PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法

摘要

本发明涉及动物模型技术领域，具体地说，是一种PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法。本发明建立了一种成年条件PHF14基因敲除的基因背景下的肾损伤后纤维化模型，为研究PHF14基因在纤维化疾病中的作用提供必备条件；与现有制作PHF14敲除的模型相比，本发明的PHF14条件敲除不会造成胚胎致死性，在成年期tamoxifen诱导敲除PHF14经验证不会造成致死后果，与未敲除组相比，敲除组肺，肝，肾无显著病变，这保证了后续急性肾损伤模型制作不受系统性疾病状态的干扰，可以单独研究该基因缺陷在肾纤维化发病机制中的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型技术领域，具体地说，是一种PHF14基因敲除合并 急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法。

背景技术

急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI)的临床特征表现为肾功能在数天内 的急剧下降。其主要病因是肾缺血再灌注损伤，脓毒症、肾毒性药物打击及肾 后梗阻。AKI镜下病理通常表现为肾小管上皮细胞坏死脱落，肾小管腔内管型 形成，间质炎细胞浸润。动物实验和前瞻性临床研究均发现，经历AKI打击 的肾脏即使短期肾功能可以恢复，今后进展到慢性肾脏病(chronickidney diseaseCKD)的风险也大于未发生过AKI者。由AKI进展到以肾小管间质纤维 化为病理特征的CKD具体机制尚不明确，可能与AKI发生后局部修复性过程 的慢性失衡及其与对抗性因子复杂的相互作用有关。这类修复性进程主要包括 细胞周期在损伤后的阻滞，缺氧诱导因子的分泌，和TGF-beta信号通路的激 活等。2012年Kitagawa等研究人员发现一种以血小板源性生长因子受体alpha (PDGFR-alpha)依赖性的方式调节细胞间质分泌的蛋白PHF14 (NM_014660.3)，并制作了PHF14基因非条件敲除小鼠模型。动物模型证明 PHF14非条件敲除具有致死性，小鼠只能在出生后存活不到24小时。死因为 严重的肺纤维化造成的呼吸衰竭。尸检提示肝和肾都有明显的纤维化。体外实 验证明PHF14可负向调节PDGFR-alpha的表达，从而抑制成纤维细胞的细胞 外基质分泌。(KitagawaM,TakebeA,OnoY,etal.Phf14,anovelregulatorof mesenchymegrowthviaplatelet-derivedgrowthfactor(PDGF)receptor-alpha.The Journalofbiologicalchemistry.Aug102012；287(33):27983-27996.)由此说明 PHF14基因在胚胎发育阶段各器官细胞外基质形成平衡中起重要调节作用。但 是关于PHF14基因在成年阶段与纤维化相关性疾病的关系目前还未阐明。为 了研究该基因在成年期在肾小管间质纤维化的发病过程中所起的作用，需要一 种在PHF14基因敲除背景下急性肾损伤及损伤后纤维化的动物模型的建立方 法，该方法目前也未见报道。

发明内容

现有的制作PHF14基因敲除小鼠的方法皆为非条件性敲除，由于该基因 敲除具有致死性，所以无法利用非条件敲除的小鼠模型研究该基因与成年期肾 纤维化的关系。而在现有的广泛使用的肾纤维化疾病动物模型中虽可观察 PHF14基因的表达变化，却无法探究其在疾病发病机制中的作用。故欲研究该 基因在成年期在肾小管间质纤维化的发病过程中所起的作用，需要建立一种在 成年期条件敲除PHF14基因的动物模型，在此遗传背景下进行急性肾损伤及 损伤后纤维化的研究。根据实验需要，叶酸刺激性肾病模型能够模拟临床急性 肾损伤病程，刺激后肾纤维化发生比例较高，并且能够连续监测肾功能。

本发明的目的在于建立一种在成年PHF14敲除遗传背景下完全模拟临床 病程的急性肾损伤且损伤后肾纤维化动物模型的方法。

根据现有研究成果可知胚胎期全身敲除PHF14会造成各主要器官的明显 纤维化，而在胚胎期器官形成以后的成年期敲除该基因是否有相同效果尚不可 知。本发明证明了在器官形成以后敲除PHF14无明显病理表型，证明该基因 在胚胎期的功能结论不可直接推至成年动物。然而成年期动物的肾脏遭到损伤 性打击后，启动和激活了一系列修复相关基因，其中包括PHF14。在此种情形 下PHF14基因功能无法表达会导致肾纤维化加剧。

本发明的第一方面，提供一种PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后 肾纤维化动物模型的建立方法，包括以下步骤：

A、phf14lox+/+小鼠与tamoxifen诱导Cre表达小鼠(Cre-ER^TM)杂交，子一 代筛选phf14lox+/-；Cre+小鼠；

B、将步骤A得到的phf14lox+/-；Cre+小鼠进行自交，子二代中筛选出 phf14lox+/+；Cre+小鼠；

C、将步骤C得到的phf14lox+/+；Cre+小鼠饲养至8-12周，接受连续5 天tamoxifen腹腔注射给药，剂量3mg/40g体重，溶媒玉米油(sigma)，tamoxifen 在玉米油中的终浓度为7.5mg/mL；

D、第6天给予叶酸溶液腹腔注射，剂量250mg/kg体重，即得所述的急 性肾损伤及损伤后小管间质纤维化动物模型。

所述的步骤D中叶酸溶液为叶酸溶于0.3mol/LNaHCO₃中，使叶酸终浓度 为10g/L。叶酸由大连美仑公司提供。采用NaHCO₃作溶剂是因为叶酸是难溶 于水的，其他溶剂无法溶解。采用的注射剂量过小无法诱导出来急性肾损伤， 剂量过大容易致死。

所述的phf14loxp+/+小鼠的制备方法可参照：HuangQ,ZhangL,WangY, etal.DepletionofPHF14,anovelhistone-bindingproteingene,causesneonatal lethalityinmiceduetorespiratoryfailure.ActabiochimicaetbiophysicaSinica. Aug2013；45(8):622-633.

所述的tamoxifen诱导Cre表达小鼠(Cre-ER^TM)由美国JAX实验室提供 (B6.Cg-Tg(Cre/Esr1)5Amc/Jmice(stock004682))。

所述的筛选phf14lox+/-；Cre+小鼠和phf14lox+/+；Cre+小鼠的方法： PHF14基因与Cre基因分别鉴定，PHF14鉴定所用引物：

PHF14-loxpFa3’-ctattttcttgattatagatgcag-5’(SEQIDNO.1)；

PHF14-loxpRa3’-gccttctaagttccagctactag-5’(SEQIDNO.2)；

PCR程序95度1min，40*(95度30s，58度30s，72度1min)，72度 5min，结果判定：wt/wt＝356bp，wt/flox＝356bp+457bp，flox/flox＝457bp。

Cre鉴定所用引物：

CreF3‘-attgctgtcacttggtcgtggc-5’(SEQIDNO.3)；

CreR3‘-ggaaaatgcttctgtccgtttgc-5’(SEQIDNO.4)；

PCR程序94度5min，35*(94度20s，55度30s，72度30s)，72度5min， 结果判定：wt阴性。Cre+＝200bp。

本发明的第二个方面，提供采用上述方法建立的PHF14基因敲除合并急 性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型。

本发明的第三个方面，提供上述PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤 后肾纤维化动物模型的建立方法，和上述方法建立的PHF14基因敲除合并急 性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型，在制备或筛选急性肾损伤或损伤后肾纤 维化的药物中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种筛选急性肾损伤或损伤后肾纤维化药物的 方法，包括以下步骤：首先采用上述的方法建立PHF14基因敲除合并急性肾 损伤及损伤后肾纤维化动物模型，然后利用制备得到的动物模型筛选对于急性 肾损伤或损伤后肾纤维化具有治疗效果的药物。

本发明优点在于：

1、本发明建立了一种成年条件PHF14基因敲除的基因背景下的肾损伤后 纤维化模型，为研究PHF14基因在纤维化疾病中的作用提供必备条件；

2、与现有制作PHF14敲除的模型相比(如Kitagawa)，本发明的PHF14 条件敲除不会造成胚胎致死性，在成年期tamoxifen诱导敲除PHF14经验证不 会造成致死后果，与未敲除组相比，敲除组肺，肝，肾无显著病变(图9、图 10和图11)，这保证了后续急性肾损伤模型制作不受系统性疾病状态的干扰， 可以单独研究该基因缺陷在肾纤维化发病机制中的作用。

3、在PHF14基因缺陷的遗传背景下，选择叶酸性肾病作为肾损伤造模刺 激原因是该模型能模拟临床急性肾损伤及损伤后纤维化病程，并且能在不同时 间点监测肾功能；与此相对，常用的采用单侧输尿管结扎模型则无法监测肾功 能变化，也就无法在肾功能水平上验证模型制作情况和该基因对肾功能的影 响。

附图说明

图1.叶酸刺激后不同时间小鼠血肌酐FA0d叶酸刺激0天；FA2d叶酸 刺激2天；FA14d叶酸刺激14天；FA28d叶酸刺激28天*与FA0d比较p< 0.05。

图2.叶酸刺激后不同时间小鼠血尿素氮FA0d叶酸刺激0天；FA2d叶 酸刺激2天；FA14d叶酸刺激14天；FA28d叶酸刺激28天*与FA0d比较p <0.05。

图3.叶酸刺激小鼠0,2,14,28天肾脏PHF14表达变化。

图4.tamoxifen诱导PHF14敲除后，肾脏PHF14表达下调。

图5.PHF14未敲除小鼠与PHF14敲除小鼠在给予叶酸(FA)后不同时间 点的collagen1，alpha-SMA，TGF-beta表达情况。

图6不给予叶酸组小鼠肾(A)及给予叶酸2(B)，14(C)，28(D)天 肾脏Masson染色。

图7.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组小鼠(B)肾脏masson病理， 可见两组肾脏都没有明显病理变化。

图8.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)肝天狼星红染色，可见 纤维化程度无差异。

图9.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)肺masson染色，可见 纤维化程度无差异。

图10.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)给予叶酸(FA)后28 天时肾masson染色。

图11.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)给予叶酸(FA)后28 天时肾collagen1免疫组化。

图12.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)给予叶酸(FA)后28 天时肾alpha-SMA免疫组化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、材料与方法

1.AKI动物模型的制备及分组：IVC级成年C57BL/6野生型小鼠8～12周 龄，体重20-35g，由美国JAX实验室提供，饲养于第二军医大学实验动物中 心。按随机数字表法将20只动物分为4组(甲-丁)，每组5只。乙-丁组所有 动物给予叶酸(溶于0.3mol/LNaHCO₃中，使叶酸终浓度为10g/L)腹腔注射， 剂量250mg/kg体重，叶酸由大连美仑公司提供。甲组动物给予0.3mol/L NaHCO₃腹腔注射，剂量25mL/kg体重。甲-丁组分别于腹腔给药后0,2,14和 28天时取血，处死小鼠，留取肾脏组织。

2.PHF14成年特异性诱导敲除模型小鼠制作：PHF14loxp+/+小鼠由中科 院上海生化所陈正军教授赠送，制作方法已经另行发表。(HuangQ,ZhangL, WangY,etal.DepletionofPHF14,anovelhistone-bindingproteingene,causes neonatallethalityinmiceduetorespiratoryfailure.Actabiochimicaetbiophysica Sinica.Aug2013；45(8):622-633.)tamoxifen诱导Cre表达小鼠(Cre-ER^TM)由美国 JAX实验室提供(B6.Cg-Tg(Cre/Esr1)5Amc/Jmice(stock004682)),phf14lox+/+ 小鼠与Cre-ER^TM杂交，子一代筛选phf14lox+/-；Cre+小鼠自交，子二代中筛选 出phf14lox+/+；Cre+小鼠，饲养至8-12周，取8只作为实验组，另取同月龄 phf14lox+/+；Cre-8只作为对照组。实验组与对照组均接受连续5天tamoxifen 腹腔注射给药，剂量3mg/40g体重，溶媒玉米油(sigma)，tamoxifen在玉米油 中的终浓度为7.5mg/mL。第六天两组均给予叶酸腹腔注射，剂量250mg/kg体 重。之后所有动物正常饲养，第33天时取血，处死小鼠，并留取肾脏，肝脏 和肺组织。

3.血肌酐及血尿素氮检测：眼眶取血法取血1mL于EDTA促凝管中，静 置过夜后4000r/min室温离心10min，取血清至无菌Eppendorf管中，-80摄氏 度冻存。全自动生化分析仪测定血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)。

4.免疫印迹检测PHF14,alpha-SMA,collagen1,TGF-beta的表达情况：用 组织裂解液(0.1％SDS,0.5％脱氧胆酸钠，150mmol/LNaCl，50mmol/LTris-HCl pH＝8.0,0.5％钒酸钠1％NP-40，1mmol/LNaF，蛋白酶抑制剂)裂解组织后4 摄氏度离心取上清，BCA法测定蛋白浓度。取20μg蛋白，8％SDS-PAGE电 泳，半干法转至PVDF膜。一抗为anti-PHF14(abcam1：1000)，GAPDH(Santa Cruz1：500)，alpha-SMA(abcam1:1000)，collagen1(SAB1:400)，ECL反 应，X线胶片曝光，全自动凝胶成像系统进行分析。

5.组织病理学检查：组织4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，肾脏行 Masson染色，alpha-SMA，collagen1免疫组织化学染色，肺行Masson染色， 肝行天狼星红染色，显微镜下观察。

二、结果

1.各组小鼠血肌酐及尿素氮检测：如表1，叶酸注射后第二天发生急性肾 损伤，在14天进入慢性纤维化期时血肌酐及尿素氮仍较基线有轻度升高，28 天肌酐及尿素氮则已经进一步恢复。不同时间点血肌酐(图1)及尿素氮(图 2)符合急性肾损伤病程，急性肾损伤及慢性纤维化期模型制作成功。

表1叶酸刺激不同时间小鼠肾功能

SCr(μmol/L) p BUN(mg/dL) P 叶酸刺激0天 21.40±0.92 11.76±0.28 叶酸刺激2天 55.58±14.66 0.048 38.19±10.49 0.035 叶酸刺激14天 41.46±4.2 0.001 23.00±2.2 <0.001 叶酸刺激28天 28.04±1.55 0.006 15.78±1.1 0.047

每组n＝5。

2.各组小鼠肾PHF14表达情况：Western印迹结果显示，和腹腔注射溶媒 组相比，叶酸刺激的小鼠从第2天即有显著上调，并且在后续纤维化形成过程 中持续高表达(图3)，提示PHF14的表达与纤维化相关信号转导通路激活相 关。

3.PHF14基因敲除鼠在叶酸刺激后14,28天TGF-beta,collagen1及 alpha-SMA表达情况：基因诱导敲除后，PHF14表达下调(图4)。Western印 迹结果显示，在腹腔注射叶酸后2，14和28天时，相较未敲除组，PHF14基 因敲除鼠的TGF-beta,collagen1及alpha-SMA表达上调(图5)。

4.各组小鼠肾组织病理学变化及免疫组化结果：可见甲组小鼠肾脏病理表 现基本正常，而乙组小鼠纤维化尚不明显，以急性间质性肾炎表现为主，小管 上皮细胞水肿，炎细胞浸润。丙、丁组叶酸给药后14-28天则呈不断进展的肾 间质纤维化，呈多灶状纤维化，伴淋巴细胞和单核细胞浸润，肾小管上皮细胞 萎缩、变性，肾小管管腔扩大(图6)。

5.PHF14敲除小鼠肝、肺和肾组织病理学变化：肾masson染色显示PHF14 敲除组与非敲除组都没有明显病理变化(图7)，肝天狼星红染色显示PHF14 敲除组与非敲除组都没有明显病理变化(图8)，肺masson染色显示PHF14敲 除组与非敲除组也都没有明显病理变化(图9)。综上，病理切片显示在成年期 tamoxifen诱导敲除PHF14经验证不会造成致死后果，与未敲除组相比，敲除 组肺，肝，肾无显著病变。

6.PHF14敲除小鼠肾组织病理学变化：PHF14非敲除组小鼠和敲除组小鼠 在叶酸刺激14天及28天时肾脏masson染色显示PHF14敲除组纤维化更重(图 10)，collagen1(图11)及alpha-SMA表达上调(图12)，这与westernblot 结果符合。

三、讨论

AKI后的肾小管间质纤维化是慢性肾衰竭的病理基础。探究肾脏遭受AKI 打击后肾小管间质纤维化的机制对CKD的防治有重要意义。本研究发现肾脏 PHF14基因在叶酸造成的AKI模型中发生上调，在慢性纤维化期持续高表达， 并且与纤维化的进展有时间依赖关系。这提示了PHF14与纤维化表型的相关 性。PHF14成年期诱导敲除的小鼠在遭到AKI打击后的28天时表现出较遭到 同样打击的野生型小鼠更为严重的肾纤维化。以上结果提示PHF14基因受促 纤维化刺激而上调，但其作用是抑制纤维化进程，成年期PHF14基因敲除会 造成AKI后纤维化加剧。之前在胚胎期动物关于PHF14基因作用的研究发现 其在胚胎形成阶段各器官间质组织形成中起负向调节作用，并且证明其机制是 PHF14蛋白结合于血小板源性生长因子受体alpha(PDGFR-alpha)转录起始位 点抑制其转录。进而抑制由PDGF信号通路所介导的间质形成。因此，PHF14 基因敲除的小鼠胚胎各器官PDGFR-alpha表达过度，PDGF信号通路过度激活， 间质形成过多。在病理水平上表现为纤维化。出生后由于肺纤维化通气功能不 足，小鼠因呼吸衰竭死亡。但前人的工作未阐明成年期该基因在肾脏遭到促纤 维化打击时是否发挥作用，本发明肯定了这一点。

在AKI模型的选择上，我们采用了叶酸刺激性肾损伤。这是肾毒性因素 造成急性肾损伤的常用模型，叶酸刺激后肾功能变化完全模拟临床AKI病程， 并且造模后纤维化发生比例较高，混杂因素少，动物个体间及造模批次间重复 性较好，并且可以重复监测肾功能。在本发明的动物模型中我们验证了PHF14 对抗纤维化的作用。然而在肾缺血模型及肾后梗阻模型中PHF14的作用仍然 值得探讨。

多年以来，已经有大量的研究致力于阐明肾纤维化的机制，尽管该过程涉 及多种细胞系和细胞因子的参与，目前普遍认为TGF-beta信号通路在成年期 肾纤维化中起核心作用，是纤维化的始动和维持因子。成纤维细胞能接受 TGF-beta刺激而活化为肌成纤维细胞，后者是肾纤维化中细胞外基质的主要来 源。多种AKI模型中均发现TGF-beta能够破坏小管上皮细胞的完整性并促进 上皮-间质转化。TGF-beta对局部的炎症和免疫反应也有复杂的调节作用并能 加剧毛细血管的萎缩消失。鉴于在我们的研究中发现PHF14的表达与肾纤维 化进程有相关性，并且可以负向调节细胞外基质的产生。合理的推测是 TGF-beta通过其信号转导通路激活了PHF14的表达，表达增多的PHF14蛋白 抑制PDGFR-alpha的转录进而减少成纤维细胞的活化和细胞外基质的分泌。从 宏观上看则减轻肾小管间质纤维化的程度。这样的环状机制则为防止TGF-beta 过度促纤维化的自限性机制。该自限机制缺乏或下调均会促进成年期肾脏在遭 到AKI打击后加速进展到纤维化。目前已知在胚胎期PHF14通过抑制 PDGFR-alpha的转录起到抑制纤维化表型的作用，在成年期其作用方式是否相 同需要进一步研究验证。如果TGF-beta在纤维化进程中通过PHF14形成自限 的机制得到阐明，则该自限信号通路上的靶点有潜力成为新的抗纤维化治疗的 作用位点。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限 于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可 做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要 求所限定的范围内。