膜囊泡回收设备、膜囊泡回收方法及膜囊泡分析方法

摘要

本发明的膜囊泡回收设备具备液性的填充物和具有将所述填充物的外周的至少一部分覆盖的脂质双分子层的融合膜，通过膜囊泡与所述融合膜发生融合，将所述膜囊泡的内容物混合在所述填充物中。

说明书

技术领域

本发明涉及与在生物学、生化学、生物工学、医学及医疗领域中的膜 囊泡体的分离及其分析有关的器具及方法。

本申请基于2013年10月25日于日本提出的特愿2013-222751号主张 优先权，将其内容援引于此。

背景技术

一直以来，在细胞、细胞小器官等生物体来源的膜囊泡、人工的膜囊 泡等被脂质双分子层覆盖的结构体中，对该结构体的内容物或者保持在脂 质双分子层上的物质等进行了分析。

近年来，作为细胞间信息传递的方法，利用作为具有脂质双分子层的 囊泡的外泌体的方法倍受关注。

外泌体是已知内部包含蛋白质、mRNA、微小RNA(miRNA)、DNA 等、通过在细胞间移动而能够将信息传递至移动目的地细胞的膜囊泡。例 如，在接受有含有癌细胞来源的小RNA的外泌体的细胞中，已知免疫功能 会活化或者会获得转移能力。

外泌体中除了包含释放出了外泌体的细胞所保持的遗传信息等信号因 子之外，还包含能够控制接受有该外泌体的其他细胞的功能的因子。因此， 认为外泌体能够作为用于诊断疾病的新型生物标记物源来进行有效利用。

例如，专利文献1、3中公开了对外泌体内的miRNA进行分析来对癌 或不良的妊娠结局进行诊断。

专利文献2中公开了为了决定利用siRNA(smallinterferingRNA，小 干涉RNA)或miRNA药物的治疗效率而对各RNA进行测定。

专利文献4中公开了对成为出现心血管系病症的风险指标的蛋白质标 记物进行检测。

专利文献5中公开了对免疫反应性的自身抗体水平进行测定来对癌或 不孕症等与自身抗体产生有关的疾病进行诊断。

专利文献6中公开了通过测定尿中外泌体的水通道蛋白1来检测囊泡 体应激反应和与该反应有关的肾疾病。

外泌体可以通过从能够含有外泌体的试样中利用超离心分离或密度梯 度超离心分离等利用密度差的分离来进行分离、制备。另外，利用专利文 献7或专利文献8所记载的方法也可进行外泌体的分离。另外，市售有对 外泌体进行分离精制的试剂盒(例如SystemBiosciences公司的ExoQuick、 Life、或Technologies公司的TotalExosomeIsolation等)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2013-102768号公报

专利文献2：日本特表2011-524164号公报

专利文献3：日本特表2010-534480号公报

专利文献4：日本特表2013-516619号公报

专利文献5：日本特表2010-517048号公报

专利文献6：日本特开2013-7698号公报

专利文献7：日本特表2003-531864号公报

专利文献8：日本特表2002-535665号公报

发明内容

发明要解决的技术问题

例如当利用离心分离对外泌体进行分离时，不能避免外泌体以外的夹 杂物混入到所分离出的外泌体中，分析精度及重现性的提高有限。

另外，超离心分离或密度梯度超离心分离等用于分离外泌体的操作顺 序复杂且分离精制需要很长时间。

另外，简便分离外泌体的现有的分离试剂盒的外泌体精制不足、分析 的可靠性差。

然而，还已知利用外泌体的脂质双分子层中存在的跨膜四蛋白对外泌 体选择性地进行分离精制。跨膜四蛋白例如是在人体中已知有33种成员的 四次跨膜型膜蛋白质家族。特别是CD9、CD63、CD81作为外泌体标记物 被人们所知晓。但是，使用抗跨膜四蛋白单克隆抗体对外泌体进行分离精 制时，根据成为分离对象的抗原的种类不同，有时在最终分离精制的外泌 体中产生偏差。

另外，为了对外泌体进行分析，有时要破坏外泌体的膜结构，但此时 外泌体的内容物在外泌体的破坏过程中会被稀释。当想要对因破坏稀释状 态的外泌体所获得的产物进行浓缩时，在浓缩过程中会有发生变性或损失 的成分，因此浓缩困难。另外，当以外泌体的蛋白质作为解析对象时，由 于无法在体外对与核酸不同的解析对象的蛋白质进行扩增，因此期待尽量 不稀释地进行外泌体的分析。

本发明鉴于上述事实而作出，其目的在于提供能够在膜囊泡不被破坏、 膜囊泡的构成要素难以被稀释的情况下选择性地回收膜囊泡的膜囊泡回收 设备及膜囊泡回收方法以及简便且精度及重现性优异的膜囊泡分析方法。

用于解决技术问题的方法

本发明第一方式的膜囊泡回收设备具备液性的填充物和具有将所述填 充物的外周的至少一部分覆盖的脂质双分子层的融合膜，通过膜囊泡与所 述融合膜发生融合，将所述膜囊泡的内容物混合在所述填充物中。

上述第一方式的膜囊泡回收设备可以进一步具备具有形成有能够保持 所述填充物的多个保持部的表面的反应基体，所述填充物在多个所述保持 部的各个中被所述融合膜覆盖。

上述第一方式中，所述保持部可以是形成于所述反应基体中的凹部， 所述融合膜按照在所述凹部中与形成所述表面与所述凹部的边界的开口端 接触、并将所述凹部堵塞的方式设置在所述反应基体上，所述填充物填充 在所述凹部内。

上述第一方式中，所述融合膜可以按照与所述凹部的内壁面中沿着所 述开口端的部分结合、并将所述多个凹部各个分别堵塞的方式在所述反应 基体上设置多个。

上述第一方式中，所述反应基体可以至少所述内壁面是疏水性的，所 述融合膜的疏水部与所述内壁面结合。

上述第一方式中，所述融合膜可以形成为沿着所述表面的面状，且形 成为将所述多个凹部堵塞的一个连续的膜状。

上述第一方式中，所述融合膜可以含有促进作为生物体来源或人工的 囊泡并被脂质双分子层覆盖的膜囊泡与所述融合膜的膜融合的膜电荷调整 物质。

上述第一方式中，所述膜电荷调整物质可以含有膜破坏性肽、膜融合 性聚合物、pH敏感性聚合物及病毒来源的膜融合蛋白质中的至少1个。

上述第一方式中，所述填充物可以含有溶剂和所述溶剂中含有的生化 学分析用反应试剂。

上述第一方式中，所述生化学分析用反应试剂可以含有pH指示剂。

上述第一方式中，所述填充物可以是凝胶或溶胶。

上述第一方式的膜囊泡回收设备可以进一步具备具有形成有多个亲水 部和包围所述亲水部的疏水部的表面的反应基体，所述填充物设置在所述 亲水部中，所述融合膜在所述亲水部与所述疏水部的边界处与所述疏水部 结合并将所述填充物包裹。

本发明第二方式的膜囊泡回收方法是将作为生物体来源或人工的囊泡 并被脂质双分子层覆盖的膜囊泡回收至上述第一方式的膜囊泡回收设备中 的膜囊泡回收方法，其中，使含有所述膜囊泡的试样与所述融合膜接触， 使所述融合膜与所述膜囊泡膜发生融合。

上述第二方式中，可以将使所述试样为酸性的pH调节剂添加在所述试 样中之后使酸性的所述试样与所述融合膜接触。

本发明第三方式的膜囊泡分析方法是对作为生物体来源或人工的囊泡 并被脂质双分子层覆盖的膜囊泡的内容物、膜蛋白质或膜脂质进行分析的 膜囊泡分析方法，其中，使所述膜囊泡与上述第一方式的膜囊泡回收设备 的所述融合膜发生融合，在所述融合膜中保持所述膜囊泡上的所述膜蛋白 质或所述膜脂质。

本发明第四方式的膜囊泡分析方法是对作为生物体来源或人工的囊泡 并被脂质双分子层覆盖的膜囊泡的内容物、膜蛋白质或膜脂质进行分析的 膜囊泡分析方法，其中，使所述膜囊泡与上述第一方式的膜囊泡回收设备 的所述融合膜发生融合，在所述填充物内使所述膜囊泡的内容物、膜蛋白 质或膜脂质与所述生化学分析用反应试剂发生反应。

在使用了上述第一方式的膜囊泡回收设备的膜囊泡分析方法或上述第 四方式的膜囊泡分析方法中，所述生化学分析用反应试剂可以含有核酸分 析试剂、侵入反应试剂、蛋白质分析试剂、脂质分析试剂、免疫分析试剂 及均质抗原抗体反应用试剂中的至少1个。

发明效果

根据本发明的上述各方式，可以提供能够在膜囊泡的构成要素难以被 稀释的情况下选择性地回收膜囊泡的膜囊泡回收设备及膜囊泡回收方法、 以及简便且精度及重现性优异的膜囊泡分析方法。

附图说明

图1是表示本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的立体图。

图2是图1中符号X所示部分的放大图。

图3A是图2的A-A线处的示意截面图。

图3B是表示本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的另一构成例的截 面图。

图4是用于说明本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的制造工序的 图。

图5是用于说明本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的制造工序的 图。

图6是用于说明本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的制造工序的 图。

图7是用于说明本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的制造工序的 图。

图8是用于说明本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的制造工序的 图。

图9是用于说明本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的制造工序的 图。

图10是用于说明本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的制造工序的 图。

图11是用于说明本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的制造工序的 图。

图12是用于说明本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的制造工序的 图。

图13是表示本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的另一构成例的示 意图。

图14A是表示本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的又一构成例的 示意图。

图14B是表示本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的又一构成例的 示意图。

图15是用于说明使用了本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的膜囊 泡回收方法的图。

图16是用于说明使用了本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的膜囊 泡回收方法的图。

图17是用于说明使用了本发明第1实施方式的膜囊泡回收设备的膜囊 泡回收方法的图。

图18是表示本发明第2实施方式的膜囊泡回收设备的示意截面图、是 与图2的B-B线同样的线处的截面图。

图19是图18的示意性放大图。

图20是表示本发明第3实施方式的膜囊泡回收设备的示意性放大截面 图。

图21是表示本发明第4实施方式的膜囊泡回收设备的示意性放大截面 图。

图22是表示本发明第5实施方式的膜囊泡回收设备的示意性放大截面 图。

图23是表示本发明第5实施方式的膜囊泡回收设备的示意性放大截面 图。

图24是表示测定本发明膜囊泡回收设备的反应后的孔的荧光量的结果 的图。

具体实施方式

(第1实施方式)

对本发明第1实施方式进行说明。图1是表示本实施方式的膜囊泡回 收设备的立体图。图2是图1中用符号X所示部分的放大图。图3为图2 的A-A线处的示意截面图。

如图1～图3B所示，本实施方式的膜囊泡回收设备1具备反应基体2、 融合膜5和填充物8。

反应基体2是在表面3上形成有多个凹部4的板状构件。反应基体2 中，凹部4的开口端4b与表面3为疏水性的。本实施方式中，反应基体2 为玻璃或硅制。成为凹部4的微细孔是反应基体2的表面通过二硅氮烷处 理而进行了疏水性处理之后制作在反应基体2的表面上的。本实施方式中， 凹部4的内壁面4a为亲水性的。

融合膜5是将凹部4堵塞的脂质双分子层。即，融合膜5具有位于临 近反应基体2的位置上的第一层6和层叠于第一层6上的第二层7。第一层 6和第二层7分别具有亲水部6a、7a和疏水部6b、7b。融合膜5在凹部4 处与形成反应基体2的表面3与凹部4的边界的开口端4b接触。本实施方 式的融合膜5与凹部4的内壁面4a中沿着凹部4的开口端4b的部分结合。 另外，本实施方式中，按照将多个凹部4的各自分别地堵塞的方式，将多 个融合膜5相对于反应基体2的各个凹部4进行设置。

凹部4中，融合膜5的疏水部、凹部4的开口端4b及疏水性的表面3 相结合。

填充物8是填充在凹部4中的液体。另外，填充物8还可以是凝胶或 溶胶。填充物8优选具有对于回收对象的膜囊泡难以发生变性或分解的组 成。另外，填充物8还可含有用于将在回收对象的膜囊泡中成为分析障碍 的物质进行分解或惰化的物质。另外，本实施方式中，在融合膜5的与面 对填充物8的面相反的面上存在水系的溶剂(未图示)。

接着，对本实施方式的膜囊泡回收设备1的制造方法进行说明。图4～ 图12是用于说明膜囊泡回收设备1的制造工序的图。

首先，对反应基体2进行成型。反应基体2如图4所示，通过在由板 状的玻璃或板状的树脂构件构成的母材9上将具有能够收纳外泌体11等膜 囊泡的大小的凹部4配置成阵列状而成型。凹部4的阵列通过向使用了成 型模具的母材9的转印或者母材9的切削等而形成在母材9上。

凹部4还可以是具有例如1μm的直径、1μm的深度的形状。

另外，当母材9由亲水性的材料形成时，在成型凹部4之后对母材9 的外表面进行疏水化处理。疏水化处理例如是对母材9的外表面的二硅氮 烷处理等表面改性。

接着，如图4及图5所示，将填充物8填充在形成于反应基体2的凹 部4内。填充物8也可以是使融合膜5结合于凹部4的后述工序中的水槽 100内的液体。

接着，使堵塞凹部4的融合膜5结合于各凹部4。融合膜5由将花生四 烯酸或硬脂酸等两亲性分子溶解在有机溶剂中、展开在图6所示水槽100 的水面上、利用势垒将分子压缩所获得的二维固体膜10(参照图7)形成。 该二维固体膜10是构成脂质双分子层的第一层6及第二层7的单分子膜。 在水面上形成有二维固体膜10的状态下，亲水部10a接触于水面，疏水部 10b露出到外部空气中。

为了使融合膜5结合于反应基体2，首先如图7所示，在水槽100内保 持反应基体2，在水面上形成上述二维固体膜10。接着，如图8所示，在 将水面上的二维固体膜10保持于固体状态的情况下，将水槽100中的反应 基体2从水槽100中提起。此时，按照反应基体2中形成有凹部4的表面3 变得垂直的方式将反应基体2提起，从而二维固体膜10按照将反应基体2 的表面3的凹部4覆盖的方式附着在反应基体2的表面3上。此时，如图9 所示，附着于反应基体2的二维固体膜10变成融合膜5的第一层6。

二维固体膜10在覆盖凹部4地附着在反应基体2的表面3上之后，再 次如图10所示，将反应基体2插入到水槽100中。此时，水面上存在上述 的二维固体膜10。

如图11所示，通过将反应基体2插入到水槽100中，形成于水面的二 维固体膜10的疏水部10b与第一层6的疏水部6b接触，融合膜5的第二 层7按照在反应基体2的表面3上将凹部4覆盖的方式形成。

融合膜5的第一层6及第二层7形成于反应基体2的表面3上之后， 如图12所示，将二维固体膜10从水面上除去，之后将膜囊泡回收设备1 从水槽100中提起。此时，在反应基体2的表面3中并非凹部4的部分上， 由于融合膜5的第一层6的亲水部6a对进行了疏水性处理的表面3的结合 力弱，因此融合膜5的第一层6自表面3脱离。如此，凹部4的开口端4b 附近的部分与融合膜5的疏水部6b结合(参照图3A)。因而，多个凹部4 被融合膜5各自分别地堵塞。另外，还有变成融合膜5的疏水部7b结合于 表面3(参照图3B)的状态的情况。此时，多个凹部4也被堵塞。

本实施方式的反应基体2所具有的凹部4也可以并非是垂直方向。例 如，如图13所示，还可以相对于反应基体2的面方向、凹部4形成于水平 方向上。

即，反应基体2可以具有形成有凹部4的中间层2A和将中间层2A夹 在中间的一对外层2B，在形成于中间层2A的凹部4中形成有融合膜5。 此时，作为设置在反应基体2上的脂质双分子层的形成方法，除了上述方 法之外，还可以利用日本特开2009-128206号公报所记载的方法等。

另外，本实施方式的反应基体2也可没有凹部4。例如，还可代替凹部 4，例如如图14A或图14B所示，在平面上具有亲水部4A和疏水部4B。 此时，亲水部4A作为上述的凹部4发挥功能。即，亲水性的亲水部4A中 留有填充物8、按照将填充物8包裹的方式设置融合膜5，融合膜5在亲水 部4A与疏水部4B的边界附近处与疏水部4B结合。

这种构成的器具例如可通过日本特开2009-128206号公报所记载的方 法、在设置于平面上的液滴表面上形成脂质双分子层来制造。具体地说， 在将填充物8流入图14A及图14B所示的外层2B之间后，流入带有脂质 溶液的有机溶剂，最后流入不含溶解物的缓冲液。由此，可以形成由覆盖 填充物8外表面的脂质双分子层所形成的融合膜5。此时，融合膜5根据反 应基体2的疏水部4B的疏水度、溶质的种类而取图14A或图14B所示的 任一种形状。

接着，对使用了本实施方式的膜囊泡回收设备1的膜囊泡回收方法进 行说明。

图15～图17为用于说明使用了膜囊泡回收设备1的膜囊泡回收方法的 图。

本实施方式的膜囊泡回收方法是将作为生物体来源或人工的囊泡且被 脂质双分子层覆盖的膜囊泡回收至本实施方式的膜囊泡回收设备1的膜囊 泡回收方法。

本实施方式中，作为膜囊泡的回收的例子，示出回收外泌体11的例子。

首先，制备能够含有外泌体11的试样。能够含有外泌体11的试样例 如可以是体液、培养细胞的培养上清。另外，还可以使人工制备的含脂质 体的溶液为试样。

接着，如图15及图16所示，使试样接触于融合膜5，使融合膜5与外 泌体11发生膜融合。

凹部4配置为阵列状的反应基体2中，堵塞各凹部4的由脂质双分子 层所形成的融合膜5结合在各凹部4的内壁面4a(参照图3A及图3B)上。 因此，当外泌体11等膜囊泡接近融合膜5时，经过膜融合，外泌体11等 膜囊泡的内容物移动至凹部4的内部(参照图17)。膜囊泡的内容物在向凹 部4的内部移动的过程中，在外泌体11的内部与凹部4的内部相连通的状 态下，外泌体11的内部与外界被脂质双分子层隔开。因此，外泌体11的 内容物不会向外界扩散，在外泌体11的融合之后，凹部4变成收纳外泌体 11的内容物、被脂质双分子层堵塞而封住的容器。

利用脂质双分子层进行的膜融合是脂质双分子层的自发性性质，阻断 其的是构成膜的磷脂的磷酸基的负电荷所产生的排斥力(回弹力)。为了外 泌体11等膜囊泡频率良好地融合于融合膜5，只要是使外泌体11膜上的负 电荷与融合膜5的负电荷一致即可。但是，由于外泌体11上的负电荷依赖 于外泌体11的膜蛋白质，因而根据外泌体11调整融合膜5的负电荷会变 得繁杂。

为了使膜囊泡高频率地融合于融合膜5，重要的是缩短膜囊泡与融合膜 5之间的物理距离。当含有外泌体11的溶液的体积少时，外泌体11与融合 膜5的物理距离缩小、外泌体11接触于融合膜5的频率高。另外，含有外 泌体11的溶液中的外泌体11浓度高时，外泌体11接触于融合膜5的频率 也高。另外，如果仅提高外泌体11的浓度，则多个外泌体11被回收至1 个凹部4的可能性也提高。

通过在将使试样变为酸性的pH调节剂添加在试样中之后使变为酸性 的试样接触于融合膜5，也可提高膜融合效率。

接着，对使用了本实施方式的膜囊泡回收设备1的膜囊泡分析方法进 行说明。

本实施方式的膜囊泡回收设备1能够将外泌体11等膜囊泡捕获到凹部 4内、并对作为外泌体11构成要素的分子进行分析。

本实施方式中，通过使外泌体11等膜囊泡融合于膜囊泡回收设备1的 融合膜5，将外泌体11的内容物保持在填充物8内，将外泌体11的膜蛋白 质或膜脂质保持在融合膜5上。

因此，在各凹部4中能够进行对外泌体11的构成要素的分析。例如， 作为对保持于融合膜5上的跨膜蛋白质等的分析，可以举出免疫分析。作 为具体的分析方法的例子，可举出已知多在外泌体11中表达的CD9、CD63 及CD81的定量。CD9、CD63及CD81通过外泌体11与融合膜5发生融 合而被保持在融合膜5上，使用抗CD9抗体、抗CD63抗体及抗CD81抗 体可分别进行定量。

如此，根据本实施方式的膜囊泡分析方法，在凹部4中能够对膜囊泡 来源的生物分子进行检测、定量。由此，能够对膜囊泡所含的构成要素进 行简便且精度及重现性高的分析。

(第2实施方式)

对本发明的第2实施方式进行说明。图18是表示本实施方式的膜囊泡 回收设备的示意性截面图，是与图2的B-B线同样线处的截面图。图19 是图18的示意性放大图。

如图18及图19所示，本实施方式的膜囊泡回收设备1A代替第1实施 方式中说明过的反应基体2而具备与反应基体2的材质不同的反应基体 2A。

本实施方式中，反应基体2A的表面3A为亲水性的。例如，本实施方 式的反应基体2A由亲水性的材料形成。另外，当反应基体2A的母材由疏 水性的材料形成时，成型了凹部4之后对母材的外表面进行亲水化处理。 亲水化处理例如是对母材外表面的等离子体处理等表面改性。

本实施方式中，优选融合膜5的亲水部结合于反应基体2A的表面3A。 因此，融合膜5形成为沿着反应基体2A的表面3A的面状、形成为将多个 凹部4堵塞的一个连续的膜状。

即便是这种构成，也起到与上述第1实施方式相同的效果。

(第3实施方式)

对本发明的第3实施方式进行说明。图20为表示本实施方式的膜囊泡 回收设备的示意性放大截面图。

图20所示的本实施方式的膜囊泡回收设备1B的融合膜5含有促进膜 囊泡与融合膜5的融合的膜电荷调整物质12。

膜电荷调整物质12含有膜破坏性肽、膜融合性聚合物、pH敏感性聚 合物及病毒来源的膜融合蛋白质中的至少1个。

在本实施方式的膜囊泡回收设备1B中，当按照接触于融合膜5的方式 添加含有外泌体的溶液时，组装到融合膜5中的膜电荷调整物质12对融合 膜5的膜电荷进行调整以促进对膜囊泡的膜融合。

本实施方式中，与上述第1、2实施方式相比，外泌体等膜囊泡的回收 效率更高。

(第4实施方式)

对本发明的第4实施方式进行说明。图21为表示本实施方式的膜囊泡 回收设备的示意性放大截面图。

图21所示的本实施方式的膜囊泡回收设备1C的填充物8含有溶剂13 和溶剂13中含有的生化学分析用反应试剂14。生化学分析用反应试剂14 含有核酸分析试剂、侵入反应试剂、蛋白质分析试剂、脂质分析试剂、免 疫分析试剂及均质抗原抗体反应用试剂中的至少1个。

另外，本实施方式中，还可以以生化学分析用反应试剂14溶解于作为 溶剂13的水系缓冲液的状态形成填充物8，也可加工成凝胶或溶胶来形成 填充物8。当填充物8为凝胶或溶胶时，在膜囊泡回收设备1C的制造时在 将反应基体2放入到水槽100(参照图7)内时，生化学分析用反应试剂14 难以扩散到水槽100内。

接着，对使用本实施方式的膜囊泡回收设备1C的膜囊泡分析方法进行 说明。

本实施方式的膜囊泡分析方法是在凹部4内对作为生物体来源或人工 的囊泡并被脂质双分子层覆盖的膜囊泡的内容物或膜蛋白质或膜脂质进行 分析的方法。

本实施方式中，与上述第1实施方式中说明过的一样，使外泌体等膜 囊泡融合于融合膜5。

本实施方式中，由于在预先填满凹部4内的填充物8中存在与分析对 象物反应的酶、底物等生化学分析用反应试剂14，因此，能够在凹部4内 引起对应于生化学分析用反应试剂14种类的反应。

例如为微小RNA等其他核酸检测时，将寡聚肽、聚合酶及检测用荧光 试剂放入到凹部4内即可。或者为蛋白质的检测时，将在经荧光标记的抗 体的三明治反应中发生FRET(荧光共振能量转移)那样的均质系免疫分析 试剂放入到凹部4内即可。

本实施方式中，由于能够在外界的夹杂物不进入凹部4内的状态下对 凹部4内的物质进行分析，因此用于去除夹杂物的洗涤是不需要的。因而， 能够排除因洗涤导致分析对象物发生变性或损失的可能性，因此与在外泌 体11的分离精制及分析的过程中需要洗涤的方法相比，分析的精度及重现 性优异。

进而，通过将分析所需要的试剂预先含有在凹部4内，可以迅速地实 施对进入到凹部4内的分析对象物的生化学反应。因此，可以简便地进行 对实验体系中失去活性快的物质等的分析。

进而，根据本实施方式的膜囊泡回收设备1C、膜囊泡回收方法及膜囊 泡分析方法，由于凹部4内含有生化学分析用反应试剂14，因此可以在膜 囊泡的分离之后接着简便且迅速地进行对外泌体等膜囊泡的构成要素的分 析。

另外，通过一起进行融合膜5上的跨膜四蛋白的检测和凹部4内的生 化学分析，在反应基体2上的多个凹部4中区分出进入有外泌体的凹部4 和外泌体没有进入的凹部4，可以获得仅以进入有外泌体的凹部4作为对象 的生化学分析结果。

另外，通过对各凹部4中的跨膜四蛋白进行定量，还可以推测相对于1 个凹部4进入了几个外泌体。

(变形例)

接着，参照图21说明上述实施方式的变形例。

本变形例中，图21所示的生化学分析用反应试剂14除了上述试剂之 外还含有pH指示剂。本变形例中，可以使用pH指示剂来区分反应基体2 上的多个凹部4中进入有外泌体11的凹部4和外泌体11没有进入的凹部4。

另外，如果使用按照凹部4的容积及pH指示剂的量在各凹部4中达到 恒定的方式构成的膜囊泡回收设备1，则还可以使用pH指示剂来推测相对 于1个凹部4进入了几个外泌体11。

(第5实施方式)

对本发明的第5实施方式进行说明。图22为本发明的第5实施方式的 膜囊泡回收设备1D的截面图。本实施方式的膜囊泡体回收设备由具有凹部 4的基材(反应基体)2C和平滑的基材(反应基体)2D构成。另外，本实 施方式的膜囊泡体回收设备具备设置在2个基材之间的流路15。流路15 能够将液体送至凹部4。通过流路15将填充物8填充在凹部4中，将含有 脂质溶液的有机溶剂送至凹部4。之后，进一步将水系的溶剂17送至凹部 4中。由此，如图23所示，可以使覆盖填充物8、堵塞凹部4的融合膜5 结合于各凹部4。该水系的溶剂17如图14A、14B所记载的缓冲液16那样， 只要融合膜5的亲水部具有面向水系溶剂的构成，则溶剂的种类没有特别 问题。例如可举出血清、血液等样品，试剂、缓冲液等水溶液。另外，水 系的溶剂也可含有膜囊泡体。

本实施方式的膜囊泡体回收设备中，凹部也可以由树脂或玻璃等形成， 还可由与基材相同的材料形成。另外，凹部也可通过树脂成型加工等与基 材一体化。作为树脂，可以选自环烯烃聚合物、硅、聚丙烯、聚碳酸酯、 聚苯乙烯、聚乙烯、聚醋酸乙烯酯等，但并非限定于这些。基材只要由具 有刚性的材料形成即可，也可由树脂或玻璃等形成。在通过透过观察微小 孔时，基材最好是透明的。另外，也可利用光刻法形成疏水部，作为树脂 可选择CYTOP(旭硝子公司制)等疏水性高的材料。

接着，根据以下所示的实施例对本实施方式的膜囊泡回收设备、膜囊 泡回收方法及膜囊泡分析方法进行更详细的说明。

实施例1

(1)被脂质双分子层涂覆的侵入反应试剂填充多孔平板的制作

制作通过压印将直径为1μm、深度为1μm的微细孔(孔，凹部)配置 为阵列状的PDMS制的平板，利用等离子体发生装置进行等离子体处理， 仅对孔部进行亲水化处理。平板是1边为1cm、厚度为5mm、将9×10⁶的 孔配置在中央。为了在孔中填充侵入反应试剂(1μM等位基因探针、0.4μM 侵入寡聚物、1μMFAM标记ARM、20μMMOPSpH7.5、15mMNaC1、 6.25mMMgC1₂、50U/μLCleavase)，在平板上滴加试剂溶液5μL，用盖玻 片覆盖，在减压下将试剂溶液注入到孔内部之后，将盖玻片剥离进行风干。

将0.0013g的酞菁氧钛溶解在含有0.1mol/L三氯醋酸的二氯甲烷10mL 中，制备LB膜用试样溶液。将该试样溶液滴加在水面上，形成单分子膜， 使用市售的LB膜制作装置制作LB膜。将孔中填充有侵入反应试剂的平板 预先沉在水槽中，通过提起将单分子膜从平板表面上移取，再次沉在水槽 中制作双分子层。

(2)用脂质体封入的寡核苷酸的反应

作为外泌体的模型，利用脂质体试剂(LifeTechnologies公司、 Lipofectamine)封入成为底物的寡核苷酸之后，进行阶段稀释，获得试样 溶液。之后，将试样溶液滴加到上述(1)的侵入反应试剂填充孔平板上， 放上盖玻片并轻轻按压，在62℃的烘箱中孵育15分钟。利用荧光显微镜 (Zeiss公司、AX10)、物镜(ECPlan-Neofluar40×oi1NA1.3)、光源(LEJ 社、FluoArc001.26AUsablewithHBO10)、传感器(HamamatsuPhotonics 公司、EM-CCDC9100)、滤波片(奥林巴斯公司、U-MNIBA2)、解析软件 (HamamatsuPhotonics公司、AQUACOSMOS2.6：曝光时间64.3ms、EM 增益180、补偿0、像素组合(Binning)×1)对反应后的孔测定荧光量(选 择5孔，求得21个像素的荧光量的平均值)，同时测量发出荧光的孔数。 结果确认了，对应于脂质体量，发出一定量荧光的孔数增加。

实施例2

(1)具有脂质双分子层的膜囊泡体回收设备的制作

在0.5mm厚的玻璃基材上旋涂CYTOP(旭硝子公司制)，在180℃下 使其热固化3小时，使用光刻技术制作具有100万个直径为5μm的微小孔 (孔，凹部)的微小孔芯片。按照与微小孔芯片的空隙达到100μm的方式， 将带有送液口的玻璃基材设置在微小孔芯片的上部。由此，制作设置在2 个基材之间的流路。流路能够将液体送至微小孔中。由样品口将侵入反应 试剂(1μM等位基因探针、0.4μM侵入寡聚物、1μMFAM标记ARM、20μM MOPSpH7.5、15mMNaC1、6.25mMMgC1₂、50U/μLCleavase)送至凹部 中，进行脱气，从而将反应试剂填充在微细的凹部中。将按照达到4mg/ml 的方式溶解有DOPE和DOPG的混合脂质的十六烷40μL送至凹部中。将 40μL的缓冲液(20μMMOPSpH7.5、15mMNaCl、6.25mMMgCl₂)送至 凹部中。

(2)用脂质体封入的寡核苷酸的反应

作为外泌体的模型，利用脂质体试剂(LifeTechnologies公司、 Lipofectamine)封入成为底物的寡核苷酸，获得试样溶液。之后，将试样 溶液送至填充有上述侵入反应试剂的孔中，进一步输送油，从而将试样溶 液液滴化。之后，在62℃的烘箱中孵育15分钟。利用荧光显微镜对反应后 的孔测定荧光量。将测定结果示于图23中。

以上，参照附图详述了本发明的实施方式及实施例，但具体的构成并 非限定于该实施方式，也包含不脱离本发明主旨的范围内的设计变更等。

例如，在上述实施方式3、4及5中，也可如上述第1实施方式中说明 过的那样，融合膜5的疏水部7b结合于反应基体2的表面3。

另外，上述各实施方式中所示出的事项还可以适当地组合来构成。

产业上的可利用性

本发明可以用于外泌体的分离、细胞小器官的分离等其他膜囊泡的分 离。

另外，本发明可以用于膜囊泡的构成要素的分析。

符号说明

1，1A，1B，1C，1D膜囊泡回收设备

2反应基体

3表面

4凹部

5融合膜

6第一层

6a亲水部

6b疏水部

7第二层

7a亲水部

7b疏水部

8填充物

9母材

10二维固体膜

10a亲水部

10b疏水部

11外泌体

12膜电荷调整物质

13溶剂

14生化学分析用反应试剂