一种基于钾离子流对小麦进行耐盐性评价或筛选耐盐小麦方法

摘要

本发明公开了一种基于钾离子流对小麦进行耐盐性评价或筛选耐盐小麦方法。本发明提供了一种辅助筛选耐盐小麦的方法，包括如下步骤：将待测小麦的种子分成两组，对照组在正常环境下进行萌发，试验组在盐胁迫环境下进行萌发，检测萌发期种子的糊粉层部位的K+的流向与流速，对照组的K+流速减去实验组的K+流速得到数值M；如果数值M小于等于30pmol·cm

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于钾离子流对小麦进行耐盐性评价或筛选耐盐小麦方法。

背景技术

盐渍化土壤是世界上分布面积最广，影响农业生产和生态环境最大的主要非生物 逆境之一。据联合国粮农组织2000年统计结果显示，全世界共有盐渍化土地面积约4 亿多公顷，仅我国就有7000多万公顷，这些土地主要分布在西北、华北、东北等粮 食主产区，对于我国的农业生产构成了严重威胁。因此，对现有作物种质资源进行耐 盐性评价、筛选耐盐植物，对充分利用盐碱土地具有重要意义。

已有报道中对植物耐盐性评价已有一些报道，主要筛选材料有水稻、小麦、番茄 等，主要是针对盐胁迫下发芽指标、生长量和形态伤害等指标进行筛选，或者利用具 有盐浓度的组织培养来筛选耐盐的植株和突变体。然而，上述方法鉴定周期长、过程 复杂，且都对种子和幼苗的生长构成了严重的损伤，甚至破坏了种子或幼苗结构使其 完全失去发芽或生长能力，使珍贵的种质资源无法得到保存。因此，开发新的检测植 株种质耐盐性的方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于钾离子流对小麦进行耐盐性评价或筛选耐盐小麦 方法。

本发明提供了一种辅助筛选耐盐小麦的方法，包括如下步骤：

将待测小麦的种子分成两组，对照组在正常环境下进行萌发，试验组在盐胁迫环 境下进行萌发，检测萌发期种子的糊粉层部位的K⁺的流向与流速(K⁺外流时流速为正 数，K⁺内流时流速为负数)，对照组的K⁺流速减去实验组的K⁺流速得到数值M；如果数 值M小于等于30pmol·cm^-2·s^-1，待测小麦为候选的不耐盐小麦；如果数值M大于 30pmol·cm^-2·s^-1，待测小麦为候选的耐盐小麦。

所述“在正常环境下进行萌发”可为在Hogland营养液环境中萌发。

所述“在盐胁迫环境下进行萌发”可为在含NaCl的Hogland营养液环境中萌发。 所述“含NaCl的Hogland营养液”具体可为含150mMNaCl的Hogland营养液。

所述“进行萌发”的时间具体可为12小时。

所述“进行萌发”的条件具体可为25±1℃、无光照。

所述待测小麦的种子具体可为消毒后的小麦种子。所述消毒的具体方法为：取小 麦种子，先用75％(体积比)乙醇水溶液浸泡30秒，然后用蒸馏水清洗3-4次，然后用 20g/100ml次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，然后用蒸馏水清洗5-6次。

所述耐盐具体可为萌发期耐盐。

本发明还保护一种辅助评价耐盐小麦的方法，包括如下步骤：

将待测小麦的种子分成两组，对照组在正常环境下进行萌发，试验组在盐胁迫环 境下进行萌发，检测萌发期种子的糊粉层部位的K⁺的流向与流速(K⁺外流时流速为正 数，K⁺内流时流速为负数)，对照组的K⁺流速减去实验组的K⁺流速得到数值M；如果数 值M小于等于30pmol·cm^-2·s^-1，待测小麦为候选的不耐盐小麦；如果数值M大于 30pmol·cm^-2·s^-1，待测小麦为候选的耐盐小麦。

所述“在正常环境下进行萌发”可为在Hogland营养液环境中萌发。

所述“在盐胁迫环境下进行萌发”可为在含NaCl的Hogland营养液环境中萌发。 所述“含NaCl的Hogland营养液”具体可为含150mMNaCl的Hogland营养液。

所述“进行萌发”的时间具体可为12小时。

所述“进行萌发”的条件具体可为25±1℃、无光照。

所述待测小麦的种子具体可为消毒后的小麦种子。所述消毒的具体方法为：取小 麦种子，先用75％(体积比)乙醇水溶液浸泡30秒，然后用蒸馏水清洗3-4次，然后用 20g/100ml次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，然后用蒸馏水清洗5-6次。

所述耐盐具体可为萌发期耐盐。

本发明还保护以上任一所述的方法在进行耐盐小麦育种中的应用。

所述耐盐具体可为萌发期耐盐。

以上任一所述耐盐小麦可为满足如下标准的小麦：将小麦种子置于底垫用含 150mMNaCl的Hogland营养液润湿的双层滤纸的培养皿内并封盖，25±1℃无光照培养 7天，发芽率为90％以上和/或根长为9cm以上和/或芽长为10cm以上。所述小麦种子具 体可为消毒后的小麦种子。所述消毒的具体方法为：取小麦种子，先用75％(体积比) 乙醇水溶液浸泡30秒，然后用蒸馏水清洗3-4次，然后用20g/100ml次氯酸钠水溶液浸 泡10分钟，然后用蒸馏水清洗5-6次。

以上任一所述不耐盐小麦可为满足如下标准的小麦：将小麦种子置于底垫用含 150mMNaCl的Hogland营养液润湿的双层滤纸的培养皿内并封盖，25±1℃无光照培养 7天，发芽率为60％以下和/或根长为8.5cm以下和/或芽长为6cm以下。所述小麦种子具 体可为消毒后的小麦种子。所述消毒的具体方法为：取小麦种子，先用75％(体积比) 乙醇水溶液浸泡30秒，然后用蒸馏水清洗3-4次，然后用20g/100ml次氯酸钠水溶液浸 泡10分钟，然后用蒸馏水清洗5-6次。

糊粉层为禾本科植物种子胚乳的最外层组织,其本身既无色泽又凝聚了禾本科植 物籽实中约61％的矿物质、15％的蛋白质、37％的核黄素等丰富的营养成分，小麦种子 的糊粉层是小麦种子萌发的主要营养来源。

动态离子流检测技术即离子选择性微电极扫描技术(Non-InvasiveMicro-Test Technology，NMT)，在不破坏被测试材料的前提下获得测试材料的离子运动速率、方 向及浓度等信息，该项技术可以对测试材料的不同部位以及同一部位连续时间测量。

现有的小麦耐盐性鉴定方法存在破坏性取样、检测周期长、培养幼苗繁琐且要求 高等缺陷。本发明中，采用非损伤性的动态离子流检测小麦种子萌发期其糊粉层对K⁺的吸收和释放能力(K⁺的流向和流速)，从而进行小麦耐盐性评价，进一步筛选耐盐小 麦。本发明提供的方法具有如下优势：无损(短期盐胁迫损伤小，盐胁迫后的小麦还 能继续正常生长)、活体、快速(检测一个样本耗时少至几分钟多至十几分钟)、准确 性高、不受季节限制、成本小、操作简单。本发明为小麦耐盐材料的筛选和遗传改良 开辟了新的途径。

附图说明

图1为小麦品种“薛早”的萌发期种子的糊粉层部位的K⁺流动态变化。

图2为小麦品种“德抗961”的萌发期种子的糊粉层部位的K⁺流动态变化。

图3为小麦品种“薛早”和小麦品种“德抗961”在10min内的K⁺平均流速比较。

图4为小麦品种“沧6001”的萌发期种子的糊粉层部位的K⁺流动态变化。

图5为小麦品种“冀麦32”的萌发期种子的糊粉层部位的K⁺流动态变化.

图6为小麦品种“薛早”、小麦品种“德抗961”、小麦品种“沧6001”和小麦品 种“冀麦32”分组培养24小时后的照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。MES的全称为2-(N-吗啡啉)乙磺酸。

小麦品种“德抗961”，为芽期耐盐性品种，参考文献：梁超，王超，杨秀凤，张 秀田，王纬；德抗961小麦耐盐生理特性研究；西北植物学报，2006，26(10)：2075-2082。

小麦品种“薛早”，为芽期盐敏感品种，参考文献：张连松，华为，关海英，李 根桥，张宏涛，解超杰，杨作民，孙其信，刘志勇；野生二粒小麦导入普通小麦的抗 白粉病基因MlWE29分子标记定位；作物学报2009,35(6):998-1005。

小麦品种“沧6001”，为芽期耐盐性品种,参考文献：陆莉，王奉之；耐盐冬小麦 新品种——冀审沧6001；农业科技通讯，1998,07:34-35。

小麦品种“冀麦32”，为芽期盐敏感品种，参考文献：赵松山，王奉芝，陆丽， 张焕英，张宪营；抗旱耐盐型小麦品种沧6001的选育；华北农学报，2000,15:113-117。

实施例1、基于动态离子流检测辅助鉴定小麦耐盐性

分别将两种待测小麦(小麦品种“德抗961”或小麦品种“薛早”)进行如下鉴定：

一、基于动态离子流检测辅助鉴定小麦耐盐性

1、种子灭菌

取待测小麦的种子(外型均一、饱满)，先用75％(体积比)乙醇水溶液浸泡30秒， 然后用蒸馏水清洗3-4次，然后用20g/100ml次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，然后用蒸馏 水清洗5-6次。

2、分组处理

完成步骤1后，将20粒种子分成两组(第一组为对照组，第二组为试验组，每 组10粒；试验组又称为盐胁迫组)，第一组种子放置于底垫双层滤纸(用Hogland营 养液充分润湿)的培养皿内并封盖，第二组种子置于底垫双层滤纸(用含150mMNaCl 的Hogland营养液充分润湿)的培养皿内并封盖，将两组培养皿置于25±1℃的培养 箱(无光照)中萌发12小时，得到萌发期种子。

3、测量离子流

离子流检测采用的仪器为非损伤微测系统(BIO-001B，YoungerUSASci.&Tech. Corp.，USA)，微电极采用尖端直径为4-5μm的玻璃微电极。液态离子交换剂(K⁺)： 货号PotassiumionophoreI-cocktailA；Sigma-Aldrich,Louis,MO63103,USA。 测试缓冲液：溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.1mMKCl、0.1mMCaCl₂、0.1mMMgCl₂、 0.5mMNaCl、0.2mMNa₂SO₄和0.3mMMES。电极灌充液：100mMKCl水溶液。校正液： 0.1mMKCl水溶液和1mMKCl水溶液。

操作方法：从微电极末端灌入1cm左右的电极灌充液至电极尖端充满，前端吸入 适当长度(160-180μm)的液态离子交换剂(K⁺)，将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极 线基座，参比电极为固体低渗漏性电极(WPI)，在校正液中校正电极，能斯特(Nerst) 方程计算理想值是27-30mV；取步骤2得到的萌发期种子，浸泡在测试缓冲液中平衡 15-20min，然后将微电极置于距离种子糊粉层区表面30μm处振动检测10min，原始输 出结果为电压值，将原始输出结果输入在线软件MageFlux-3DIonFluxPlotting System(http://www.xuyue.net/mageflux/)，得到结果数据(K⁺的流向与流速)。

小麦品种“薛早”的结果见图1。小麦品种“薛早”的萌发期种子的糊粉层部位： 在正常条件下，K⁺处于外流状态，平均流速为18.3pmol·cm^-2·s^-1；在150mMNaCl胁 迫12h后，K⁺变为内流状态，平均流速为-7pmol·cm^-2·s^-1；对照组和试验组的K⁺流速 差值为25.3pmol·cm^-2·s^-1。

小麦品种“德抗961”的结果见图2。小麦品种“德抗961”的的萌发期种子的糊 粉层部位：在正常条件下，K⁺处于外流状态，平均流速为27.8pmol·cm^-2·s^-1；在150mM NaCl胁迫12h后，K⁺变为内流状态，平均流速为-16pmol·cm^-2·s^-1；对照组和试验组 的K⁺流速差值为43.8pmol·cm^-2·s^-1。

小麦品种“薛早”和小麦品种“德抗961”在10min内的K⁺平均流速比较见图3。

结果表明：盐胁迫条件下，小麦品种“德抗961”的糊粉层部位对K⁺的保有能力强 于小麦品种“薛早”，小麦品种“德抗961”的耐盐性强于小麦品种“薛早”。

基于上述结果设定阈值如下：如果对照组和试验组的K⁺流速差值为30 pmol·cm^-2·s^-1以下，待测小麦为候选的不耐盐小麦；如果对照组和试验组的K⁺流速差 值大于30pmol·cm^-2·s^-1，待测小麦为候选的耐盐小麦。

二、结果验证

1、种子灭菌

取待测小麦的种子(外型均一、饱满)，先用75％(体积比)乙醇水溶液浸泡30秒， 然后用蒸馏水清洗3-4次，然后用20g/100ml次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，然后用蒸馏 水清洗5-6次。

2、分组处理并检测耐盐性

完成步骤1后，将20粒种子分成两组(第一组为对照组，第二组为试验组，每组 10粒；试验组又称为盐胁迫组)，第一组种子放置于底垫双层滤纸(用Hogland营养液 充分润湿)的培养皿内并封盖，第二组种子置于底垫双层滤纸(用含150mMNaCl的 Hogland营养液充分润湿)的培养皿内并封盖，将两组培养皿置于25±1℃的培养箱(无 光照)中培养7天，然后测量根长、芽长和发芽率。

进行三次重复实验，结果取平均值。

分组培养24小时后的照片见图6。

盐胁迫组根长、芽长和发芽率的测量结果见表1。

结果表明，小麦品种“德抗961”的耐盐性强于小麦品种“薛早”。小麦品种“薛 早”为不耐盐小麦，小麦品种“德抗961”为耐盐小麦。

表1分组处理7天年后的发芽率、平均根长和平均芽长结果

发芽率(％) 平均根长(cm) 平均芽长(cm) 小麦品种“德抗961” 95.0％ 10.5 12.0 小麦品种“薛早” 52.5％ 7.5 4.5

实施例2、基于动态离子流检测辅助鉴定小麦耐盐性

分别将两种待测小麦(小麦品种“沧6001”、小麦品种“冀麦32”)按照实施例1 的方法进行鉴定。

分组培养24小时后的照片见图6。

小麦品种“沧6001”的结果见图4。小麦品种“沧6001”的萌发期种子的糊粉层 部位：在正常条件下，K⁺处于外流状态，平均流速为25.8pmol·cm^-2·s^-1；在150mMNaCl 胁迫12h后，K⁺变为内流状态，平均流速为-24.4pmol·cm^-2·s^-1；对照组和试验组的K⁺流速差值为50.2pmol·cm^-2·s^-1。

小麦品种“冀麦32”的结果见图5。小麦品种“冀麦32”的的萌发期种子的糊粉 层部位：在正常条件下，K⁺处于内流状态，平均流速为-3.0pmol·cm^-2·s^-1；在150mMNaCl 胁迫12h后，K⁺变为内流状态，平均流速为-12.1pmol·cm^-2·s^-1；对照组和试验组的K⁺流速差值为9.1pmol·cm^-2·s^-1。

分组培养24小时后的照片见图6。

盐胁迫组根长、芽长和发芽率的测量结果见表2。

结果表明，小麦品种“沧6001”的耐盐性强于小麦品种“冀麦32”。小麦品种“冀 麦32”为不耐盐小麦，小麦品种“沧6001”为耐盐小麦。

表2分组处理7天年后的发芽率、平均根长和平均芽长结果

发芽率(％) 平均根长(cm) 平均芽长(cm) 小麦品种“沧6001” 96.0％ 10.2 11.5 小麦品种“冀麦32” 46.7％ 8.0 5.1