转基因牡丹愈伤组织的GUS基因组织化学染色方法

摘要

本发明公开一种转基因牡丹愈伤组织的GUS基因组织化学染色方法，将转基因牡丹愈伤组织从培养基中取出，用蒸馏水洗去残留菌体，放入离心管中，加入Buffer？A至没过愈伤组织，置于24℃环境中，侵泡1？h，用移液枪将Buffer？A吸出，加入Buffer？B至没过愈伤组织，置于24℃黑暗环境中染色过夜或数小时，至愈伤组织出现蓝色。本发明将原GUS基因组织化学染色方法中的37℃优化为24℃。将试验筛选得到的增殖生长良好的愈伤组织进行GUS组织化学染色的检测，试验结果成功检测到GUS活性的表达，愈伤组织碎块呈蓝色，表明新生的愈伤组织中存在GUS活性位点。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术应用领域，涉及转基因牡丹愈伤组织的GUS基因组织化学染色温度方法。

背景技术

GUS(β-葡萄糖苷酸酶)基因是转基因植物使用较多的一种报告基因，具有检测快速简洁高效的特点。GUS组织化学法染色原理为：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件(一般为37℃)下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

在对转基因牡丹愈伤组织进行GUS组织化学染色检测时，参照Jefferson的方法，试验中发现牡丹愈伤组织在37℃环境下染色后，全部褐化死亡，无GUS瞬时表达活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：针对牡丹愈伤组织在进行GUS组织化学染色时，37℃环境下，全部褐化死亡，无GUS瞬时表达活性。因此根据牡丹愈伤对温度较为敏感的特性，需要对染色温度进行调整。

本发明的技术方案是：一种转基因牡丹愈伤组织的GUS基因组织化学染色方法：

将转基因牡丹愈伤组织从培养基中取出，用蒸馏水洗去残留菌体，放入离心管中，加入BufferA至没过愈伤组织，置于24℃环境中，侵泡1h，用移液枪将BufferA吸出，加入BufferB至没过愈伤组织，置于24℃黑暗环境中染色过夜或数小时，至愈伤组织出现蓝色；

BufferA成分如下：

其中0.2MNaPO₄buffer溶液由0.2MNa₂HPO₄和0.2MNaH₂PO₄混合配制而成，每100ml的0.2MNaPO₄buffer溶液由62ml0.2MNa₂HPO₄和38ml0.2MNaH₂PO₄混合而成，BufferA置于4℃保存；

BufferB由BufferA和X-gluc混合配制而成，X-gluc的浓度为1mg/ml，BufferB置于-20℃，避光保存。

0.2MNa₂HPO₄配制方法：将7.16gNa₂HPO₄溶于水，定容至100ml；0.2MNaH₂PO₄的配制方法：将3.12gNaH₂PO₄溶于水，定容至100ml。

本发明的有益效果是：试验GUS基因组织化学染色方法参照Jefferson的方法，在37℃环境中进行染色。但试验表明，37℃不是牡丹愈伤染色的适宜温度。在染色过程中发现，牡丹愈伤组织经37℃过夜后，均褐化死亡，且无GUS活性表达。由于牡丹愈伤组织对温度较为敏感，因此将染色方法做以优化改进，在24℃即愈伤正常生长的环境中进行染色，经过染色处理，愈伤仍保持很好的活力，且可明显看到转化位点有靛蓝色物质沉积。根据本试验的结果，将原GUS基因组织化学染色方法中的37℃优化为24℃。

将试验筛选得到的增殖生长良好的愈伤组织进行GUS组织化学染色的检测，试验结果成功检测到GUS活性的表达，愈伤组织碎块呈蓝色，表明新生的愈伤组织中存在GUS活性位点，初步表明通过该遗传转化体系，成功将GUS基因转入牡丹愈伤组织中，且GUS活性能够稳定良好表达。

具体实施方式

一种转基因牡丹愈伤组织的GUS基因组织化学染色方法：

将转基因牡丹愈伤组织从培养基中取出，用蒸馏水洗去残留菌体，放入离心管中，加入BufferA至没过愈伤组织，置于24℃环境中，侵泡1h，用移液枪将BufferA吸出，加入BufferB至没过愈伤组织，置于24℃黑暗环境中染色过夜或数小时，至愈伤组织出现蓝色；

BufferA成分如下：

其中0.2MNaPO₄buffer溶液由0.2MNa₂HPO₄和0.2MNaH₂PO₄混合配制而成，每100ml的0.2MNaPO₄buffer溶液由62ml0.2MNa₂HPO₄和38ml0.2MNaH₂PO₄混合而成，BufferA置于4℃保存；

BufferB由BufferA和X-gluc混合配制而成，X-gluc的浓度为1mg/ml，BufferB置于-20℃，避光保存。

0.2MNa₂HPO₄配制方法：将7.16gNa₂HPO₄溶于水，定容至100ml；0.2MNaH₂PO₄的配制方法：将3.12gNaH₂PO₄溶于水，定容至100ml。