血管内皮钙黏蛋白抗原表位、抗体及其应用

摘要

本发明涉及分子生物学及免疫学技术领域，尤其涉及血管内皮钙黏蛋白抗原表位、抗体及其应用。本发明提供了血管内皮钙黏蛋白抗原表位、抗体及其应用。该抗原表位氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，位于CDH5蛋白的N端，具有更高的保守性。本发明提供的表位是中和性表位，能够特异性的识别肿瘤血管并抑制其生成。本发明通过试验证实，该表位能够特异性识别肿瘤血管中的血管内皮钙黏蛋白，从而起到抑制肿瘤血管生成的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及免疫学技术领域，尤其涉及血管内皮钙黏蛋白抗原表位、抗体及其应用。

背景技术

肿瘤血管是异常增生的血管。与正常血管相比，无论在结构还是功能方面都有很多差异。肿瘤新生血管分布不规则，血管扩张，管壁薄且有较少周细胞覆盖。肿瘤新生血管内皮不连续，有肿瘤细胞嵌入血管内皮形成马赛克结构，尽管异常弯曲的肿瘤血管通透性增加，但是运送氧气和营养物质的效率很低。由于肿瘤微环境的变化，血管内皮和基质细胞过度分泌和表达(或缺失)一些蛋白质分子，这些分子将成为肿瘤新生血管的标志分子。另外，细胞表面的膜受体所诱发的细胞信号通路也将成为重要的新靶标分子。因此，肿瘤血管靶向治疗成为肿瘤治疗的策略之一。

血管内皮钙黏蛋白(vascularendothelialcadherin，VE-cadherin),以下称为CDH5，是血管内皮细胞表面特异性表达的一种跨膜黏附蛋白，介导相邻内皮细胞之间的黏附，在保持血管完整性、调节内皮细胞间通透性、白细胞外渗以及细胞内信号转导中发挥着重要作用。除黏附特性外，CDH5还参与调节各种细胞内进程，如细胞增殖、细胞凋亡以及调节血管内皮生长因子受体的功能。CDH5属于Ⅱ型钙黏蛋白，分子量约为130kDa～140kDa，是由780个氨基酸组成的单链糖蛋白，由胞外区，跨膜区和胞浆区三部分组成。胞外区含110个氨基酸，由5个同源重复结构域和Ca²⁺结合序列组成，可介导钙依赖的细胞与细胞黏附，胞浆区通过胞内介导蛋白与细胞骨架相连。内皮细胞的完整性得以维持归功于细胞表面的粘附功能，如CDH5及其与相关细胞骨架相互作用的能力。这些相互作用的破坏将导致血浆成分渗漏进入周围组织，导致水肿。

抗原表位(epitope)是抗原分子中识别、结合抗体的基础，因此是检测抗体的实际有效组分。研究表明，根据识别的表位，CDH5抗体可能会破坏血管内皮细胞间的相互作用。但是，现有的CDH5抗体由于表位不恰当等原因，在识别肿瘤血管的同时还会识别一部分正常的血管，如此便不能够特异性的与肿瘤血管结合并形成抑制作用。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供血管内皮钙黏蛋白抗原表位、抗体及其应用。本发明提供的表位是中和性表位，能够特异性的识别肿瘤血管并抑制其生成。

血管内皮钙黏蛋白抗原表位，该抗原表位氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

本发明提供的血管内皮钙黏蛋白抗原表位的氨基酸序列为LDREVTPWYNLTVEA，位于CDH5蛋白的N端，具有更高的保守性。虽然，目前抗原表位可以利用生物信息学软件来预测，然而，越来越多的研究表明，软件预测抗原表位的错误概率较高，且软件对抗原表位的预测只针对目的抗原蛋白的全长，真正应用的过程中往往存在着特异性的问题，需要实验证实。而本发明通过试验证实，该表位能够特异性识别肿瘤血管中的血管内皮钙黏蛋白，从而起到抑制肿瘤血管生成的作用。

本发明还提供了编码SEQIDNO:1所示氨基酸序列的DNA分子。

在本发明的实施例中，编码SEQIDNO:1所示氨基酸序列的DNA分子具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，或与SEQIDNO:2具有90％以上同源性，且能够表达SEQIDNO:1所示氨基酸序列。

本发明提供的编码SEQIDNO:1所示氨基酸序列的DNA分子，具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。

SEQIDNO:2所示核苷酸序列的DNA分子能够准确、高效编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种表达质粒，包括如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列和pET41a载体。

pET41a载体是用来克隆和高水平表达蛋白质的载体，载体融合表达一个含有220个氨基酸的GST标签蛋白纯化片段。本发明将SEQIDNO:2所示的核苷酸序列构建入pET41a载体，使本发明提供的表位能够在大肠杆菌中稳定高效的表达，并且经组装该表位能够暴露于融合蛋白表面。

本发明还提供了一种重组表达载体，由本发明提供的表达质粒转化大肠杆菌TOP10制得。

大肠杆菌TOP10适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。将本发明提供的表达质粒转化大肠杆菌TOP10后，经IPTG诱导能够稳定、高效的表达出大量的融合蛋白。

本发明还要求保护本发明提供的重组表达载体表达的融合蛋白。

本发明提供的融合蛋白的制备方法为，将本发明提供的重组表达载体以LB培养基培养，经IPTG诱导获得融合蛋白。

IPTG诱导的浓度为1mmol/L，温度为37℃，时间为4小时。

实验表明，采用本发明提供的方法诱导获得的融合蛋白的浓度为1mg/ml。

本发明提供的融合蛋白能够引起小鼠的免疫反应，产生特异性抗体。

本发明提供了一种单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCNO.C201581的杂交瘤细胞株产生。

本发明提供的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

步骤1：本发明提供的融合蛋白免疫BALB/C小鼠后，取小鼠脾细胞；

步骤2：小鼠脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，经HAT培养，筛选阳性细胞株，经体内诱生或体外培养，制得本发明提供的单克隆抗体。

在本发明的实施例中，步骤1中免疫的时间为3个月。

在本发明的实施例中，HAT培养的时间为7～10天。

在本发明的实施例中，步骤2中融合的融合剂为PEG1500。

在本发明的实施例中，经体内诱生制得本发明提供的单克隆抗体。

在一些实施例中，体内诱生的阳性细胞株细胞个数为2×106个～4×106个。

在本发明的实施例中，体内诱生后经ProteinG亲和层析纯化制得本发明提供的单克隆抗体。

经检测，采用本发明提供的方法制得的单克隆抗体的浓度为0.35mg/ml，效价为1:10000。

本发明还提供了血管内皮钙黏蛋白检测试剂盒，包括蛋白和抗体；

蛋白为SEQIDNO：1所示氨基酸序列的多肽或如权利要求5所述的融合蛋白；

抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201581的杂交瘤细胞株产生。

实验表明，经ELISA检测，本发明提供的抗体能够特异性的识别CDH5蛋白溶液；经流式细胞检测，本发明提供的抗体能够特异性的识别EA.hy926细胞中的CDH5蛋白；经Westernblot检测，本发明提供的抗体能够特异性的识别EA.hy926细胞中的CDH5蛋白；经免疫荧光和免疫组化检测，本发明提供的抗体能够特异性的识别EA.hy926细胞中的CDH5蛋白。

本发明提供的试剂盒能够准确快速的检测血管内皮钙黏蛋白。其中的抗体和蛋白能够彼此识别，呈现很高的结合反应。

作为优选，本发明提供的试剂盒中还包括酶标板。

本发明提供的试剂盒可将蛋白固定于酶标板用于检测血管内皮钙黏蛋白的抗体，也可将抗体包被于酶标板，用于检测血管内皮钙黏蛋白的抗原。

作为优选，本发明提供的试剂盒还包括包被液、封闭液、二抗、显色液、终止液。

本发明经过体外Matrigel血管生成实验证实，本发明提供的单克隆抗体能够抑制类血管样结构的形成。

本发明提供的单克隆抗体在制备抑制肿瘤血管生成的药物中的应用。

本发明还提供了一种抑制肿瘤血管生成的药物，包括本发明提供的的单克隆抗体和药学上可接受的辅料。

在本发明的实施例中，本发明提供的单克隆抗体的在抑制肿瘤血管生成时的浓度为0.5ng/μL。

本发明提供了血管内皮钙黏蛋白抗原表位、抗体及其应用。该抗原表位氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，位于CDH5蛋白的N端，具有更高的保守性。本发明提供的表位是中和性表位，能够特异性的识别肿瘤血管并抑制其生成。本发明通过试验证实，该表位能够特异性识别肿瘤血管中的血管内皮钙黏蛋白，从而起到抑制肿瘤血管生成的作用。

生物保藏说明

杂交瘤细胞株CDH5-2C11,于2015年5月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCCNO.C201581。

附图说明

图1示间接ELISA法检测效价结果；

图2示流式细胞术检测本发明提供单克隆抗体结果；其中，线1示本发明提供的单克隆抗体的流式细胞检测结果；线2示鼠IgG的流式细胞检测结果；

图3示WesternBlot检测本发明提供单克隆抗体结果；

图4示以本发明提供的抗体免疫荧光检测人EA.hy926细胞；

图5-a示以本发明提供的抗体免疫组化检测黑色素细胞瘤病理切片的HE染色，放大倍数为400倍；

图5-b示为以本发明提供的抗体免疫组化检测CDH5在黑色素细胞瘤中的表达情况，放大倍数为400倍；

图6-a示正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以对照小鼠抗体IgG(100ng)处理的效果；

图6-b示正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以实施例3制得的抗体(100ng)处理的效果；

图6-c示正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以实施例3制得的抗体(400ng)处理的效果；

图6-d示人低分化肺腺癌细胞株(GLC-82)以对照小鼠抗体IgG(100ng)处理的效果；

图6-e示人低分化肺腺癌细胞株(GLC-82)以实施例3制得的抗体(100ng)处理的效果；

图6-f示人低分化肺腺癌细胞株(GLC-82)以实施例3制得的抗体(400ng)处理的效果；

图6-g示人低分化肺腺癌细胞株(GLC-82)以对照小鼠抗体IgG(100ng)处理的效果；

图6-h示人低分化肺腺癌细胞株(GLC-82)以市售商品化BV9抗体(100ng)处理的效果；

图6-i示人低分化肺腺癌细胞株(GLC-82)以市售商品化BV9抗体(400ng)处理的效果。

具体实施方式

本发明提供了血管内皮钙黏蛋白抗原表位、抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

一、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从人脐静脉内皮细胞提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

二、通过PCR方法：以RT-PCR产物为模板，按基因序列设计一对引物(CDH5-N-f,CDH5-N-r)，PCR循环获得所需基因片段。

扩增的上游引物，序列如SEQIDNO:3所示，具体为CCGGAATTCTGGATTTGGAACCAGATGCAC；

扩增的下游引物，序列如SEQIDNO:4所示，具体为CCGCTCGAGCAAGATGCTGTACTTGGTCAT。

三、构建pET41a重组表达载体和诱导表达

1、载体酶切：将表达质粒pET41a用限制性内切酶(同引物的酶切位点)EcoRI/XhoI进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收载体大片段。

2、连接转化：PCR产物双酶切(EcoRI/XhoI)后回收，使用T4DNA连接酶将目的片段连接载体,转化TOP10感受态细菌，涂布于带有卡那霉素抗性的LB平板上。37℃培养过夜，次日挑取6个单菌落至2mlLB(含Kana50μg/ml)中37℃过夜培养，用质粒抽提试剂盒抽取质粒，产物双酶切(EcoRI/XhoI)鉴定后送测序公司测序鉴定。测序正确后，以此重组质粒DNA转化表达宿主菌B21的感受态细胞。

3、IPTG诱导表达:挑取含重组质粒的菌体单斑至3mlLB(含Kana50μg/ml)中37℃过夜培养,按1∶100比例稀释过夜菌，一般将2ml菌加入到含200mlLB培养基的1000ml培养瓶中,37℃震荡培养至OD600＝0.6。加入IPTG诱导剂至终浓度1mM，37℃震荡培养4hr。收集细菌，超声裂解破碎菌体。取上清，沉淀作为样品,做SDS-PAGE分析，纯化沉淀后，PBS中透析过夜，收集样品即融合大奶存于-20℃。

经检测，所得融合蛋白的量为1mg/ml。

实施例2

1、制备和筛选：以实施例制得的融合蛋白为抗原免疫6-8周Balb/c小鼠，三个月后处死取脾，分离脾细胞，与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞经由PEG融合后，在1640培养液中预先加入HAT筛选培养7-10天，CDH5重组蛋白包被96孔板，封闭过夜后，ELISA检测细胞上清，筛选阳性克隆株。将阳性克隆株单克隆两次并筛选，已获得稳定表达抗体的细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.C201581。将筛选所得稳定分泌抗体的细胞以2-4×106接种入6-8周Balb/c小鼠腹腔，5-7天后收集腹水。经离心后去除杂质，收集保存于-80℃.

2、纯化：ProteinG亲和层析法纯化腹水。ProteinG亲和层析柱先用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡，然后稀释后的腹水以0.5ml/min的速度过柱。腹水全部上柱后再用5倍柱体积的磷酸钠缓冲液洗涤出去未结合的蛋白质。ProteinG结合的抗体用0.1M的柠檬酸钠洗脱液(pH3.0)洗脱，每0.5ml洗脱液加入至预先放有100μl1MTris-Hcl(pH9.0)中，使抗体溶液的pH在7.0左右。分光光度计测定每管中溶液的OD280值，选取OD280值大于0.2的溶液，合并。转移至透析袋中，在PBS缓冲液中4℃透析，每隔3小时后换新鲜的PBS继续透析。最后测定OD280值，以OD280/1.35计算抗体浓度(mg/ml)。经检测，抗体浓度为0.35mg/ml。

实施例3

间接ELISA法检测效价，方法为：

用0.05M磷酸盐(Na₂CO₃-NaHCO₃)缓冲液(pH9.5±0.2)将重组his-CDH5融合蛋白稀释至5mg/L，每孔100ul加入酶标板中，4℃过夜。次日用洗涤缓冲液PBST洗3遍，每孔加200μl2％BSA-PBS封闭液置37℃封闭2h。经PBST洗板3次后，每孔加入100μl杂交瘤培养上清，37℃放置1h，PBST洗板5次后，每孔加入100μlHRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：10000)，室温孵育1h，PBST洗板5次，每孔加入TMB显色体系溶液100μl，37℃放置10-15min。最后于各反应孔中加入100μl2mol/L硫酸终止反应。在酶标仪上以空白对照孔调零后，于450nm处测各孔吸光度(A)值。正常小鼠IgG作为阴性对照。检测结果如图1所示。

根据图1，本发明提供的抗体的效价为1:10000。

实施例4流式细胞术

制备EA.hy926单细胞悬液，经PBS洗涤离心重悬后分装进流式管，1000r/min，离心5min后弃尽上清。向各管内加入100μl的实施例3制得的抗体(0.35mg/ml)，阴性对照管加入100μl鼠IgG，轻弹管底混匀，室温孵育1h；1000r/min离心5min，PBS洗涤2遍。FITC标记的山羊抗小鼠荧光二抗用1％BSA-PBS稀释，每管加入100μl，避光孵育1h；1000r/min离心5min，PBS洗涤2遍，弃上清，最后加入500μlPBS重悬，待上机检测。检测结果如图2所示。

结果显示：实施例3制得的抗体能与EA.hy926细胞膜上的CDH5结合，在内皮细胞连接处呈鹅卵石样均匀分布。

实施例5免疫印迹

培养人EA.hy926细胞，经细胞裂解液裂解后，每泳道25μg细胞总蛋白上样；经SDS-PAGE后转膜，然后分别与实施例3制得的抗体(0.35mg/ml)及HRP标记的山羊抗小鼠IgG进行孵育，经过充分洗涤后，ECL化学发光显色。结果如图3所示，结果显示在预期位置检测到目的蛋白，大小为130kDa

实施例6免疫荧光

培养人EA.hy926细胞，细胞爬片，固定，封闭；分别加入实施例3制得的抗体(1:500)、正常小鼠IgG(对照)，室温孵育1h；洗涤后，加入FITC标记的山羊抗小鼠二抗(1:500)，室温避光孵育1h，1μg/mlDAPI染细胞核10min，封片后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。结果如图4所示：结果显示，蓝色为DAPI染细胞核，绿色为细胞连接处的CDH5，在细胞连接处可见血管内皮钙粘蛋白的聚集。

实施例7免疫组化

标本为石蜡包埋组织切片。标本切片厚度为5μm，实施例3制得的抗体为第一抗体，然后按SP试剂盒说明书操作，显色后再用苏木素染液衬染，镜检。阳性结果为棕褐色，用正常小鼠血清替代第一抗体作替代对照。结果如图5-a～图5-b。其中，图5-a示黑色素细胞瘤病理切片的HE染色(显示组织结构)，图5-b示为CDH5在黑色素细胞瘤中的表达情况。箭头所指处为血管。结果显示，实施例3制得的抗体能识别人皮肤上的微血管，且在黑色素细胞瘤中高表达。

实施例8体外Matrigel血管生成实验

Matrigel4℃融化至液态后(150uL/孔)加入到48孔板(整个过程在冰上)，37℃孵育30分钟。GLC-82细胞和HUVEC用RPMI1640培养基加10％FBS稀释重悬，实施例3制得的抗体(0.5μg/ml)、市售针对CDH5的商品化抗体BV9，(2μg/ml)或对照小鼠IgG(0.5μg/ml)加入细胞液混匀，其后以每孔3×10⁴个细胞数接种在凝胶上，置5％CO₂/95％空气37℃孵育。6～10h后观察类血管样结构的形成。统计分析：倒置显微镜下计数48孔板视野中心处管样结构的数目。

结果如图6-a～6-i所示，结果显示，本发明提供的单克隆抗体可以特异性识别肿瘤血管并抑制其生成，而部分识别或不识别正常的血管，使得血管不能形成正常的管状结构，同时也会抑制异常血管的过度分支生长。这可能是因为该抗体识别CDH5的抗原表位在正常血管上被掩盖，而在肿瘤血管上这个表位被暴露出来，预示着潜在的临床价值。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。