一种筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法

摘要

本发明提供了一种筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法，属于DNA检测技术领域。本发明利用单基因缺失型突变体生物材料，采用化学发光酶联免疫法检测基因组DNA链中的碱基甲基化水平，通过比较基因缺失型突变体与其同源正常对照组细胞中基因组DNA的甲基化水平，分析突变体中缺失基因与DNA碱基甲基化修饰的关系，筛选出与DNA甲基化修饰相关的基因。该方法既具有对DNA中甲基化碱基的检测特异性，又具有极高的检测灵敏度。本发明操作步骤简便，成本较低，稳定性强，无需大型昂贵设备，可同时检测多个样本。

说明书

技术领域：

本发明涉及DNA检测技术领域，具体是一种筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法。

技术背景:

生物体在有氧活动过程中会产生氧化性DNA损伤，并能激活体内修复系统及时修 复DNA损伤，维持机体遗传结构稳定、功能正常。当机体相关基因功能缺失或异常时，机体对 损伤的修复能力下降。由于生物体内存在基因互补作用，使很多单基因缺失型突变体在一 般条件下能维持生理状态，但遭遇环境刺激时，因突变体维持机体稳态的功能低下，与正常 对照组产生差异。

DNA分子中碱基的甲基化修饰与DNA氧化损伤有关，还涉及目前最新的表观遗传学 控制理论，是近年来生物学和医学领域研究的热点。DNA分子中胞嘧啶和鸟嘌呤的甲基化参 与机体中DNA分子结构的稳定及转录调节，与环境暴露和肿瘤发生有直接关系。研究发现， 人类组织中DNA胞嘧啶甲基化(M5C)和鸟嘌呤甲基化(M1G)状态与多种疾病和癌症的发生有 关，真核生物基因组DNA甲基化特征的改变会影响基因转录和一系列生理过程。但是关于甲 基化修饰在机体生理中的作用及机制研究还处于起步阶段，很多过程有待发现。目前对DNA 甲基化的研究很大程度上依赖于基因缺失型突变体材料，筛选甲基化修饰相关基因是研究 DNA甲基化作用及机制的关键之一。

目前，对DNA甲基化修饰相关基因的筛选，可采用芯片技术、高通量测序技术、高压 液相色谱、高压液相-质谱(LC-MS)联用技术。其中，高压液相色谱、高压液相-质谱联用技术 可分析DNA样品中碱基的总甲基化水平，芯片技术可以检测DNA中特定序列中的胞嘧啶甲基 化水平，高通量测序能对基因组DNA序列中胞嘧啶的甲基化特征进行检测。通过这些技术可 获得组织细胞中DNA的甲基化水平和特征，经过对不同基因缺失型材料与正常对照组材料 中DNA甲基化特征的比对分析，可筛选出甲基化修饰相关的功能基因，但均需昂贵设备和专 门技术人员，费用较高，一般实验室难以开展。因此，发明一种简便快速、高效、稳定的筛查 方法非常必要。

随着技术的进步，我们能够获得越来越多的突变体材料，为基因功能研究提供了 便利，但很多基因的功能尚属未知。为快速筛查DNA甲基化修饰相关基因，我们研究建立了 以基因缺失型突变体为材料，化学发光酶联免疫法检测为基础，氧化剂处理辅助筛选为特 点，快速筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法。

发明内容：

本发明的目的是建立一种简便、易行、效果良好的筛查DNA甲基化修饰相关基因的 方法，以解决用大型昂贵设备检测所带来的不便。

本发明提供了一种筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法，包括如下步骤：

(1)取单基因缺失的突变体生物材料及其相应的对照组材料；设药物处理组和对 照组，药物处理组用过氧亚硝酸盐(peroxynitrite)处理，对照组不加过氧亚硝酸盐；取药 物处理组和对照组材料的组织或细胞，提取基因组DNA，加灭菌双蒸水或TE缓冲液(含10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解；

(2)取步骤(1)得到的纯度和质量合格的DNA样品，于4℃超声波断裂为长度450- 1500nt的片段，100℃保温5-8分钟后迅速制冷，加入等体积预冷2mol/L乙酸铵溶液，混匀；

(3)取DNA标准品和步骤(2)处理的DNA样品各1-10μg，分别加入到装有硝酸纤维素 膜的Bio-Dot的狭缝或小孔底部，各点位加载等质量的DNA样品，接通低真空泵抽真空30-60 分钟；

(4)取甲基胞嘧啶(M5C)或甲基鸟嘌呤(M1G)的特异性单克隆抗体，采用化学发光 酶联免疫法检测DNA样品中的碱基甲基化水平；

(5)比较基因缺失型突变体材料与对照组材料中基因组DNA的甲基化水平，分析突 变体材料与对照组材料甲基化水平的差异，筛选与对照材料基因组DNA甲基化水平明显不 同的突变体作为甲基化修饰功能缺陷的突变体，突变体所缺失的基因为甲基化修饰相关基 因。

所述的突变体生物材料，是具有单基因缺失突变的动物、植物或微生物，或者是具 有单基因缺失突变的体外培养的组织或细胞。

所述的用过氧亚硝酸盐处理，是用浓度为10-200μmol/L的过氧亚硝酸盐处理3- 6h。

所述的DNA标准品为博来霉素处理的小牛胸腺DNA。

所述的DNA甲基化修饰相关基因是鸟嘌呤甲基化(M1G)修饰相关基因或胞嘧啶甲 基化(M5C)修饰相关基因。

所述的对照组材料，是指与突变体材料种属特性相同且不含有已知的基因变异的 正常生物个体或细胞，如野生型酵母菌株或野生型拟南芥材料，可以分别作为酵母菌突变 体和拟南芥突变体研究的对照组材料。

与现有技术相比，本发明的有益效果和特点：

本发明采用超声波处理来断裂DNA分子，快速简便，可使DNA链断裂为450-1500nt 的片段，易于DNA链中甲基化碱基的暴露。加热使DNA双螺旋变性成为单链后加入乙酸铵可 防止DNA复性，保障了点加于硝酸纤维素膜上的DNA分子为短的单链分子，便于一级抗体的 识别结合。

用氧化剂过氧亚硝酸盐处理生物材料，可使基因缺失突变体与对照组材料间的 DNA甲基化水平差异增大，易于检出甲基化功能缺陷的突变体，进而筛选甲基化修饰相关的 基因。

检测过程使用甲基胞嘧啶或甲基鸟嘌呤特异性单克隆抗体，能特异性识别结合 DNA链中的甲基化碱基，二级抗体携带了化学发光催化酶-过氧化物酶，以鲁米诺-过氧化氢 为发光底物进行化学发光酶联免疫检测，因此既保障了检测的特异性，又提高了检测的灵 敏度。

选用Bio-Dot或Bio-DotSF仪进行检测，能同时对16--48个DNA样品进行测试，提 高了筛选的效率。

本发明的方法高效、经济，适用于从基因缺失型突变体库中筛选DNA甲基化修饰相 关的功能基因。

附图说明：

图1化学发光酶联免疫法检测酵母菌M1G的图片，每个样品2个重复点位

图2CT-DNA检测结果及标准曲线

图3酵母菌突变体rad2与野生型(wild)菌株基因组DNA中M1G含量

图4酵母菌突变体apn1与野生型(wild)菌株基因组DNA中M1G含量

具体实施方式：

实施例1：酵母菌中与DNA甲基鸟嘌呤(M1G)修饰相关基因的筛选

取酿酒酵母野生型和基因缺失型突变体rad2菌株的细胞，分别接入YPD液体培养 基中活化过夜，之后，于30℃、200-250r/min培养，每隔2小时取少量培养液，检测OD₆₀₀值，绘 制野生型和突变体菌的生长曲线，并用血球计数板计数细胞浓度，找出特定菌株细胞生长 过程中细胞浓度与OD₆₀₀值呈线性对应的区间；

取生长对数期细胞，药物处理组采用终浓度为50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理，对 照组不加过氧亚硝酸盐；30℃、200r/min作用3小时；

用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒，按照QIAGENGenomicDNAHandbook操作，提取 酵母基因组DNA，溶于无菌双蒸水中；

检测DNA样品的OD₂₆₀和OD₂₈₀值，计算DNA浓度和纯度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测 DNA分子完整性；取质量合格的DNA样品适量于1.5ml离心管中，于4℃超声波处理20-60秒；

选博来霉素修饰的小牛胸腺DNA(CT-DNA)作为标品，稀释成系列浓度梯度溶液，用 于制备标准曲线；

DNA标品管和待测样品管于恒温金属浴中100℃保温6-10分钟左右，迅速插入碎冰 中，加入等体积2mol/L预冷乙酸酸铵溶液，上下颠倒混匀；

取硝酸纤维素膜1张，用去离子水浸湿后，加6×SSC溶液(氯化钠105.18g，柠檬酸 钠52.92g，溶于1000ml蒸馏水中，pH7.0)浸泡。垫衬滤纸用6×SSC溶液浸湿，置于Bio-Dot 仪底座上，将硝酸纤维素膜平铺于滤纸上，固定Bio-Dot仪盖子；

用移液器取DNA样品1-6μg，全部加入狭缝或小孔底部，各点位加载的DNA质量相 同，每个DNA样品点加于2个点位，用1mol/L的乙酸铵400-500μl冲洗狭缝或小孔，接通低真 空泵抽至膜表面无湿气；

打开Bio-Dot仪盖子，用镊子取出硝酸纤维素膜，置于洁净玻璃管内，于80℃旋转 烘干；

取出硝酸纤维素膜，用2％脱脂牛奶粉-TBS(含20mMTris-HCl，500mMNaCl， pH7.5)封闭60-90分钟，TBST(含20mMTris-HCl，500mMNaCl，0.1％Tween20，pH7.5)洗脱 30-60分钟；

将硝酸纤维素膜转入洁净塑料袋内，加入M1G特异性单克隆抗体，赶走袋内空气， 袋口加热塑封，置于4℃震荡孵育过夜；

剪开塑封袋一侧，小心取出硝酸纤维素膜，用TBST洗脱30分钟，将硝酸纤维素膜转 入新的塑料盒内，加入带有辣根过氧化物酶的二级抗体，孵育30-60分钟，倒掉二抗，加TBST 洗脱30-60分钟；

取出硝酸纤维素膜，置于洁净塑料盒内，加入新鲜配制的化学发光液(含发光底物 鲁米诺和起动剂过氧化氢)，浸泡30秒-2分钟，取出硝酸纤维素膜，置于凝胶成像分析仪中， 用ChemiDoc^TM的CCD收集信号；

测量每个点位的化学发光(见图1)信号值，计算各DNA样品的平均信号值；用CT- DNA标品绘制标准曲线(见图2)，并依据标准曲线计算各测试DNA样品中的甲基鸟嘌呤含量。

检测发现，酿酒酵母菌野生型菌株细胞中M1G含量基础值为0.20fmol，经50μmol/L 的过氧亚硝酸盐处理后M1G含量提高至0.61fmol；突变体rad2细胞中M1G含量基础值为 0.23fmol，50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理后M1G含量提高至1.10fmol；过氧亚硝酸盐处理后 突变体rad2基因组DNA中M1G含量显著高于野生型(见图3)。说明酿酒酵母菌中基因RAD2功 能缺失可导致基因组DNA稳定性降低，使突变体中碱基甲基化水平高于对照组，即RAD2基因 为DNA甲基化修饰相关基因。

实施例2：酵母菌中与DNA甲基鸟嘌呤(M1G)修饰相关基因的筛选

取酿酒酵母野生型和基因缺失型突变体apn1菌株的细胞，分别接入YPD液体培养 基中活化过夜，之后，于30℃、200-250r/min培养，每隔2小时取少量培养液，检测OD₆₀₀值，绘 制野生型和突变体菌的生长曲线，并用血球计数板计数细胞浓度，找出特定菌株细胞生长 过程中细胞浓度与OD₆₀₀值呈线性对应的区间；

取生长对数期细胞，药物处理组采用终浓度为50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理，对 照组不加过氧亚硝酸盐；30℃、200r/min作用3小时；

用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒，按照QIAGENGenomicDNAHandbook操作，提取 酵母基因组DNA，溶于无菌双蒸水中；

检测DNA样品的OD₂₆₀和OD₂₈₀值，计算DNA浓度和纯度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测 DNA分子完整性；取质量合格的DNA样品适量于1.5ml离心管中，于4℃超声处理20-60秒；

选博来霉素修饰的小牛胸腺DNA(CT-DNA)作为标品，稀释成系列浓度梯度溶液，用 于制备标准曲线；

DNA标品管和待测样品管于100℃保温6-10分钟，迅速插入碎冰中，加入等体积 2mol/L预冷乙酸铵溶液，上下颠倒混匀；

取硝酸纤维素膜1张，用去离子水浸湿后，加6×SSC溶液(氯化钠105.18g，柠檬酸 钠52.92g，溶于1000ml蒸馏水中，pH7.0)浸泡。垫衬滤纸用6×SSC溶液浸湿，置于Bio-Dot 仪底座上，将硝酸纤维素膜平铺于滤纸上，固定Bio-Dot仪盖子；

用移液器取DNA样品1-6μg，全部加入狭缝或小孔底部，各点位加载的DNA质量相 同，每个DNA样品点加于2个位点，用1mol/L的乙酸铵400-500μl冲洗狭缝或小孔，接通低真 空泵抽至膜表面无湿气；

打开Bio-Dot仪盖子，用镊子取出硝酸纤维素膜，置于洁净玻璃管内，于80℃旋转 烘干；

取出硝酸纤维素膜，用2％脱脂牛奶粉-TBS(含20mMTris-HCl，500mMNaCl， pH7.5)封闭60-90分钟，TBST(含20mMTris-HCl，500mMNaCl，0.1％Tween20，pH7.5)洗脱 30-60分钟；

将硝酸纤维素膜转入洁净塑料袋内，加入M1G特异性单克隆抗体，赶走袋内空气， 袋口加热塑封，置于4℃震荡孵育过夜；

剪开塑封袋一侧，小心取出硝酸纤维素膜，用TBST洗脱30分钟，将硝酸纤维素膜转 入新的塑料盒内，加入带有辣根过氧化物酶的二级抗体，孵育30-60分钟，倒掉二抗，加TBST 洗脱30-60分钟；

取出硝酸纤维素膜，置于洁净塑料盒内，加入新鲜配制的化学发光液(含发光底物 鲁米诺和起动剂过氧化氢)，浸泡30秒-2分钟，取出硝酸纤维素膜，置于凝胶成像分析仪中， 用ChemiDoc^TM的CCD收集信号；

测量每个点位的化学发光信号值，计算各DNA样品的平均信号值；用CT-DNA标品绘 制标准曲线，并依据标准曲线计算各测试DNA样品中的甲基鸟嘌呤含量。

检测发现，酿酒酵母菌野生型菌株细胞中M1G含量基础值为0.20fmol，经50μmol/L 的过氧亚硝酸盐处理后M1G含量提高至0.61fmol；突变体apn1细胞中M1G含量基础值为 0.23fmol，50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理后M1G含量提高至1.05fmol；过氧亚硝酸盐处理后 突变体apn1基因组DNA中M1G含量显著高于野生型(见图4)。说明酿酒酵母菌中基因APN1功 能缺失可导致基因组DNA稳定性降低，使突变体中碱基甲基化水平高于对照组，基因APN1为 DNA甲基化修饰相关基因。