第1个碱基至第120个碱基)，使PRRSVORF6的N’端序列与gp64信号序列融合。在ORF5(第694个碱基至第1266个碱基)之后另连接His标签(第1267个碱基至第1284个碱基)以及终止密码子(第1285个碱基至第1287个碱基)，并以市售基因设计软件(例如GenomicsBioSci&Tech,Ltd.提供的CodonOptimizationServices或其它市售可得的软件，如EnCorBiotechnologyInc.提供的CodonOptimizationCalculator，DNA2.0,Inc.提供的ExpressionOptimizationTechnology，ProteinCTBiotech提供的CodonOptimizationandVerificationServices等)进行密码子优化后，合成重组基因并命名为6LdN5，其大小为1295bp。

上述6LdN5重组融合抗原基因的核酸片段经纯化后，与pBacPAK8-gp转化载体(即杆状病毒载体，具有gp64信号肽的基因序列)进行接合，以构建重组病毒载体。

前述的pBacPAK8转化载体的全长大小为约5.5kb，包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus；AcMNPV)基因，可提供与所转化的DNA进行重组的序列。pBacPAK8转化载体另含有高度表达的多角体启动子(polyhedrinpromoter；PPH)、抗氨苄西林(ampicillin；Amp)的选择性标记基因及SV40聚腺苷酸化信号(polyadenylationsignal)。前述的6LdN5的重组基因与pBacPAK8-gp病毒载体(带有gp64信号肽的基因序列)接合后，即为重组病毒载体(或称pBacPAK8-gp-6LdN5)，其全长大小为约6.5bp，如图1A所示。

上述所得的重组病毒载体(或称pBacPAK8-gp-6LdN5)再转化至大肠杆菌(EscherichiacoliXL-1Blue；Invitrogen,California,USA)感受态细胞，以抗生素筛选目标基因确实插入表达载体的菌株，再利用限制酶XbaI(在pBacPAK8-gp病毒载体上，紧邻gp34基因序列5’端的上游)以及NotI切割出目标基因并经DNA电泳分析，其结果如图1B所示。

参阅图1B，其示出根据本发明一实施例的重组病毒载体经限制酶切后的产物的电泳分析照片，其中第M道为DNA标记，第1道为pBacPAK8-gp病毒载体利用限制酶XbaI以及NotI切割后的DNA片段，第2道为重组病毒载体(pBacPAK8-gp-6LdN5)利用限制酶XbaI(酶切位点在病毒载体上)以及NotI切割后的DNA片段，而第2道在1295bp处即为6LdN5的重组基因以及部分载体序列的DNA片段。

另外，上述所得的转化株，再利用PCR反应并经DNA电泳分析，其结果如图2所示。上述PCR反应可利用5μL的2xPCRMastermix(0.5USuperThermDNApolymerasemix，200μMdNTPs，1.5mMMgCl₂，1x缓冲液)(Bertec,Taiwan)、1μL的2.5mM6L5(SalI)正向引物、1μL的2.5mM5his(NotI)反向引物以及3μL的二次去离子水配制成反应物后，先在94℃反应5分钟，然后依序在94℃进行1分钟的DNA变性步骤、在56℃进行90秒的DNA与引物黏合步骤以及在72℃进行1分钟的DNA扩增步骤等三个步骤，进行30次的循环，循环结束后，在72℃进行7分钟的DNA扩增步骤。反应结束后，取4μLPCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检视结果。前述6L5(SalI)正向引物的序列如SEQIDNO：3所示，而5his(NotI)反向引物的序列则如SEQIDNO：4所示。以上述6L5(SalI)与5his(NotI)的引物对扩增出的DNA序列，包含截短N’端诱饵表位的糖蛋白GP5的基因序列、连接序列与膜蛋白M的基因序列，但不含gp64信号肽的基因序列。

参阅图2，其示出根据本发明一实施例的重组病毒载体经聚合酶链锁反应(polymerasechainreaction；PCR)反应后的产物的电泳分析照片，其中第M道为DNA标记，第1道为重组病毒载体(pBacPAK8-gp-6LdN5)经PCR反应及1％琼胶电泳分析后，确认所得的DNA片段为1151bp。

将上述初步确定的转化株另委托台北源资国际生物科技股份有限公司以核酸序列自动测序仪(ABI3730,CDGenomics,USA)进行核酸测序后，确认插入的序列正确无误。前述构建转化载体、细胞转化体、筛选目标菌株、质体DNA萃取、限制酶反应、PCR反应、DNA电泳分析、DNA测序等，应为本发明所属技术领域中任何具有普通知识者所熟知，此处不再赘述。

实施例二：重组杆状病毒表达系统的建立

1.昆虫细胞培养

此实施例以秋行军虫蛹Sf9细胞株(Spodopterafrugiperda)(BCRC60011；ATCCCRL-1711)或粉纹夜蛾(Trichoplusiani)卵HighFive(以下简称Hi-5)细胞株(BTI-TN-5B1-4)(例如InvitrogenCo.)建立重组杆状病毒表达系统。

取9mL的Sf-9细胞培养基或Hi-5细胞培养基，加入10cm培养皿中。将Sf9细胞株或Hi-5细胞株的冷冻小管，快速至37℃水浴槽中解冻后，将细胞液均匀地分散于Sf-9细胞培养基或Hi-5细胞培养基中。之后，将培养皿置于28℃培养箱中培养，并以贴附方式生长，此时细胞型态为光滑圆润形状。

上述Sf-9细胞培养基为Grace’sInsect细胞培养基，每1000mL含0.35gNaHCO₃、3g乳蛋白水解物、20mL酵母提取物以及10％的FBS，另添加10,000单位/mL青霉素/链霉素。上述Hi-5细胞培养基可使用例如Sf-900IITMSFM(Invitrogen/GIBCO，USA)。

2.Sf-9细胞的转染

取3×10⁵/mLSf9细胞在12孔组织培养皿中培养，静置于室温下至少1小时，待细胞贴附，再各别取1μg重组病毒载体DNA与2μLflashBACDNA与6μLReagent以UnsupplementedGrace’sMedium混合均匀，室温下静置45分钟，移除12孔组织培养皿中的细胞上清液。之后，以Sf-900IISFM清洗2次后，移除培养基，并将上述混合物1mL加入含细胞的12孔组织培养皿中，于27℃静置培养5小时后，移除上清液，再加入1mL生长培养基(TNM-FH；Sigma-AldrichCo.LLC.,USA)，静置于27℃培养箱5天以上或直到观察到细胞出现感染症状。

3.重组杆状病毒的分离与病毒力价增辐

将上述转染后的Sf9细胞经3至5天的培养，若观察细胞出现受到病毒感染的细胞病变型态(cytopathiceffect；CPE)时，即可进行回收重组杆状病毒。

首先，将上清液移入1.5mL离心管以1,000xg，离心5分钟，再将含有零代(P0)重组杆状病毒的种毒库存液(virusstock)，分装移入新的棕色1.5mL离心管，避光储存于-80℃备用。

取3×10⁵/mL的Sf9细胞均匀回种至12孔组织培养皿中，室温下静置至待细胞贴附，再取15μL的零代(P0)重组杆状病毒液加入培养基中，静置于27℃培养箱5天后，即可进行分离初代(P1)重组杆状病毒。分离时，将细胞上清液移入离心管，以1,000xg的转速离心5分钟后，再将含有初代(P1)重组杆状病毒的种毒库存液，分装移入新的棕色离心小管中，避光储存于-80℃备用。

重复上述步骤，放大第二代(P2)的重组杆状病毒的产量后，回收病毒液并将第二代(P2)重组杆状病毒的种毒库存液储存于-80℃备用。

实施例三：重组杆状病毒表达系统的重组融合抗原蛋白的表达评估

1.分离重组融合抗原蛋白

取25mL的1×10⁶/mLHi-5细胞回种于125mL三角摇瓶中，加入重组杆状病毒后于27℃培养3-5天后收取细胞，于4℃10,000xg，离心10分钟后去除上清液，而细胞部分则以超音波破碎机将细胞打破，定量蛋白后即完成重组融合抗原蛋白(或称BV-gp6LdN5)的萃取，并以SDS-PAGE与Western印迹法分析。

2.SDS-PAGE分析

将换算定量过的样品蛋白，加入4xSampleBuffer混合均匀，并于沸水煮沸5分钟，利用SDS使蛋白质变性并且均匀带负电。将制作胶体(gel)的玻璃平板装置妥当，并补满纯水测试装备是否安装妥当。于小烧杯依序加入表2所示的试剂，制作分离胶体。

表2

备妥上述分离胶体之后，将分离胶体缓慢注入玻璃平板内，并在分离胶体的界面上缓缓加上ddH₂O，待25分钟后分离胶体凝结聚合，以滤纸将残余的ddH₂O吸干。再依序加入表3所示的试剂，制作叠层胶体(stackinggel)。

表3

约15分钟后，叠层凝胶聚合完成，即可注入样品。将玻璃平板于垂直电泳槽上装置妥当，加入1xRunning缓冲液。将样品置入胶体中，样品于叠层胶体时设60V，等跑到分离胶体改以120V分离蛋白质。约3小时后，可完成电泳程序，其结果如图3所示。

参阅图3，其示出根据本发明一实施例的Hi-5细胞表达重组融合抗原蛋白的SDS-PAGE分析照片，其中1μg、2μg、4μg、8μg的BSA的条带用来建立标准曲线，第M道为蛋白质标记，第1道为Hi-5细胞蛋白的条带，第2道为由Hi-5细胞表达重组融合抗原蛋白的条带。由图3的第2道条带的结果可知，Hi-5细胞所表达的重组融合抗原蛋白的大小为41kDa。

3.Western印迹法分析

上述SDS-PAGE蛋白质电泳完成后，拆下玻璃片切除叠层胶体，将分离胶体浸泡于转印缓冲液(Transferbuffer)中10分钟。另准备转渍夹，于转渍夹铺上一层以转印缓冲液浸泡过的Whatman3M滤纸(Advantec,Japan)。剪下适当大小的PVDF转印膜(ImmobilonTM-PTransferMembrane,Millipore,Ireland)浸泡于100％甲醇时间约为5分钟左右，再以转印缓冲液浸泡至表面，放置于滤纸上。将浸泡于转印缓冲液的胶片放置于PVDF膜上，最后铺上一张滤纸，将夹好胶与膜的转渍夹放入转渍槽中。有PDVF膜需放置于朝向正极，而胶片朝向负极，以250mA条件下，进行转渍75分钟。

取下PVDF膜以1xPBST清洗5分钟，加入封闭缓冲液，于4℃震荡1小时。加入一级抗体(Mouseanti-HisMonoclonalAntibody，RuralTechnologies,Inc.；稀释倍数：1:2,000)，置于4℃震荡18小时。去除一级抗体后，以1xPBST清洗PVDF膜数次后，再加入二级抗体(GoatAnti-mouseIgG-HRP，Chemicon,USA；稀释倍数：1:15,000)，置于4℃震荡60分钟。去除二级抗体后，以1xPBST清洗PVDF膜数次。接着，去除PBST缓冲液，加入ECLPlus显色剂(ECLPlusWesternBlottingDetectionReagents，GEHealthcare,UK)，反应1分钟。之后，将PVDF膜置于冷光仪照相系统(SYNGENEG,博克科技,Taiwan)的平台正中间，以市售影像分析软件进行分析后，可计算出目标蛋白的分子量，其结果如图4所示。

参阅图4，其示出根据本发明一实施例的Hi-5细胞表达重组融合抗原蛋白利用抗His单株抗体的Western印迹分析照片，其中第M道为蛋白质标记，第C道为Hi-5细胞蛋白的条带，第1道为Hi-5细胞表达第2天的重组融合抗原蛋白的条带，第2道为Hi-5细胞表达第3天的重组融合抗原蛋白的条带，第3道为Hi-5细胞表达第4天的重组融合抗原蛋白的条带，第4道为Hi-5细胞表达第5天的重组融合抗原蛋白的条带。由图4的第1-4道条带的结果可知，重组融合抗原蛋白的产量随着表达天数的增加而依次递增，在第5天时重组融合抗原蛋白的产量为533μg/mL。

4.毒力试验

选取3-4周龄的刚断奶仔猪，PRRSV和猪瘟(classicalswinefever；CSF)抗原及抗体皆阴性的猪8头。在进行攻毒前3天，将所有试验猪测量体温3天，体温均正常者才进行攻毒。进行攻毒时，以10^5.0TCID₅₀/mL的PRRSV病毒力价，于每头颈部肌肉注射3mL。攻毒后，每天测量体温并观察14天。观察期结束后，进行剖检观察临床症状及病理变化，同时采血进行PCR检测。

5.免疫攻毒试验

选取3-4周龄的刚断奶仔猪，PRRSV和CSF抗原、抗体均阴性的猪15头，随机分三组，第一组：免疫前述萃取的重组融合抗原蛋白与市售油质佐剂(例如弗氏不完全佐剂等)5头，每头颈部肌肉注射2mL的亚单位疫苗组合物(含有50μg抗原蛋白以及1.2mL油质佐剂)。第二组：前述萃取的重组融合抗原蛋白、市售油质佐剂(例如弗氏不完全佐剂等)与CpG增效剂(如SEQIDNO.：2所示的序列)，每头颈部肌肉注射2mL的亚单位疫苗组合物(50μg抗原蛋白、1.2mL油质佐剂以及50μgCpG增效剂)。剩余未接种的猪作为阴性对照，仅接种High5细胞液与油质佐剂(含有125μL细胞萃取液以及1.2mL油质佐剂)，隔离饲养。免疫28天后将所有试验猪进行PRRSV病毒液攻毒，颈部肌肉注射10^5.0TCID₅₀/mL，每头注射3mL。观察21天。待观察期结束后进行剖检，根据临床症状、病理变化和抗原、抗体检测进行判定。

经上述免疫攻毒试验后，第一组的猪只的保护效力高达75％，第二组的猪只的保护效力更高达100％，而第三组的猪只的保护效力为0％。由此确实证明以此制得的亚单位疫苗组合物确实可提供充份的保护效力，而且亚单位疫苗组合物中添加免疫增效剂，保护效力更佳，可望应用在新剂型的PRRSV亚单位疫苗组合物，以防治猪繁殖与呼吸道综合症。

需补充的是，本发明虽以特定的重组质粒、表达系统、分离方法、培养方法、分析方法或特定仪器作为例示，说明本发明的抗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的重组融合抗原基因、重组融合抗原蛋白及含有其的亚单位疫苗组合物，本发明所属技术领域中任何具有普通知识者可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的抗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的重组融合抗原基因、重组融合抗原蛋白及含有其的亚单位疫苗组合物亦可使用其它重组质粒、其它的真核表达系统、其它分离方法、其它培养方法、其它分析方法或其它仪器进行。

由上述本发明实施例可知，本发明的抗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的重组融合抗原基因、重组融合抗原蛋白及含有其的亚单位疫苗组合物，其优点在于将PRRSV的具有截短N’端诱饵表位的糖蛋白GP5、连接序列以及膜蛋白M融合为重组融合抗原基因并将此序列进行密码子优化后，再利用重组杆状病毒表达系统进行体外表达，可提升其重组融合抗原蛋白的产量。所得的重组融合抗原蛋白在应用于亚单位疫苗组合物时，可提供较佳的疫苗保护力又不具排毒与返毒风险，从而有效改善现有的PRRSV抗原产量低落、免疫保护力不佳、以及具排毒与返毒风险等种种问题。

虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然而其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域中任何具有普通知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修改与改变，因此本发明的保护范围以所附权利要求书为准。