一种利用气相二氧化硅从人血浆中提取载脂蛋白A-1的方法

摘要

本发明公开了一种利用气相二氧化硅从人血浆中提取载脂蛋白A-1的方法，具体步骤为：（1）在血浆中加入气相二氧化硅并混合均匀，混合物常温静置5-100分钟；（2）将得到的混合物离心处理收集固体沉淀物备用；（3）将得到的固体沉淀物用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液进行洗涤，洗涤后离心处理收集固体沉淀物备用；（4）将得到的固体沉淀物用apoA1洗脱液进行洗涤，洗涤后离心处理得到的液体即为载脂蛋白A-1溶液。本发明通过简单快速的分离过程得到人血浆中的apoA1成分，分离过程仅使用离心机即可完成，因此是一种快速且具有选择性的固液分离方法。相较于硅藻土对apoA1的吸附，所添加的气相二氧化硅成份单一，对目的产物吸附的选择性较好，产物更加可控。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质提取技术领域，具体涉及一种利用气相二氧化硅从人血浆中提 取载脂蛋白A-1的方法。

背景技术

载脂蛋白A1（apoA1）在血浆中含量介于1.06-1.21g/L之间。ApoA1与人体胆固醇代 谢密切相关，人血浆中的apoA1含量越高，罹患心脑血管疾病的风险越低。

目前制药工业中从人血浆制备蛋白质的主要方法为cohn法，又称为冷乙醇沉淀 法，在传统cohn法中载脂蛋白A-1主要被硅藻土吸附而难以回收利用。现有从人血浆中制备 载脂蛋白A1的方法主要有高速密度梯度离心法和液相色谱层析法。Cohn法不能够有效回收 利用载脂蛋白A1，高速密度梯度离心法依赖大型昂贵设备，液相色谱法工序复杂，处理时间 较长。

由于apoA1相对于血浆中其他蛋白质拥有较高的疏水性，其表现出较高的离液性， 在血浆中添加有大比表面积的固体吸附剂的情况下，更倾向于被吸附沉淀。硅藻土是血液 制品工业中用来澄清血浆的常用固体吸附剂，硅藻土主要成分为二氧化硅，但是硅藻土作 为一种矿物质，含有较多的杂质，比表面积相对较小。澄清血浆后的硅藻土滤饼中含有前白 蛋白等较多杂质成分。气相二氧化硅拥有极大的比表面积，吸附能力较强，被用做药物或疫 苗缓释载体，也被用作增稠剂或触变剂。但是目前尚未有相关文献报道将其用于蛋白质的 纯化过程。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种利用气相二氧化硅从人血浆中提取载脂蛋 白A-1的方法，该方法基于气相二氧化硅是一种大比表面积吸附剂的原理，在特定条件下加 入到血浆中吸附沉淀其中的apoA1，通过对沉淀复合物的洗涤解吸附得到较高纯度的apoA1 蛋白。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用气相二氧化硅从人血浆 中提取载脂蛋白A-1的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）在血浆中加入气相二氧化硅并混合均匀，其中1mL血浆对应气相二氧化硅的质量为 2~35mg，混合物常温静置5-100分钟；

（2）将步骤（1）得到的混合物置于离心机中在2000~14000g的条件下离心处理10分钟， 收集固体沉淀物备用；

（3）将步骤（2）得到的固体沉淀物用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液进行洗涤，洗涤 后置于离心机中在与步骤（2）相同的条件下离心处理10分钟，收集固体沉淀物备用；

（4）将步骤（3）得到的固体沉淀物用apoA1洗脱液进行洗涤，其中apoA1洗脱液为Tris- HCl摩尔浓度50mmol/L、乙醇体积浓度10%-40%和pH=7.4的混合溶液，洗涤后置于离心机中 在与步骤（2）相同的条件下离心处理10分钟，离心得到的液体即为载脂蛋白A-1溶液。

进一步限定，步骤（1）中1mL血浆对应气相二氧化硅的质量为5~20mg。

进一步限定，步骤（1）中室温静置时间为40~80分钟。

进一步限定，步骤（2）中的离心处理条件为12000g。

进一步限定，步骤（4）中apoA1洗脱液为Tris-HCl摩尔浓度50mmol/L、乙醇体积浓 度20%和pH=7.4的混合溶液。

本发明通过简单快速的分离过程得到人血浆中的apoA1成分，分离过程仅使用离 心机即可完成，因此是一种快速且具有选择性的固液分离方法。相比于常用的柱层析或硫 酸铵沉淀技术，该方法设备依赖少，操作简单。相较于硅藻土对apoA1的吸附，所添加的气相 二氧化硅成份单一，对目的产物吸附的选择性较好，产物更加可控。

附图说明

图1是本发明实施例1中气相二氧化硅添加比例对apoA1的吸附效果SDS-PAGE检测 图；

图2是本发明实施例2中气相二氧化硅吸附时间对apoA1吸附效果的SDS-PAGE检测图；

图3是本发明实施例4中乙醇体积浓度对apoA1从气相二氧化硅上洗脱效果的影响图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本 发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发 明的范围。

实施例1

（1）取1mL血浆分别放入8个1.5mL的离心管中，然后在不同的离心管中分别加入2mg、 5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg和35mg气相二氧化硅，并混合均匀，混合物常温放置80分 钟；

（2）将步骤（1）得到的混合物置于离心机中在12000g的条件下离心处理10分钟，收集固 体沉淀物备用；

（3）将步骤（2）得到的固体沉淀物用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液进行洗涤，洗涤 后置于离心机中在12000g的条件下离心处理10分钟，收集固体沉淀物备用；

（4）将步骤（3）得到的固体沉淀物用apoA1洗脱液进行洗涤，其中apoA1洗脱液为Tris- HCl摩尔浓度50mmol/L、乙醇体积浓度20%和pH=7.4的混合溶液，洗涤后置于离心机中在 12000g的条件下离心处理10分钟，离心得到的液体即为载脂蛋白A-1溶液。

SDS-PAGE检测从气相二氧化硅中洗脱的apoA1的纯度（图1）。其中电泳泳道顺序为 1、蛋白质分子量标准；2、人血浆；3、气相二氧化硅2mgapoA1洗脱液；4、气相二氧化硅5mg apoA1洗脱液；5、气相二氧化硅10mgapoA1洗脱液；6、气相二氧化硅15mgapoA1洗脱液；7、 气相二氧化硅20mgapoA1洗脱液；8、气相二氧化硅25mgapoA1洗脱液；9、气相二氧化硅 30mg；10、气相二氧化硅35mgapoA1洗脱液。

实施例2

（1）取1mL血浆分别放入7个1.5mL的离心管中，然后在不同的离心管中分别加入10mg气 相二氧化硅，并混合均匀，混合物常温分别放置5、10、20、30、40、50、60、80、100分钟；

（2）将步骤（1）得到的混合物置于离心机中在12000g的条件下离心处理10分钟，收集固 体沉淀物备用；

（3）将步骤（2）得到的固体沉淀物用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液进行洗涤，洗涤 后置于离心机中在12000g的条件下离心处理10分钟，收集固体沉淀物备用；

（4）将步骤（3）得到的固体沉淀物用apoA1洗脱液进行洗涤，其中apoA1洗脱液为Tris- HCl摩尔浓度50mmol/L、乙醇体积浓度20%和pH=7.4的混合溶液，洗涤后置于离心机中在 12000g的条件下离心处理10分钟，离心得到的液体即为载脂蛋白A-1溶液。

SDS-PAGE检测从气相二氧化硅中洗脱的apoA1的纯度（图2）。其中电泳泳道1、蛋白 质分子量标准；2、气相二氧化硅吸附100分钟apoA1洗脱结果；3、气相二氧化硅吸附80分钟 apoA1洗脱结果；4、气相二氧化硅吸附60分钟apoA1洗脱结果；5、气相二氧化硅吸附50分钟 apoA1洗脱结果；6、气相二氧化硅吸附40分钟apoA1洗脱结果；7、气相二氧化硅吸附30分钟 apoA1洗脱结果；8、气相二氧化硅吸附20分钟apoA1洗脱结果；9、气相二氧化硅吸附10分钟 apoA1洗脱结果；10、气相二氧化硅吸附5分钟apoA1洗脱结果。

实施例3

（1）取1mL血浆分别放入5个1.5mL的离心管中，然后在不同的离心管中分别加入10mg气 相二氧化硅，并混合均匀，混合物常温放置60分钟；

（2）将步骤（1）得到的混合物置于离心机中分别在14000g、12000、10000、8000、6000的 条件下离心处理10分钟，收集固体沉淀物备用；

（3）将步骤（2）得到的固体沉淀物用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液进行洗涤，洗涤 后置于离心机中在与步骤（2）相同的条件下离心处理10分钟，收集固体沉淀物备用；

（4）将步骤（3）得到的固体沉淀物用apoA1洗脱液进行洗涤，其中apoA1洗脱液为Tris- HCl摩尔浓度50mmol/L、乙醇体积浓度20%和pH=7.4的混合溶液，洗涤后置于离心机中在于 步骤（2）相同的条件下离心处理10分钟，离心得到的液体即为载脂蛋白A-1溶液。

使用分光光度计，在600nm波长下测量被气相二氧化硅吸附后血浆的浊度，以此检 测上清中固体气相二氧化硅的沉积程度（见表1）。

实施例4

（1）在取1mL血浆分别放入5个1.5mL离心管中，然后在不同的离心管中分别加入10mg气 相二氧化硅，并混合均匀，混合物常温放置60分钟；

（2）将上述五份混合物置于离心机中在12000g的条件下离心处理10分钟，使固液得到 分离；

（3）对离心分离得到的固体沉淀物用1mL的摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液进行洗 涤，洗涤后置于离心机中在12000g的条件下离心处理10分钟，收集固体沉淀物；

（4）步骤（3）得到的各固体沉淀分别使用下表所列溶液进行洗涤，加入体积为1mL。洗涤 后置于离心机中在12000g的条件下离心处理10分钟，apoA1存在于离心所得的上清之中，通 过SDS-PAGE电泳对上清中apoA1进行检测，电泳泳道顺序与图3中序号对应。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该 了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入 本发明保护的范围内。