检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法

摘要

本发明提供检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法，检测样品中是否存在五加科植物成分的方法包括：从待检样品中提取总DNA；以所提取的总DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；所述引物对包括SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2；对上述PCR扩增产物进行分析判断以鉴别所述检测样品中是否存在五加科植物成分。本发明SEQ？ID？NO:1和2为根据真核生物r？DNA上的ITS2顺反子序列设计，相较于ITS2的通用序列，其能特异性地使五加科植物的ITS？2片段序列进行扩增，而不能扩增其它科属的植物药材，可以检测样品中是否存在五加科植物成分，尤其是人参、三七和/或西洋参成分。

说明书

技术领域

本发明涉及检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法，尤其涉及检 测待检三七样品中是否掺伪的方法。

背景技术

五加科植物为双子叶植物，可供药用的五加科植物包括人参、三七、西洋参等， 目前对于五加科植物的鉴别主要采用传统形态学方法，依赖鉴别人员经验，主观性高， 因此需要一种能够准确、有效的鉴别方法。

在含五加科植物成分的混合物例如药材、或者以五加科植物入药的中药制剂等的 生产加工过程中，部分DNA通常能够保留于其中，因此，混合物中的五加科植物成 分可以从其携带的DNA检测中获得鉴定。

然而，在混合物特别是药材、中药制剂中五加科植物成分鉴定的研究技术上，由 于混合物中五加科植物DNA含量很低，并且含有多种抑制PCR反应的成分，此外， 含五加科植物的混合物特别是中药制剂中通常还具有较多的其它动植物物种，因此， 如何设计五加科植物特异性引物也成为鉴定技术的关键。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种检测样品中是否存在五加科植物成分的方法，所 述方法具有特异性强、速度快、准确性高等优点。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定待检三七样品是否掺伪的方法，该方法具有 特异性强、速度快、准确性高等优点。

本发明的再一目的在于提供实现本发明所述检测样品中是否存在五加科植物成 分的方法或鉴定待检三七样品中是否掺伪的方法的引物对。

本发明的再一目的在于提供所述引物对的应用。

本发明的再一目的在于提供包含所述引物对的试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供一种检测样品中是否存在五加科植物成分的方法， 该方法包括：

从待检样品中提取总DNA；

以所提取的总DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；所述引物对包括SEQID NO:1和SEQIDNO:2；

SEQIDNO：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；

SEQIDNO：2：CGCACGACATGAGAAGAGG；

对上述PCR扩增产物进行分析判断以鉴别所述检测样品中是否存在五加科植物 成分。

优选地，在本发明检测样品中是否存在五加科植物成分的方法中，所述对上述 PCR扩增产物进行分析判断包括用凝胶电泳显示所述扩增产物，并包括对照与从相 应的五加科植物对照品中提取的DNA进行PCR扩增的结果。

本发明所述“相应的五加科植物对照品”取决于待检五加科植物的种类，例如当 本发明用于检测样品中是否存在三七成分时，“相应的五加科植物对照品”即为三七 对照品。优选地，在本发明检测样品中是否存在五加科植物成分的方法中，所述五加 科植物选自三七、人参和/或西洋参。

本发明SEQIDNO:1和2为根据真核生物rDNA上的ITS2顺反子序列设计，相较 于ITS2的通用序列，其能特异性地使五加科植物的ITS2片段序列进行扩增，尤其是 特异性地使人参、三七、西洋参的ITS2片段序列进行扩增，而不能扩增其它科属的植 物药材，因此，可以检测样品中是否存在五加科植物成分，尤其是人参、三七和/或 西洋参成分。

三七属于五加科植物，其具有止血、活血化瘀、消肿定痛、滋补强壮、抗疲劳、 耐缺氧、抗衰老、降血脂、降血糖、提高机体免疫功能等作用，近来受到追捧，尤其 是三七细粉、三七最细粉或三七极细粉，价格居高不下，不法商贩为谋求利益通常会 在三七细粉中掺入植物源性中药材/饮片粉末，例如五加科植物的粉末，以减低成本， 按现有的鉴别方法，掺入植物源性中药材/饮片粉末的三七细粉很难被鉴别出来，一 方面主要是因为药材粉末被破碎成最细粉或极细粉后就没有了细胞结构，检测人员很 难通过亚细胞结果的观察来辨别中药材的来源和种属。另一方面，在化学成分检测中， 《中国药典》的要求是主要成分人参皂苷Rb₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁以及三七皂 苷R₁检出(定性，薄层色谱)或规定人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁以及三七皂苷R₁的总 量不得少于5.0％(定量，高效液相色谱)，但是对于和三七药材同属的非药用植物或 价格较低廉的同属药材，也可能含有较高量的待测化学成分，但并无三七药材所具有 的药用功效，或者不法分子可以人为掺入一些规定的检定成分，类似于牛奶中掺入三 聚氰胺的原理，以干扰检验检测结果，从而达到降低成本的目的。例如，较人参等五 加科植物，三七的检测仅多了一项三七特有的三七皂苷R₁的检测，但不同大小和生长 年份的三七，其三七皂苷R₁含量相差较明显，因此，即使掺入人参后，通过化学成分 检测也很难发现。

尽管可将待测三七制剂的PCR扩增结果与从三七中提取DNA进行PCR扩增的结 果进行对照，以确定待检三七制剂是否掺伪，但应用PCR扩增方法具有如下缺陷：

①所用时间较长，一般的药材基因组提取到PCR完成大概学要1天的时间，再送 去测序一般需要48小时，再进行分析，一个检测过程大概需要3～4天；

②用于药材粉末很多情况下是真品和伪品的混合物，若采用通用引物进行检测， 所得的PCR产物也是两种或多种植物的混合DNA产物，测序时会出现大量杂峰堆积在 一起无法分析的现象。

本发明在利用所述引物对特异性扩增三七、人参、西洋参ITS2序列的基础上，还 可开发出一种鉴定待检三七样品是否掺伪的方法，具体而言，本发明还可提供一种鉴 定待检三七样品是否掺伪的方法，所述方法包括如下步骤：

从待检三七样品中提取总DNA；

以所提取的总DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；所述引物对包括SEQID NO:1和SEQIDNO:2；

SEQIDNO：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；

SEQIDNO：2：CGCACGACATGAGAAGAGG；

测试上述扩增结果的高分辨熔解曲线(HRM)并进行分析判断待检三七样品是 否掺伪。

如上所述，本发明SEQIDNO:1和2为根据真核生物rDNA上的ITS2顺反子序列 设计，相较于ITS2的通用序列，其能特异性地使五加科植物的ITS2片段序列进行扩 增，尤其是特异性地使人参、三七、西洋参的ITS2片段序列进行扩增，而不能扩增其 它科属的植物药材，因此，可以检测样品中是否存在五加科植物成分，尤其是人参、 三七和/或西洋参成分。但如果仅仅利用PCR结果的凝胶电泳难以快速将人参、三七 和西洋参区分开来的，这主要是因为人参、三七和西洋参均属于五加科植物，采用SEQ IDNO:1和2对三种药材进行PCR反应，所得PCR产物片断大小相同，仅仅有个别碱基 存在差异，人参、三七、西洋参PCR扩增产物分别如下所示：

人参(Panaxginseng)

CGCATCGCGTCGCCCCCCAACCCATCACTCCCTTGCGGGAGTTGAGGCGGA GGGGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCGGTTGGCCCAAATGCGAGTC CTTGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCATGT CGTGCGGTGACCCGTCGCCAGCAAAAGCTCTCATGACCCTGTTGCGCCGTCCTC GACGTGCGCTCCGACCG；

三七(Panaxnotoginseng)

CGCATCGCGTCGCCCCCCAACCCATCATTCCCTCGCGGGAGTCGATGCGGA GGGGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCGGTTGGCCCAAATGCGAGTC CTTGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTTAAAAGCCCTCTTCTCATGT CGTGCGGTGACCCGTCGCCAGCAAAAGCTCTCATGACCCTGTTGCGCTGTCCTC GACGCGCGCTCCGACCG；

西洋参(Panaxquinquefolium)

CGCATCGCGTCGCCCCCCAACCCATCACTCCTTTGCGGGAGTCGAGGCGG AGGGGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCGGTTGGCCCAAATGCGAG TCCTTGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCAT GTCGTGCGGTGACCCGTCGCCAGCAAAAGCTCTCATGACCCTGTTGCGCCGTC CTCGACGTGCGCTCCGACCG；

因此，仅仅利用PCR结果的凝胶电泳对SEQIDNO:1和2扩增后的PCR产物进行分 析是难以快速将人参、三七或西洋参鉴别出来。如果样品是粉末，现有技术手段更是 无能为力，这主要是因为现有的粉末一般无细胞结构，无法采用显微技术；而对于化 学成分检测，由于三七的检测较人参、西洋参仅多了一项三七特有的三七皂苷R₁的检 测，但不同大小和生长年份的三七，其三七皂苷R₁含量相差较明显，因此，即使掺入 人参、西洋参后，通过化学成分检测也很难发现。本发明发现高分辨率熔融曲线 (HRM)可以有效区分如上所述的仅有个别碱基差异的三七、人参、西洋参的PCR 产物，从而能有效鉴定待检三七样品是否掺伪。

优选地，在本发明所述鉴定待检三七样品是否掺伪的方法中，用于掺伪的伪品为 人参和/或西洋参，更优选地，所述伪品为人参。人参、西洋参与三七为同属植物， 本发明采用SEQIDNO:1和2引物对所提取到的总DNA中的ITS2序列进行扩增， 再利用高分辨率熔解曲线分析技术，可对三七样品中是否掺入人参、西洋参实现快速， 准确性高的检测。本发明仅仅需要约5～7个小时就可以完成从基因组DNA提取到样 品分析的全过程。

根据本发明的具体实施方案，在本发明所述鉴定待检三七样品是否掺伪的方法 中，所述待检三七样品为中药细粉、中药最细粉或中药极细粉；

所述中药细粉指能全部通过五号筛，并含能通过六号筛不少于95％的粉末；

所述中药最细粉指能全部通过六号筛，并含能通过七号筛不少于95％的粉末；

所述中药极细粉指能全部通过八号筛，并含能通过九号筛不少于95％的粉末。

本发明所述中药细粉、中药最细粉或中药极细粉的定义与《中国药典》2015版 中的定义相同。如上所述，对于粉末状的待检三七样品，现有技术难以提供鉴定其是 否掺假的有效方法，尤其是掺入人参、西洋参等同属粉末的方法，本发明采用SEQID NO:1和2引物对对所提取到的总DNA中的ITS2序列进行扩增，再利用高分辨率熔 解曲线分析技术可有效解决该技术问题。

根据本发明的具体实施方案，在本发明所述鉴定待检三七样品是否掺伪的方法 中，所述测试上述扩增结果的高分辨熔解曲线包括从40℃以上，以2～4.5℃/s的速度， 升温至95℃，测试所述扩增结果的熔解曲线的过程。优选地，将上述扩增结果95℃ 变性1min，40℃复性30s，65℃保持1s，从65℃以4.4℃/s升温至95℃，在升温过 程中采集信号。

根据本发明的具体实施方案，在本发明所述鉴定待检三七样品是否掺伪的方法 中，所述从待检三七样品中提取总DNA的过程包括如下步骤：

在待检三七样品中加入液氮进行研磨；

加入用于提取植物DNA的含离子型表面活性剂的缓冲液，在60℃～70℃消化 5min～4小时；

用氯仿法或酚仿法抽提；

加入醇类溶剂沉淀富集DNA；

利用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总DNA。

根据本发明的具体实施方案，在本发明所述鉴定待检三七样品是否掺伪的方法 中，所述PCR扩增为荧光定量PCR扩增；

PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延 伸45s，扩增进行30个循环以上。

本发明PCR扩增体系可选用反应体系为25μl，其中上下游引物SEQIDNO:1及 2(浓度2μM)各1μL，提取得到的总DNA(浓度0.01μg/μL以上)1μL，lightcycler 480HRMmastermix(2倍浓度)12.5μL，MgCl₂(25mmoL)3.0μL,其余用ddH₂O 补至总反应体系25μL。

本发明所述lightcycler480HRMmastermix可商够获得。

荧光定量PCR扩增通过对目的基因荧光强度的实时检测，可以快速、准确、实时 地对反应样品PCR扩增的状况，与普通PCR反应相比，它特异性更高，反应不需电泳 验证，实现了真正的闭管操作等优点，在临床疾病诊断和物种资源鉴定中发挥了重要 作用。此外，通过荧光定量PCR扩增还可对样品中的三七基因实现定量分析。

根据本发明的具体实施方案，在本发明所述鉴定待检三七样品是否掺伪的方法 中，该方法还包括：

将待检三七样品PCR产物的高分辨熔解曲线与从三七对照品中提取DNA进行 PCR扩增后测试得到的高分辨熔解曲线对照，分析判断待检三七样品是否掺伪；

当待检三七样品PCR产物的高分辨熔解曲线与三七对照药材PCR产物的高分辨 熔解曲线具有基本相同的熔解特征时，表明待检三七样品未掺伪；

当待检三七样品PCR产物的高分辨熔解曲线与三七对照药材PCR产物的高分辨 熔解曲线具有不同的熔解特征时，表明待检三七样品掺伪，当待检三七样品没有PCR 产物检出时，表明样品中不含三七药材。

本发明所述基本相同的熔解特征通常是指待检三七样品PCR产物的高分辨熔解 曲线与三七对照药材PCR产物的高分辨熔解曲线能够重合，或在本领域允许的误差 范围内基本重合。

本发明不同的熔解特征通常是指待检三七样品PCR产物的高分辨熔解曲线与三 七对照药材PCR产物的高分辨熔解曲线无法重合，或即使本领域技术人员考虑可允 许的误差的情况下也不能基本重合。本领域允许的误差为±5％，优选±2％。

另一方面，本发明提供用于实现本发明所述检测样品中是否存在五加科植物成分 的方法或鉴定待检三七样品中是否掺伪的方法的引物对，所述引物对包括SEQID NO:1和SEQIDNO:2；

SEQIDNO：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；

SEQIDNO：2：CGCACGACATGAGAAGAGG。

再一方面，本发明提供所述的引物对在检测样品中是否存在五加科植物成分或在 鉴定待检三七样品是否掺伪中的应用。

再一方面，本发明提供一种鉴定待检三七样品是否掺伪的试剂盒，该试剂盒包含 本发明所述的引物对；优选地，该试剂盒还包括荧光染料和Mg²⁺试剂；更优选该试 剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR缓冲液。

综上所述，本发明主要提供检测样品中是否存在五加科植物成分以及鉴定待检三 七样品是否掺伪的方法，其中，鉴定待检三七样品是否掺伪的方法是在在利用本发明 所述引物对特异性扩增三七、人参、西洋参ITS2序列的基础上，再利用高分辨率熔 解曲线分析技术。其可对三七样品中是否掺入植物源性中药材/饮片粉末实现快速， 准确性高的检测，尤其是针对在三七粉末制剂中掺入同属粉末的检测。

附图说明

图1为实施例1中SEQIDNO:1和2对三七、人参、西洋参的总DNA的PCR 扩增结果图；

图2A为实施例2中采用ITS2通用引物扩增的PCR结果图；

图2B为实施例2中采用SEQIDNO:1及2扩增的PCR结果图；

图3A为实施例2中ITS2通用引物对三七、人参的总DNA的扩增曲线；

图3B为实施例2中SEQIDNO：1和2引物对三七、人参的总DNA的扩增曲 线；

图4A为实施例2中ITS2通用引物的三七、人参高分辨熔解曲线图；

图4B为实施例2中SEQIDNO:1和2引物的三七、人参高分辨熔解曲线图；

图5A为实施例3中三七、人参、西洋参归一化和变换熔解曲线；

图5B为图5A的归一化和熔解度差异曲线；

图6A为实施例3中三七总DNA及三七基因组掺入不同比例人参基因组的归一 化和变换熔解曲线；

图6B为实施例3中三七总DNA及三七基因组掺入不同比例人参基因组的归一 化和熔解度差异曲线；

图7为实施例4中三七药材30mg、20mg和10mg的荧光PCR扩增曲线；

图8为实施例4中三七基因组1倍、1/10倍、1/100倍和1/1000稀释的荧光PCR 扩增曲线；

图9为实施例5中不同浓度MgCl₂试剂的PCR扩增曲线；

图10为实施例5中不同浓度lightcycler480HRMmastermix(2X)的PCR扩增曲 线。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施 例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体 条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的 条件。

实施例1SEQIDNO:1和2对三七、人参、西洋参的PCR扩增

(1)分别取三七、人参、西洋粉末各30mg，采用植物基因组DNA提取试剂盒(Plant GenomicDNAKit，离心柱型，目录编号：DP305，TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO., LTD)分别提取三七、人参、西洋参的总DNA，具体而言：

(a)加入液氮充分研磨；

(b)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管 中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后， 将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；

(c)加入700μL酚/氯仿(v/v1:1)，充分混匀，12000rpm(～13400×g)离心 5min；

(d)小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液 GP2，充分混匀；

(e)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm(～13,400×g)离心30s，弃 掉废液(吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心)；

(f)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水 乙醇)，12000rpm(～13400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(g)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水 乙醇)，12000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(h)重复操作步骤(g)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(～13400×g) 离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中 残余的漂洗液；该步目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会 影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验；

(i)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μLpH为7.0～8.5的洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm(～13,400×g)离 心2min，将提取的总DNA溶液收集到离心管中；且DNA产物保存在-20℃，以防 DNA降解，采用ThermoFisherDNA测定仪测得三七、人参、西洋参的总DNA的浓 度分别为23μg/μL、30μg/μL、29μg/μL。

(2)采用罗氏480II实时荧光定量PCR系统对步骤(1)提取得 到的三七、人参、西洋参的总DNA分别进行实时荧光定量扩增，其中，荧光PCR体 系为25μL，其包括上下游引物SEQIDNO:1及2(浓度2μM)各1μL，每种样品 的总DNA1μL，lightcycler480HRMmastermix(2倍浓度)12.5μL，MgCl₂(25mmoL) 3.0μL,其余用ddH₂O补至总反应体系25μL；SEQIDNO:1及2的序列如下所示：

SEQIDNO：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；

SEQIDNO：2：CGCACGACATGAGAAGAGG；

SEQIDNO:1及2的序列定制合成于上海捷瑞生物工程有限公司。

PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延 伸45s，扩增40个循环；每个样品测试两次；扩增时，采集465～510nm的荧光信号， 所得结果如图1所示，从图1中可以看出本发明SEQIDNO:1及2能够有效的对三 七、人参或西洋参的DNA进行扩增，可有效的应用于检测样品中是否存在五加科植 物成分。

实施例2SEQIDNO:1和2和ITS2通用引物的比较

以跌打活血散中的多味植物源性药材为例，对比SEQIDNO:1和2与ITS2通用引 物的PCR扩增结果。跌打活血散中的植物药材包括红花、当归、骨碎补、续断、大黄 和三七药材等，分别称取30mg各药材粉末，及人参粉末，按实施例1中的步骤(1) 在相同的条件下，提取各药材的总DNA；对每种药材的总DNA，分别以ITS2通用引 物及SEQIDNO:1及2，按实施例1中的步骤(2)，在相同的条件下进行实时荧光PCR 扩增，其中，每个样品测试两次，ITS2通用引物的序列为：

ITS2-3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT；

ITS2-2F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；

采用ITS2通用引物扩增的PCR结果如图2A所示，采用SEQIDNO:1及2扩增 的PCR结果如图2B所示，从图2A中可以看出采用ITS2通用引物可以将跌打活血 散中的多味植物源性药材以及人参药材扩增出，缺乏特异性，因此，采用高分辨熔融 曲线(HRM)难以实现对跌打活血散制剂中是否含有三七成分的快速鉴别，因为其 复方成分较多，采用ITS2通用引物无特异性扩增后，HRM曲线会受非三七成分的 干扰，无特异性；从图2B中可以看出，采用SEQIDNO：1和2引物对可特异性的 对三七成分进行荧光PCR扩增，因此，采用HRM可特异性地快速鉴别跌打活血散 中是否含有三七药材。

分别称取30mg三七、人参粉末，按实施例1中的步骤(1)，在相同的条件下提 取三七、人参的总DNA，分别以所述ITS2通用引物及SEQIDNO:1及2引物，按 实施例1中的步骤(2)，在相同的条件下进行实时荧光PCR扩增，采用ITS2通用 引物扩增的PCR结果如图3A所示，采用SEQIDNO:1及2扩增的PCR结果如图3B 所示，对比图3A及图3B可以看出，采用SEQIDNO：1和2引物的PCR反应，荧 光PCR产物更快进入平台期，更符合PCR反应过程中，DNA片段指数化变化的规 则，证明该PCR反应效果更好。因此，与ITS2引物相比，本实施例SEQIDNO:1 和2引物的荧光PCR效果更好。

分别称取30mg三七、人参粉末，按实施例1中的步骤(1)，在相同的条件下分 别提取三七、人参的总DNA；对每种药材的总DNA分别以上述ITS2通用引物以SEQ IDNO:1及2引物，按实施例1中的步骤(2)，在相同的条件下进行实时荧光定量扩增， 并测试所得扩增结果的高分辨熔融曲线，测试条件为95℃变性,40℃复性30s,65℃保 持1s，从65℃以4.4℃/s的速度缓慢升温95℃至DNA双链完全打开，在升温的过程中采 集荧光，每个样品测试多次，所得结果如图4A、图4B所示，其中，图4A为ITS2通用 引物扩增产物的三七、人参高分辨熔解曲线图，图4B为SEQIDNO:1和2引物扩增产 物的三七、人参高分辨熔解曲线图，从图4A中可以看出采用ITS2通用引物进行扩增 的三七和人参样品，其HRM图有明显的双峰存在，证明PCR产物有两个熔点，也就 是存在非特异扩增产物；从图4B可以看出，采用SEQIDNO:1和2引物进行PCR反应， 处于较低温度的PCR产物熔解峰消失，结果专一性更强。

实施例3利用SEQIDNO:1及2鉴别待检测三七样品中是否掺伪

分别称取30mg三七、人参、西洋参的极细粉末，按实施例1中的步骤(1)，在 相同的条件下分别提取三七、人参、西洋参的总DNA；对每种药材的总DNA以SEQID NO:1及2作为引物，按实施例1中的步骤(2)，在相同的条件下进行实时荧光定量扩 增，并测试所得扩增结果的高分辨熔融曲线，测试条件为95℃变性，40℃复性30s， 65℃保持1s，从65℃以4.4℃/s的速度缓慢升温95℃至DNA双链完全打开，升温的过 程中采集荧光，每个样品测试两次，所得结果如图5A及图5B所示，其中，图5A为三 七、人参、西洋参归一化和变换熔解曲线，图5B为图5A的归一化和熔解度差异曲线， 从图5A及图5B可以看出，高分辨率熔融曲线可以有效区分如上所述的仅有个别碱基 差异的三七、人参、西洋参的PCR产物。

近年来，由于三七价格远高于人参价格，不法分子将人参粉末掺入三七粉末的现 象多见。为验证本实施例是否能够鉴别出待检三七样品中掺有人参，本实施例分别称 取30mg三七、人参的极细粉末，按实施例1中的步骤(1)，在相同的条件下分别提 取三七、人参的总DNA，并将提到到的三七的总DNA(三七基因组)及人参的总DNA (人参基因组)稀释为相同浓度，均为约2μg/μL，并在98μL的浓度为2μg/μL的三七 基因组中加入2μL的浓度为2μg/μL的人参基因组，得含2％人参基因组的三七基因组 (含98％的三七基因组)，按同样的操作，分别制得含10％人参基因组的三七基因组 (含90％的三七基因组)及含50％人参基因组的三七基因组(含50％的三七基因组)； 然后使用本发明所述SEQIDNO:1和2引物分别对浓度为2μg/μL的三七总DNA (100％)、掺有2％、10％、50％人参总基因组(总浓度均为2μg/μL)的三七基因组 进行实时荧光定量PCR，DNA实时荧光定量PCR的条件相同，均是按照实施例1中的 步骤(2)操作；最后，分别测试所得扩增结果的高分辨熔融曲线，测试条件为95℃ 变性,40℃复性30s,65℃保持1s，从65℃以4.4℃/s的速度缓慢升温95℃至DNA双链完 全打开，升温过程中采集荧光，每个样品测试两次，所得结果如图6A、图6B所示， 其中，图6A为三七总DNA及三七基因组掺入不同比例人参基因组的归一化和变换熔 解曲线，图6B为三七总DNA及三七基因组掺入不同比例人参基因组的归一化和熔解 度差异曲线，从图6A及图6B中可以看出2％的人参基因掺伪就可以有效地被检出。

实施例4关于荧光PCR定量检测

本实施例分别称取相同的三七对照药材30mg(1号)、20mg(2号)、10mg(3 号)按实施例1中的步骤(1)在相同的条件下提取总DNA；对所得的总DNA，以SEQ IDNO:1及2，按实施例1中的步骤(2)，在相同的条件下进行实时荧光定量扩增，其 中，每个样品测试两次，所得结果如图7所示，从图7中可以看出不同浓度的PCR产物 的出峰时间(Ct值)相差约为0.5个循环左右，与所称质量相符。

另外，将1号样品基因组进行稀释，以得到1倍，1/10倍，1/100倍，1/1000倍浓度 的三七基因组，在上述相同的条件下进行荧光PCR检测，所得结果如图8所示，从图8 中可以看出，不同浓度的PCR产物的出峰时间(Ct值)相差约为3个循环左右，与所 称质量相符。

实施例5PCR扩增体系lightcycler480HRMmastermix(2倍浓度)，MgCl₂(25mM) 试剂用量的优化实验

以实施例1中提取的三七的总DNA为模板，采用罗氏480II实时荧 光定量PCR系统对其进行扩增，其中，改变MgCl₂(25mM)试剂的用量，分别在25μL 的PCR反应体系中加入2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μL的MgCl₂试剂进行检测，该PCR反 应体系中其他试剂及其用量均同实施例1，按实施例1中的步骤(2)分别扩增，所得 结果如图9所示，从图9中可以看出MgCl₂试剂浓度在3.0μL时PCR扩增效率更高。

以实施例1中提取的三七的总DNA为模板，采用罗氏480II实时荧 光定量PCR系统对其进行扩增，其中，改变lightcycler480HRMmastermix(2倍浓度) 的用量，设定按25μL加入12.5μL为1倍体积量，在梯度实验中选择1.2、1、0.8倍体积 量进行实验，该PCR反应体系中其他试剂及其用量均同实施例1，按实施例1中的步骤 (2)分别扩增，所得结果如图10所示，从图10中可以看出在lightcycler480HRMmaster mix(2倍浓度)为1倍体积时PCR扩增效果最佳。

最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发 明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人 员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范 围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。