并用抗抗酸菌药、抗抗酸菌药的筛选方法、和WecA及其直系同源的活性阻碍剂

摘要

本发明涉及将WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与MurX及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种并用的并用抗抗酸菌药、抗抗酸菌药的筛选方法、和WecA及其直系同源的活性阻碍剂。

说明书

技术领域

本发明涉及针对包含结核分枝杆菌的抗酸菌有效的并用抗抗酸菌药、抗抗酸菌药的筛 选方法、和WecA及其直系同源的活性阻碍剂。

背景技术

以品红、结晶紫等固定染色的情况下、对利用盐酸酸性醇的脱色显示抗性的细菌被称 为抗酸菌、或抗酸性细菌等。

所述抗酸菌包含结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)等属于分枝杆菌属的 细菌。

结核是由结核分枝杆菌引起的感染病症，在世界中的感染症之中作为单独的感染病症 是死亡人数最多的疾病。近年来在所述结核分枝杆菌中检测到耐多药性结核分枝杆菌 (MDR-TB)、广泛耐受性结核分枝杆菌(XDR-TB)成为大的问题。

到目前为止，发现了作为针对抗酸性菌具有优异的抗菌活性的化合物的卡普拉霉素类 及其衍生物(例如参照专利文献1～4)等。

例如在所述提案之中发现了作为卡普拉霉素的衍生物的CPZEN-45针对所述耐多药性结 核分枝杆菌(MDR-TB)、广泛耐受性结核分枝杆菌(XDR-TB)具有优异的抗菌活性。

这种状况下，活跃地进行了向开发出针对由抗酸菌所包含的结核分枝杆菌引起的结核 的治疗药的研究，强烈要求迅速提供可成为更优异的治疗药的药物。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第01/012643号

专利文献2：国际公开第2004/067544号

专利文献3：国际公开第2008/020560号

专利文献4：日本特开2010-83847号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于上述现有技术而进行的，课题在于实现以下目的。即，本发明的目的在 于，提供针对抗酸菌具有优异的药效的并用抗抗酸菌药、抗抗酸菌药的筛选方法、和具有 针对WecA及其直系同源的优异阻碍活性的WecA及其直系同源的活性阻碍剂。

解决技术问题的手段

作为用于解决所述课题的手段，如下。即，

＜1＞一种并用抗抗酸菌药，其特征在于，将WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与MurX 及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种并用。

＜2＞一种抗抗酸菌药的筛选方法，其特征在于，包含对针对WecA及其直系同源的被 检验物质的活性进行测定的工序。

＜3＞一种WecA及其直系同源的活性阻碍剂，其特征在于，包含下述结构式(1)表示 的化合物。

[化学式1]

发明效果

根据本发明，能够实现所述目的，从而能够提供针对抗酸菌具有优异的药效的并用抗 抗酸菌药、抗抗酸菌药的筛选方法、和具有针对WecA及其直系同源的优异阻碍活性的WecA 及其直系同源的活性阻碍剂。

附图说明

图1是表示结构式(2)表示的化合物的紫外线吸收光谱的图。

图2是表示结构式(2)表示的化合物经KBr片剂法测定而得的红外线吸收光谱的图。

图3是表示结构式(2)表示的化合物的质子核磁共振光谱的图。

图4是表示结构式(2)表示的化合物的碳13核磁共振光谱的图。

图5是表示结构式(1)表示的化合物的质子核磁共振光谱的图。

图6是表示结构式(1)表示的化合物的碳13核磁共振光谱的图。

图7A是表示在试验例2中、将CPZEN-45用作药剂的情况的结果的图表。

图7B是表示在试验例2中、将卡普拉霉素B用作药剂的情况的结果的图表。

图7C是表示在试验例2中、将衣霉素用作药剂的情况的结果的图表。

图7D是表示在试验例2中、将万古霉素用作药剂的情况的结果的图表。

图7E是在试验例2中、将左氧氟沙星用作药剂的情况的结果的图表。

图8是表示pHYcat的概要的图。

图9A是表示对试验例4的TagO的酶活性进行评价而得的结果的图表。

图9B是表示对试验例4的MraY的酶活性进行评价而得的结果的图表。

图10是表示试验例5的结果的图。

图11A是表示试验例6的CPZEN-45与卡普拉霉素B的组合的结果的图。

图11B是表示试验例6的衣霉素与利福平的组合的结果的图。

图11C是表示试验例6的卡普拉霉素B与利福平的组合的结果的图。

具体实施方式

(并用抗抗酸菌药)

本发明的并用抗抗酸菌药至少含有WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与MurX及 其直系同源的活性阻碍剂、和RNA合成阻碍剂中的至少一种，根据需要进一步含有其 它成分。

＜WecA及其直系同源的活性阻碍剂＞

所述并用抗抗酸菌药中的所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂至少含有阻碍WecA 及其直系同源的活性的化合物，根据需要进一步含有其它成分。

所述WecA是指，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)具有的酶(碱基 序列参照序列号1)。所述WecA是与作为细胞壁的构成成分的分枝酰阿拉伯半乳聚糖 的合成相关的酶。

所述直系同源是指，认为具有共同的祖先基因的基因组。作为所述WecA的直系同 源，例如可以举出作为牛型分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)具有的酶的WecA(与作 为细胞壁的构成成分的分枝酰阿拉伯半乳聚糖的合成相关的酶，碱基序列参照序列号 2)、作为包皮垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)具有的酶的WecA(与作为细 胞壁的构成成分的分枝酰阿拉伯半乳聚糖的合成相关的酶，碱基序列参照序列号3)、 作为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)具有的酶的TagO(与作为细胞壁的构成成分 的磷壁质酸的合成相关的酶，碱基序列参照序列号4)等。

-阻碍WecA及其直系同源的活性的化合物-

作为阻碍所述WecA及其直系同源的活性的化合物，没有特别限制，能够根据目的 适当选择，例如可以举出下述结构式(1)表示的化合物(以下有时称为“CPZEN-45”)、 衣霉素(Tunicamycin)等。这些可以单独使用一种，也可以将两种以上并用。

这些之中优选CPZEN-45。

[化学式2]

所述CPZEN-45和衣霉素是作为具有抗菌性的化合物公知的化合物。

阻碍所述WecA及其直系同源的活性的化合物可以是盐的形式。

作为所述盐，只要是可以在药理学上容许的盐，就没有特别限制，能够根据目的 适当选择，例如可以举出乙酸盐、柠檬酸盐等有机盐、盐酸盐、碳酸盐等。

阻碍所述WecA及其直系同源的活性的化合物可以通过化学合成获得，也可以由生 产所述化合物的微生物获得。

作为所述CPZEN-45的制造方法，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可 以举出国际公开第2004/067544号、日本特开2010-83847号公报中记载的方法等。

作为所述衣霉素的制造方法，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以 举出由生产所述衣霉素的微生物制造的方法。

作为所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂中阻碍WecA及其直系同源的活性的化 合物的含量，没有特别限制，能够根据目的适当选择。另外，所述WecA及其直系同源 的活性阻碍剂可以由阻碍WecA及其直系同源的活性的化合物构成。

-其它成分-

作为所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂中的其它成分，没有特别限制，能够从 可在药理学上容许的载体之中根据目的适当选择，例如可以举出添加剂、辅助剂、水 等。这些可以单独使用一种，也可以将两种以上并用。

作为所述添加剂或所述辅助剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可 以举出杀菌剂、保鲜剂、粘结剂、增稠剂、固定剂、粘合剂、着色剂、稳定化剂、pH 调节剂、缓冲剂、等渗化剂、溶剂、抗氧化剂、防紫外线剂、防晶析剂、消泡剂、物 性提高剂、防腐剂等。

作为所述杀菌剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出氯化苄烷铵、 苯索氯铵、十六烷基氯化吡啶鎓等阳离子性表面活性剂等。

作为所述保鲜剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出对羟基苯甲 酸酯类、氯代丁醇、甲酚等。

作为所述粘结剂、增稠剂、固定剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可 以举出淀粉、糊精、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟基乙基纤维素、 羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基淀粉、支链淀粉、海藻酸钠、海藻酸铵、 海藻酸丙二醇酯、瓜尔胶、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、黄原酸胶、凝胶、酪蛋白、聚乙烯醇、 聚环氧乙烷、聚乙二醇、乙烯·丙烯嵌段聚合物、聚丙烯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等。

作为所述粘合剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出水、乙醇、 丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、凝胶液、羧甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基 淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、紫胶、磷酸钙、聚乙烯吡咯烷酮等。

作为所述着色剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出氧化钛、氧 化铁等。

作为所述稳定化剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出黄蓍、阿 拉伯树胶、凝胶、焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、巯基乙酸、硫羟乳酸等。

作为所述pH调节剂或所述缓冲剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以 举出柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠等。

作为所述等渗化剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出氯化钠、 葡萄糖等。

作为所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂中的其它成分的含量，没有特别限制， 能够根据目的适当选择。

＜MurX及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种＞

所述并用抗抗酸菌药中的所述MurX及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂 可以使用任一个，也可以使用两者。

-MurX及其直系同源的活性阻碍剂-

所述并用抗抗酸菌药中的所述MurX及其直系同源的活性阻碍剂至少含有阻碍MurX 及其直系同源的活性的化合物，根据需要进一步含有其它成分。

所述MurX，是指结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)具有的酶(碱基 序列参照序列号5)。所述MurX是与作为细胞壁的构成成分的肽聚糖的合成相关的酶。

作为所述MurX的直系同源，例如可以举出作为牛型分枝杆菌具有的酶的MraY(与 作为细胞壁的构成成分的肽聚糖的合成相关的酶，碱基序列参照序列号6)、作为包皮 垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)具有的酶的MraY(与作为细胞壁的构成成分 作为肽聚糖的合成相关的酶，碱基序列参照序列号7)、作为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有的酶的MraY(与作为细胞壁的构成成分的肽聚糖的合成相关的酶、碱 基序列参照序列号8)等。

--阻碍MurX及其直系同源的活性的化合物--

作为阻碍所述MurX及其直系同源的活性的化合物，没有特别限制，能够根据目的 适当选择，例如可以举出卡普拉霉素(Caprazamycin)类、脂硫霉素(Liposidomycin) 类、胞质霉素(Mureidomycin)类、杀绿霉素(Pacidamycin)类、那普沙霉素(Napsamycin) 类、胞壁霉菌素(Muraymycin)类、FR-900493、己尿啶霉素(Capuramycin)类、A-503083、 噬菌体裂解蛋白质E(LysisproteinEofbacteriophage)等。这些 可以单独使用一种，也可以将两种以上并用。

这些之中，优选卡普拉霉素B、脂硫霉素B、MureidomycinA、胞壁霉菌素A1 (MuraymycinA1)、己尿啶霉素、噬菌体裂解蛋白质E，更优选卡普拉霉素B。

阻碍所述MurX及其直系同源的活性的化合物可以是盐的形式。

作为所述盐，只要是可在药理学上容许的盐，就没有特别限制，能够根据目的适 当选择，例如可以举出乙酸盐、柠檬酸盐等有机盐、盐酸盐、碳酸盐等。

阻碍所述MurX及其直系同源的活性的化合物可以通过化学合成获得，也可以由生 产所述化合物的微生物获得。

阻碍所述MurX及其直系同源的活性的化合物是公知的化合物，其制造方法没有特 别限制，能够适当选择公知的方法。

作为所述卡普拉霉素B的制造方法，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例 如可以举出国际公开第01/012643号中记载的以受托号为FERMBP-7218委托的利用链 霉素(Streptomycessp.)MK730-62F2株来制造的方法。

对于所述链霉素MK730-62F2株，在工业技术院生命工学工业技术研究所(现独立 行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物委托中心(邮政编码292-0818，千叶县 木更津市上总镰足2-5-8))进行了委托申请，于1998年11月27日进行了国内委托 (FERMP-17067)，其后，于2000年7月12日接受了向基于布达佩斯条约的国际委 托的移交请求，以受托号为FERMBP-7218进行了国际委托。

作为所述MurX及其直系同源的活性阻碍剂中阻碍MurX及其直系同源的活性的化 合物的含量，没有特别限制，能够根据目的适当选择。另外，所述MurX及其直系同源 的活性阻碍剂可以由阻碍MurX及其直系同源的活性的化合物构成。

--其它成分--

作为所述MurX及其直系同源的活性阻碍剂中的其它成分，没有特别限制，能够根 据目的适当选择，可以举出与所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂中的其它成分相同 的成分。

作为所述MurX及其直系同源的活性阻碍剂中其它成分的含量，没有特别限制，能 够根据目的适当选择。

-RNA合成阻碍剂-

所述并用抗抗酸菌药中的所述RNA合成阻碍剂至少含有阻碍RNA的合成的化合物， 根据需要进一步含有其它成分。

--阻碍RNA的合成的化合物--

作为阻碍所述RNA的合成的化合物，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例 如可以举出利福平(Rifampicin)、利福霉素SV(RifamycinSV)、利福布汀(Rifabutin) 等。这些可以单独使用一种，也可以将两种以上并用。

这些之中，优选利福平。

阻碍所述RNA的合成的化合物可以是盐的形式。

作为所述盐，只要是可在药理学上容许的盐，就没有特别限制，能够根据目的适 当选择，例如可以举出乙酸盐、柠檬酸盐等有机盐、盐酸盐、碳酸盐等。

阻碍所述RNA的合成的化合物，可以通过化学合成获得，也可以由生产所述化合 物的微生物获得。

阻碍所述RNA的合成的化合物是公知的化合物，其制造方法没有特别限制，能够 适当选择公知的方法。

作为阻碍所述RNA合成阻碍剂中的RNA的合成的化合物的含量，没有特别限制， 能够根据目的适当选择。另外，所述RNA合成阻碍剂可以由阻碍RNA的合成的化合物 构成。

--其它成分--

作为所述RNA合成阻碍剂中的其它成分，没有特别限制，能够根据目的适当选择， 可以举出与所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂中的其它成分相同的成分。

作为所述RNA合成阻碍剂中的其它成分的含量，没有特别限制，能够根据目的适 当选择。

＜其它成分＞

作为所述并用抗抗酸菌药中的其它成分，没有特别限制，能够根据目的适当选择， 可以举出与所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂中的其它成分相同的成分。

作为所述并用抗抗酸菌药中的其它成分的含量，没有特别限制，能够根据目的适 当选择。

＜抗酸菌＞

作为所述抗酸菌，没有特别限制，能够根据目的适当选择，但优选结核分枝杆菌。 作为所述结核分枝杆菌，没有特别限制，能够根据目的适当选择。

＜使用＞

作为所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与MurX及其直系同源的活性阻碍剂 和RNA合成阻碍剂中的至少一种的组合，没有特别限制，能够根据目的适当选择，但 优选CPZEN-45与卡普拉霉素B的组合、衣霉素与利福平的组合，更优选CPZEN-45与 卡普拉霉素B的组合。

所述并用抗抗酸菌药可以仅将所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与MurX及 其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种合并使用，也可以与以其它 成分为有效成分的药品合并使用。

所述并用抗抗酸菌药可以分别将所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与所述 MurX及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种作为单剂的形式并 用，也可以将两者作为一个药剂(合剂)的形式并用。

＜剂型＞

作为所述并用抗抗酸菌药、所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、所述MurX及 其直系同源的活性阻碍剂、和所述RNA合成阻碍剂的剂型，没有特别限制，能够根据 目的适当选择，可以举出固体剂、半固体剂、液体剂等。这些剂型的所述并用抗抗酸 菌药、所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、所述MurX及其直系同源的活性阻碍剂、 和所述RNA合成阻碍剂能够根据常规方法制造。

作为所述并用抗抗酸菌药分别将所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与所述 MurX及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种作为单剂并用的情况 下的剂型，没有特别限制，根据目的适当选择，两者可以为相同的剂型，也可以为不 同的剂型。

-固体剂-

作为所述固体剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，用作内用剂的情况下，例 如可以举出片剂、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片、糖锭、滴剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗 粒剂、粉剂、丸剂、干糖浆剂、浸剂等。

所述固体剂用作外用剂的情况下，例如可以举出栓剂、泥敷剂、硬膏剂等。

-半固体剂-

作为所述半固体剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，用作内用剂的情况下， 例如可以举出舐剂(煎膏剂)、咀嚼胶剂、蓬松胶剂(whippingagent)、胶冻剂等。

所述半固体剂用作外用剂的情况下，例如可以举出软膏剂、乳膏剂、摩丝剂、吸入剂、 Nazar凝胶剂等。

-液体剂-

作为所述液体剂，没有特别限制，能够根据目的适当选择，用作内用剂的情况下，例 如可以举出糖浆剂、饮剂、悬浮剂、醑剂等。

所述液体剂用作外用剂的情况下，例如可以举出液剂、滴眼剂、气雾剂、喷雾剂等。

＜给药＞

作为所述并用抗抗酸菌药、所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、所述MurX及 其直系同源的活性阻碍剂、和所述RNA合成阻碍剂的给药方法、给药量、给药时间、 和给药对象，没有特别限制，能够根据目的适当选择。

作为所述给药方法，例如可以举出局部给药法、肠道给药法、非口服给药法等。

作为所述并用抗抗酸菌药分别将所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与所述 MurX及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种作为单剂并用的情况 下的给药方法，没有特别限制，能够根据目的适当选择，两者可以为相同的给药方法， 也可以为不同的给药方法。

作为所述给药量，没有特别限制，能够考虑给药对象个体的年龄、体重、体质、症状、 是否给予以其它成分为有效成分的药品、药剂等各种各样的要因来适当选择。

作为所述并用抗抗酸菌药中的所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与所述MurX 及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种的给药量之比，没有特别 限制，能够根据目的适当选择。

作为所述给药时间，没有特别限制，能够根据目的适当选择。

所述并用抗抗酸菌药可以将所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂、与所述MurX 及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种在同时期给药，也可以在 不同时期给药。

作为成为所述给药对象的动物种类，没有特别限制，能够根据目的适当选择、例如可 以举出人、猴、猪、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、鸟等，这些之中优选用于人。

(治疗方法)

所述并用抗抗酸菌药能够通过对感染了抗酸菌的个体给药来治疗感染了抗酸菌的 个体。因此，本发明也涉及对感染了抗酸菌的个体进行治疗的方法，其特征在于，对 个体给予所述并用抗抗酸菌药。所述治疗方法在所述抗酸菌之中优选用于结核分枝杆 菌。

(抗抗酸菌药的筛选方法)

本发明的抗抗酸菌药的筛选方法至少包含活性测定工序，根据需要包含其它工序。

＜活性测定工序＞

所述活性测定工序是对被检验物质针对WecA及其直系同源的活性进行测定的工 序。

针对所述WecA及其直系同源的被检验物质的活性，可以是阻碍WecA及其直系同 源的酶活性的活性，也可以是抑制wecA基因及其直系同源基因的表达的活性。

作为所述被检验物质，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出微 生物生产的化合物、该化合物的衍生物、植物提取物、蛋白质等。

作为对针对所述WecA及其直系同源的被检验物质的活性进行测定的方法，没有特 别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出对WecA及其直系同源的酶活性进行测 定的方法、对wecA基因及其直系同源基因的表达量进行测定的方法等。

作为所述WecA及其直系同源的酶活性进行测定的方法，没有特别限制，能够根据 目的适当选择，例如可以举出利用表达所述WecA及其直系同源的菌株的菌体破碎液来 测定的方法。

作为表达所述WecA及其直系同源的菌株，没有特别限制，能够根据目的适当选择， 例如可以举出导入了所述WecA及其直系同源的基因的枯草菌等。作为导入所述WecA 及其直系同源的基因的方法，没有特别限制，能够适当选择公知的方法，例如可以举 出将插入了所述WecA及其直系同源的基因的质粒导入到枯草菌中的方法。

作为所述菌体破碎液的制备方法，只要能够将菌体破碎，就没有特别限制，能够 适当选择公知的方法。

作为利用所述菌体破碎液测定WecA及其直系同源的酶活性的方法，没有特别限制， 能够根据目的适当选择，例如能够通过以下方式测定：对所述WecA及其直系同源的底 物(substrate)进行放射标记，使该放射标记了的底物含在所述菌体破碎液中，使其 反应后，通过薄层色谱法、和放射自显影术检测反应物。作为所述底物，例如可以举 出UDP-GlcNAc。

作为对所述wecA基因及其直系同源基因的表达量进行测定的方法，没有特别限制， 能够根据目的适当选择，例如可以举出使被检验物质与具有wecA基因及其直系同源基 因的抗酸菌作用来测定该抗酸菌中的wecA基因及其直系同源基因的表达量的方法。

作为使所述被检验物质作用的方法，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例 如可以举出使所述被检验物质包含在所述抗酸菌的培养基中的方法等。

作为所述wecA基因及其直系同源基因的表达量，可以为mRNA的表达量，也可以 为蛋白质的表达量。

所述mRNA的表达量和蛋白质的表达量的测定方法能够适当选择公知的方法。例如 所述mRNA的表达量能够通过实时PCR(RealtimePCR)法进行测定，所述蛋白质的表 达量能够通过Western印迹法(Westernblotting)来测定。

＜其它工序＞

作为所述其它工序，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出评价 工序等。

所述评价工序是指，由所述活性测定工序中得到的结果来评价所述WecA及其直系 同源的活性是否被所述被检验物质阻碍的工序。

在所述评价工序中，作为评价所述被检验物质是否阻碍所述WecA及其直系同源的 活性的方法，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如在所述活性测定工序中， 与没有使所述被检验物质作用的情况(对照)相比较，在使所述被检验物质作用的情 况，所述WecA及其直系同源的酶活性降低、或所述wecA基因及其直系同源基因的表 达量降低的情况下，能够评价所述被检验物质阻碍了所述WecA及其直系同源的活性， 认为所述被检验物质可以用作抗抗酸菌药。

另外，在所述活性测定工序中，作为对照，与使所述CPZEN-45和所述衣霉素中的 至少一种作用的情况相比较，在使所述被检验物质作用的情况，所述WecA及其直系同 源的酶活性降低、或所述wecA基因及其直系同源基因的表达量降低的情况下，能够评 价所述被检验物质与所述CPZEN-45和所述衣霉素中的至少一种相比，阻碍了所述WecA 及其直系同源的活性，认为所述被检验物质作为抗抗酸菌药更有用。

所述抗抗酸菌药的筛选方法能够优选用作药剂针对结核分枝杆菌的筛选方法。

(WecA及其直系同源的活性阻碍剂)

作为本发明的WecA及其直系同源的活性阻碍剂，至少含有下述结构式(1)表示 的化合物，可以优选举出根据需要进一步含有其它成分的活性阻碍剂。

[化学式3]

所述WecA及其直系同源，与所述并用抗抗酸菌药的WecA及其直系同源的活性阻 碍剂中的记载相同。

所述结构式(1)表示的化合物是所述CPZEN-45，可以是盐的形式。

作为所述盐，只要是可在药理学上容许的盐，就没有特别限制，能够根据目的适 当选择，例如可以举出乙酸盐、柠檬酸盐等有机盐、盐酸盐、碳酸盐等。

所述CPZEN-45可以通过化学合成获得，也可以由生产所述化合物的微生物获得。

作为所述CPZEN-45的制造方法，没有特别限制，能够根据目的适当选择，可以举 出与所述并用抗抗酸菌药的WecA及其直系同源的活性阻碍剂中的记载相同的方法。

作为所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂中的CPZEN-45的含量，没有特别限制， 能够根据目的适当选择。另外，所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂可以由所述 CPZEN-45构成。

所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂可以含有所述CPZEN-45以外的阻碍WecA及 其直系同源的活性的化合物。作为所述CPZEN-45以外的阻碍WecA及其直系同源的活 性的化合物，没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以举出衣霉素 (Tunicamycin)等。

作为所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂中的其它成分，没有特别限制，能够根 据目的适当选择，可以举出与所述并用抗抗酸菌药的WecA及其直系同源的活性阻碍剂 中的记载相同的成分。

作为所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂中的其它成分的含量，没有特别限制， 能够根据目的适当选择。

＜用途＞

所述WecA及其直系同源的活性阻碍剂具有优异的WecA及其直系同源的活性阻碍 作用，因此例如能够优选用作上述本发明的并用抗抗酸菌药的有效成分。另外，例如 也能够优选用作以上述本发明的抗抗酸菌药的筛选方法为指标的试剂等。

实施例

下面，举出制造例、试验例对本发明具体地进行说明，但本发明不受这些制造例、 试验例任何限定。

(制造例1)

＜结构式(2)表示的化合物的制造＞

所述结构式(2)表示的化合物(卡普拉霉素B)使用以FERMBP-7218为受托号委 托的链霉素MK730-62F2株，与国际公开第01/012643号的实施例1同样地制造。

-卡普拉霉素B的物理化学性质-

所述卡普拉霉素B的物理化学性质如下，可确认所述卡普拉霉素B具有下述结构 式(2)表示的结构。

(1)外观：无色粉末

(2)分子式：C₅₃H₈₇N₅O₂₂

(3)高分辨质谱分析(HRFABMS：阴离子模式)：

实验值：1144.5750(M-H)^-

计算值：1144.5764

(4)比旋光度：[α]_D²³-2.6°(c0.91，DMSO)

(5)紫外线吸收光谱(甲醇中)：

甲醇溶液中测定的紫外线吸收的峰如下。

λmaxnm(ε)：261(8，000)

图1中示出了紫外线吸收光谱。

(6)红外线吸收光谱：

图2中示出了经KBr片剂法测定的红外线吸收光谱。

(7)质子核磁共振光谱：

将在600MHz中重二甲基亚砜：重水(＝10：1)的混合溶剂中在室温下测定的 质子NMR光谱示于图3。

(8)碳13核磁共振光谱：

将在150MHz中重二甲基亚砜：重水(＝10：1)的混合溶剂中在室温下测定的 碳13NMR光谱示于图4。

(9)溶解性：

在甲醇、DMSO、水中可溶，在丙酮、乙酸乙酯中不溶。

(10)TLC：

通过硅胶60F₂₅₄(Merck公司制)的薄层色谱法以丁醇：甲醇：水(4：1：2)的 溶剂展开时的Rf值为0.44。

[化学式4]

结构式(2)中，“Me”表示甲基。

(制造例2)

＜结构式(1)表示的化合物的制造＞

所述结构式(1)表示的化合物(CPZEN-45)与日本特开2010-83847号公报的实 施例1同样地进行，制造CPZEN-45的三氟乙酸盐的无色结晶。

-CPZEN-45的物理化学的性质-

所述CPZEN-45的三氟乙酸盐的物理化学性质如下，可确认所述CPZEN-45具有下 述结构式(1)表示的结构。

(1)熔点：175℃-177℃(分解)

(2)比旋光度：[α]_D²²+79°(c1，MeOH)

(3)质谱(ESI-MS)：

m/z801[M+CF₃COOH-H]^-

(4)¹⁹F-NMR光谱(376.5MHz，重DMSO中，氟利昂11内标)：δ-73.86(s,CF₃)

(5)质子核磁共振光谱(500MHz，重水中，TMS内标)：

将质子核磁共振光谱示于图5。

(6)碳13核磁共振光谱(125.8MHz，重水中，TMS内标)：

将碳13核磁共振光谱示于图6。

[化学式5]

(试验例1：CPZEN-45与卡普拉霉素B的抗菌活性比较)

关于卡普拉霉素B和CPZEN-45的对各种菌的抗菌作用，通过测定MIC来试验。将 结果示于表1。

＜MIC(最小抑菌浓度)的测定＞

-分枝杆菌(Mycobacteria)-

针对所述分枝杆菌(Mycobacteria)的MIC通过琼脂稀释法(Agardilutionmethod) 测定。具体而言，将菌接种到以2倍稀释系列制备而得含有药剂的培养基(含有甘油 和OADC的7H10琼脂培养基)，在37℃下培养2天～14天而测定。

-除分枝杆菌(Mycobacteria)以外的微生物-

针对除所述分枝杆菌(Mycobacteria)以外的微生物的MIC通过琼脂稀释法(Agar dilutionmethod测定。具体而言，将菌接种到以2倍稀释系列制备而得的含有药剂的 培养基(Mueller-Hinton琼脂培养基)中，在37℃下培养18小时而测定。

[表1]

由表1，可观察到就卡普拉霉素B与CPZEN-45而言，例如在针对金黄葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)FDA209P株的抗菌活性中是不同的。因此推测两者的抗菌 作用机制不同。

另外，CPZEN-45对不是WecA的直系同源繁殖必需的金黄葡萄球菌FDA209株、和 金黄葡萄球菌(Staph.aureus)MRSANo.5株、以及不具有WecA的直系同源的肺炎链 球菌(Streptococcuspneumoniae)S-223株、和肺炎链球菌(Str.pneumoniae)CR-2 株不显示抗菌活性。

(试验例2：枯草杆菌(B.subtilis)168株中的高分子合成)

利用对CPZEN-45、和卡普拉霉素B显示与结核分枝杆菌类似的易感性的枯草菌的 枯草杆菌(B.subtilis)168株(由ATCC获得)，按以下方式将给予含有以下各药剂 的药剂溶液时的高分子合成进行试验。

＜药剂＞

·CPZEN-45(制造例2中制造而得的)

·卡普拉霉素B(制造例1中制造而得的)

·衣霉素

·万古霉素

·左氧氟沙星

＜试验方法＞

对于枯草菌枯草杆菌(B.subtilis)168株，用营养肉汤(Nutrientbroth，NB 培养基)、在温度为37℃、振荡速度为140spm下培养到对数期(OD600＝0.2)，制备 菌液。

在96孔板中加入以2倍稀释系列制备而得的所述药剂溶液0.01mL和菌液0.09mL 并混和，在37℃下静置培养5分钟。

所述培养后，加入以下述浓度制备而得的进行了放射标记的化合物(以下有时称 为“放射标记化合物”)0.01mL，在37℃下进一步静置培养10分钟。

其后，加入10％三氯乙酸水溶液0.1mL，将菌体的高分子成分不溶化，接着，移 至带有过滤器的96孔板中，过滤液体成分后，用5％三氯乙酸水溶液0.2mL洗涤过滤 器3次。

干燥后，用液体闪烁计数器(Tricurve2800TR，PerkinElmer公司)测定在过 滤器上残留的放射活性来评价菌体的高分子合成量。将结果示于图7A～图7E。

-放射标记化合物-

·0.1μCi/μLN-acetyl-D-[1-¹⁴C]glucosamine(N-乙酰基-D-[1-¹⁴C]葡 糖胺，用于评价肽聚糖合成，以下有时称为“N-acetyl-D-glucosamine”。)

·0.01μCi/μL[¹⁴C(U)]glycerol([¹⁴C(U)]甘油，用于评价磷壁质 酸合成，以下有时称为“Glycerol”。)

·1μCi/μL[1-¹⁴C]acetate([1-¹⁴C]乙酸酯，用于评价细胞膜脂肪酸合 成，以下有时称为“Aceticacid(乙酸)”。)

·1μCi/μL[methyl-³H]thymidine([methyl-³H]胸腺嘧啶，用于评价DNA 合成，以下有时称为“Thymidine”。)

·1μCi/μL[5，6-³H]uridine([5，6-³H]尿苷，用于评价RNA合成，以 下有时称为“Uridine”。)

·5μCi/μLL-[4，5-³H]leucine(L-[4，5-³H]亮氨酸，用于评价蛋白质 合成，以下有时称为“Leucine”。)

图7A表示将CPZEN-45用作药剂的情况、图7B表示将卡普拉霉素B用作药剂的情 况、图7C表示将衣霉素用作药剂的情况、图7D表示将万古霉素用作药剂的情况、图 7E将左氧氟沙星用作药剂的情况的结果。应予说明，图7A～图7E中，“■”表示 [methyl-³H]thymidine的掺入量、“◆”表示[5，6-³H]uridine的掺入量、“▲” 表示L-[4，5-³H]leucine的掺入量、“×”表示[1-¹⁴C]acetate的掺入量、“●” 表示N-acetyl-D-[1-¹⁴C]glucosamine的掺入量、“+”表示[¹⁴C(U)]glycerol 的掺入量。

由图7A，可确认在CPZEN-45的存在下，阻碍作为细胞壁的主要构成成分之一、作 为磷壁质酸的构成成分的甘油掺入到菌体中。如图7C所示，这与已知阻碍枯草杆菌(B. subtilis)中的TagO(WecA的直系同源)的衣霉素是相同的结果。

另外，由图7B，可确认在阻碍枯草杆菌(B.subtilis)中的MraY(MurX的直系 同源)卡普拉霉素B的存在下，阻碍作为肽聚糖的构成成分的N-acetyl-D-glucosamine 掺入到菌体中。如图7D所示，这与具有相同阻碍活性的万古霉素是相同的结果。

应予说明，如图7E所示，阻碍DNA合成的左氧氟沙星与CPZEN-45、卡普拉霉素B、 衣霉素、万古霉素是不同的结果。

(试验例3-1：药剂耐受性菌的制作和基因型的确定)

将枯草菌的枯草杆菌(B.subtilis)168株(由ATCC获得)用作亲株，按以下方 式制作具有对卡普拉霉素B或CPZEN-45的耐受性的耐受性菌，确认其基因型。

＜耐受性菌的制作＞

将枯草菌枯草杆菌(B.subtilis)168株用作亲株。

将所述枯草杆菌(B.subtilis)168株以终浓度为1％的方式接种到含有MIC的 1/8倍浓度～4倍浓度的药剂(卡普拉霉素B或CPZEN-45)的营养肉汤(Nutrientbroth， NB培养基)中，在37℃、141spm下静置培养24小时。

将在MIC的1/4倍浓度的药剂存在下繁殖而得的菌的培养液用作接种源，再次在 相同条件下进行培养。

继续直到MIC超过亲株的128倍，制作成耐受性菌。

-MIC(最小抑菌浓度)的测定-

所述MIC通过微量肉汤稀释法(microbrothdilutionmethod)测定。具体而言， 将LBbroth(LB培养基)用作培养基，于96孔板中在以2倍稀释系列制备药剂而得 的溶液0.1mL中加入菌液0.1mL并混和，在37℃下培养16小时测定。

应予说明，作为药剂，也对衣霉素和万古霉素进行测定。将结果示于表2。

-基因型的确定-

按以下方式确定所述亲株和耐受性菌的mraY基因、和tagO基因的基因型。将结 果示于表2。

以所述亲株和耐受性菌的基因组DNA为模板，通过PCR法将mraY基因和tagO基 因片段扩增，通过琼脂糖凝胶电泳取得两基因的基因片段。得到的基因片段的序列通 过DNA序列分析仪(ABI3730AppliedBiosystems)确定。

用于扩增mraY基因的引物的序列如下。

5’末端侧：5’-AGGACATGAAACCTATCAGCAG-3’(序列号9)

3’末端侧：5’-TCTCCGCAAACAACTTCGATTC-3’(序列号10)

用于扩增tagO基因的引物的序列如下。

5’末端侧：5’-CCGGACACAAGATTGGAATTGC-3’(序列号11)

3’末端侧：5’―AGCAGCACAAGCTCAAACAAC-3’(序列号12)

[表2]

表2中，“168”表示亲株，“CPZB”表示卡普拉霉素B，“TUN”表示衣霉素，“VCM” 表示万古霉素，“WT”表示野生型。

由表2，可确认对于CPZEN-45耐受性株，作为编码TagO的基因的tagO中存在具 有突变的株。因此，认为CPZEN-45以TagO为靶点。

(试验例3-2：靶点基因的研究)

按以下方式制作高表达mraY基因或tagO基因的株，测定该株的MIC。

＜高表达mraY基因或tagO基因的株的制作＞

利用市售品的质粒pHY300PLK(TakaraBio公司制)、pHT01(独MoBiTec公司制)， 制作可由枯草菌复制的质粒“pHYcat”。将所述pHYcat的概要示于图8。

对于所述质粒“pHYcat”，将所述pHY300PLK、和所述pHT01两者用限制酶BanI、 和PvuⅡ处理，将该结果得到的pHY300PLK的2,848bp的DNA片段、和pHT01的2,149bp 的DNA片段进行连接，由此获得。

将所述“pHYcat”经限制酶NheI处理后，在通过绿豆核酸酶使末端平滑化而得的 片段上插入以枯草菌枯草杆菌(B.subtilis)168株的基因组DNA为模板、在与确定 所述基因型时相同的条件下经PCR扩增而得的mraY基因或tagO基因，制作 “pHYcat-mraY”和“pHYcat-tagO”的质粒。

将所述“pHYcat-mraY”或“pHYcat-tagO”导入到枯草菌枯草杆菌(B.subtilis) 168株中，制作mraY高表达株(以下有时称为“168/pHYcat-mraY株”)和tagO高表 达株(以下有时称为“168/pHYcat-tagO株”)。另外，制作在枯草菌枯草杆菌(B. subtilis)168株中导入有pHYcat的株作为对照株。

-MIC(最小抑菌浓度)的测定-

利用所述制作而得的3株与试验例3-1同样地进行测定MIC。将结果示于表3。

[表3]

表3中，“168/pHYcatA”表示导入了“pHYcat”的株，“168/pHYcat-mraY”表 示导入了“pHYcat-mraY”的株，“168/pHYcat-tagO”表示导入了“pHYcat-tagO”的 株，“CPZB”表示卡普拉霉素B，“TUN”表示衣霉素，“VCM”表示万古霉素。

由表3，可确认mraY基因高表达株具有针对卡普拉霉素B的耐受性，但针对 CPZEN-45不具有耐受性。还可确认tagO基因高表达株不具有针对卡普拉霉素B的耐受 性，但具有针对CPZEN-45的耐受性。另外，可确认tagO基因高表达株针对已知阻碍 TagO的酶活性的衣霉素也具有耐受性。因此，由试验例3-2的结果也可认为CPZEN-45 以TagO为靶点。

另外，认为上述结果也整合了试验例1中、CPZEN-45对不是WecA的直系同源繁殖 必需的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)FDA209株、和金黄色葡萄球菌(Staph. aureus)MRSANo.5株、以及不具有WecA的直系同源的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)S-223株、和肺炎链球菌(Str.pneumoniae)CR-2株不显示抗菌活性。

(试验例4：酶活性评价)

关于MraY和TagO两酶的活性，利用使它们高表达的、所述试验例3-2中制造而 得的168/pHYcat-mraY株、和168/pHYcat-tagO株的菌体破碎液，按以下方式测定。

另外，关于衣霉素、万古霉素、和左氧氟沙星也同样地进行试验作为对照。

＜酶液的制备＞

将LB培养基中培养到对数期(OD600＝0.4)的菌通过离心分离收集(5,000rpm， 10分钟)，用TMS缓冲(50mMTris-HCl(pH7.5)、625mMsucrose、10mMMgCl₂、 5mM3-mercapto-1,2-propanediol、1mMPMSF)洗涤2次。

接着，在1/40体积的TMS缓冲中再悬浊，通过探头超声将菌体破碎(在冰上重复 10次破碎30秒钟、静置30秒钟)，离心分离(3,000rpm，10分钟)除去未破碎的菌， 上清为酶液。

-TagO的活性测定-

TagO的活性测定通过使下述反应液0.02mL在30℃的温度反应1小时而进行。

反应后，加入0.2mL的三氯甲烷-甲醇(2：1)溶液，由此使反应停止，离心分离 (15,000rpm，3分钟)。

接着，将含有反应物的下层通过薄层色谱法(TLC，展开溶剂使用三氯甲烷：甲醇： 水：浓氨水＝65：35：4：4)、和放射自显影术进行分析，由相对于对照的比率计算 出TagO的酶活性。将结果示于图9A。

--反应液--

·酶液250ng总蛋白(totalprotein)/μL

·125μMundecaprenylphosphate

·20μMUDP-GlcNAc

·0.05μCi/μLUDP-GlcNAc,[glucosamine-6-³H]^-

·100mMTris-HCl

·20mMMgCl₂

·1％CHAPS

-MraY的活性测定-

MraY的活性测定通过使下述反应液0.02mL在30℃的温度下反应20分钟而进行。

反应后，通过加入0.02mL的反应停止液(丁醇：在冰醋酸中溶解有吡啶(终浓度 6M)的物质＝2：1(体积比))使反应停止，离心分离(15,000rpm，3分钟)。

接着，将含有反应物的下层通过薄层色谱法(TLC、展开溶剂使用三氯甲烷：甲醇： 水：浓氨水＝88：48：4：1)、和放射自显影术进行分析，由相对于对照的比率计算 出MraY的酶活性。将结果示于图9B。

--反应液--

·酶液20ng总蛋白(totalprotein)/μL

·50μMundecaprenylphosphate

·0.02μCi/μLundecaprenylphosphate、[1-³H]^-

·50μMUDP-MurNAc-pentapeptide

·100mMTris-HCl

·20mMMgCl₂

·10mMTritonX-100

图9A和9B中，“◆”表示CPZEN-45的结果，“■”表示卡普拉霉素B的结果， “▲”表示衣霉素的结果，“×”表示万古霉素的结果，“＊”表示左氧氟沙星的结 果。

由图9A和9B的结果，TagO的酶活性最受CPZEN-45阻碍，MraY的酶活性最受卡 普拉霉素B阻碍。因此，由试验例4的结果也可认为CPZEN-45以TagO为靶点。

(试验例5：CPZEN-45针对包皮垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的WecA 的阻碍活性)

将CPZEN-45针对与结核分枝杆菌近缘的包皮垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的WecA的阻碍活性按以下方式进行试验。

＜酶液的制备＞

将包皮垢分枝杆菌(M.smegmatis)mc²155株(由ATCC获得)在甘油-丙氨酸培 养基中培养到对数期，将其菌体10g在30mL的A缓冲中悬浊，用超音波破碎机(Soniprep 150；MSELtd.，Crawley，Sussex，UnitedKingdom；1cmprobe)在冰上重复10次 破碎60秒钟，静置90秒钟的操作。以4℃、27,000g离心该菌体破碎液12分钟后， 进一步以4℃、100,000g离心上清60分钟，由此获得含有WecA的细胞膜部分。将所 述细胞膜部分在适量的A缓冲中再悬浊，其为酶液。

-甘油-丙氨酸培养基-

将甘油20mL、酪胨(Bactocasitone，Difco公司制)0.3g、柠檬酸铁(Ⅲ)铵0.05g、 磷酸氢二钾4.0g、柠檬酸2.0g、L-丙氨酸1.0g、氯化镁六水合物1.2g、硫酸钾0.6g、 氯化铵2.0g、Tween800.2g、和AntifoamA(DowCorning公司制)0.05g溶解在1L 的去离子水中，用NaOH将pH调到6.6。

-A缓冲-

50mMMOPS(用KOH将pH调到8.0)、5mM2-mercaptoethanol、10mMMgCl₂。

＜WecA的酶活性的测定＞

在下述酶反应液(液量0.1mL)中规定量添加所述CPZEN-45，在37℃下静置1小 时，由此进行酶反应。接着，加入1mL的三氯甲烷-甲醇(2：1)溶液使反应停止，剧 烈搅拌，由此将反应生成物提取到有机层中。将适量所述反应生成物供与薄层色谱法 (TLC)，通过放射自显影术检测。将结果示于图10。

-酶反应液-

在0.1mL的所述A缓冲中含有所述酶液(1mg蛋白质相当分)、ATP60μM、和[¹⁴C] -UDP-GlcNAc0.01μCi/μL的液体。

图10中，“1”～“10”依次表示使CPZEN-45的添加量为、0μg/mL、0.00019125 μg/mL、0.0003825μg/mL、0.000765μg/mL、0.00153μg/mL、0.00306μg/mL、0.00611 μg/mL、0.01221μg/mL、0.02441μg/mL、0.048828μg/mL的情况下的结果，“SF” 表示展开溶剂的上端，“Orig.”表示原点。

将放射自显影术定量化而得的结果、IC₅₀计算出为0.0044μg/mL，可确认CPZEN-45 阻碍作为与结核分枝杆菌近缘的包皮垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的WecA。

将枯草杆菌(B.subilis)的TagO、与包皮垢分枝杆菌(M.smegmatis)的WecA、 与结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的WecA的氨基酸序列的相同性示于表4。枯草杆 菌(B.subilis)的TagO与包皮垢分枝杆菌(M.smegmatis)的WecA是催化相同反 应的酶。另外，如下述表4中所记载，枯草杆菌(B.subilis)的TagO和包皮垢分枝 杆菌(M.smegmatis)的WecA、与结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的WecA分别具 有35.7％、86.0％的相同性。进而这些酶极其良好地保留了酶反应所必需的区域的氨 基酸序列。即，这些酶彼此是直系同源。

因此，认为由CPZEN-45带来的抗菌作用通过以结核分枝杆菌的WecA及其直系同 源为靶点而发挥。

[表4]

(试验例6：WecA及其直系同源阻碍剂与、MurX及其直系同源的活性阻碍剂和RNA 合成阻碍剂中的至少一种的相乘效果)

将包皮垢分枝杆菌(M.smegmatis)607株(由ATCC获得)用作菌株，通过下述 药剂的并用，按以下方式测定MIC、计算出FICindex，由此试验是否获得相乘效果。 将结果示于图11A～图11C。

＜MIC(最小抑菌浓度)的测定＞

所述MIC通过微量肉汤稀释法(microbrothdilutionmethod)来测定。具体 而言，将含OADC的7H9broth培养基用作培养基，于96孔板中在以2倍稀释系列制备 1种或2种药剂而得的溶液0.1mL中加入菌液0.1mL并混和，在37℃下培养3天测定。

＜药剂的组合(药剂A和药剂B＞

(1)药剂A：CPZEN-45(WecA及其直系同源的活性阻碍剂)、药剂B：卡普拉霉 素B(MurX及其直系同源的活性阻碍剂)

(2)药剂A：衣霉素(WecA及其直系同源的活性阻碍剂)、药剂B：利福平(RNA 合成阻碍剂)

(3)药剂A：卡普拉霉素B(MurX及其直系同源的活性阻碍剂)、药剂B：利福 平(RNA合成阻碍剂)

＜FICindex(Fractionalinhibitoryconcentrationindex)＞

FICindex由下述式(1)计算出。

FICindex＝(药剂A的FIC+药剂B的FIC)的最小值···式(1)

药剂A的FIC＝药剂A与药剂B的组合中的MIC/单独药剂A中的MIC

药剂B的FIC＝药剂B与药剂A组合中的MIC/单独药剂B中的MIC

由所述FICindex的数值，能够判断由药剂并用带来的效果。

FICindex≦0.5···是相乘效果(synergetic)。

0.5＜FICindex≦1···是相加效果(additive)。

1＜FICindex≦2···是无关系(indifferent)。

FICindex＞2···是拮抗作用(antagonistic)。

图11A表示CPZEN-45与卡普拉霉素B的组合的结果，(纵轴：CPZEN-45、横轴： 卡普拉霉素B)，图11B表示衣霉素与利福平的组合(纵轴：衣霉素、横轴：利福平) 的结果，图11C表示卡普拉霉素B与利福平的组合(纵轴：卡普拉霉素B、横轴：利福 平)的结果。另外，图11A～图11C中，着色部分表示“可繁殖(viable)”，未着色 部分表示“不可繁殖(non-viable)”。

由图11A～图11C的结果，可确认CPZEN-45(WecA及其直系同源的活性阻碍剂) 与卡普拉霉素B(MurX及其直系同源的活性阻碍剂)的组合(FICindex＝0.095～ 0.375)、衣霉素(WecA及其直系同源的活性阻碍剂)与利福平(RNA合成阻碍剂)的 组合(FICindex＝0.281)为由并用带来的相乘效果。

另一方面，无法确认卡普拉霉素B(MurX及其直系同源的活性阻碍剂)与利福平 (RNA合成阻碍剂)的组合(FICindex＝1～2)为相乘效果。

由以上可知，通过将WecA及其直系同源阻碍剂与MurX及其直系同源的活性阻碍 剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种并用而获得非常优异的抗抗酸菌作用。

受托号

FERMBP-7218

作为本发明的形式，例如可以举出以下等。

＜1＞一种并用抗抗酸菌药，其特征在于，将WecA及其直系同源的活性阻碍剂、 与MurX及其直系同源的活性阻碍剂和RNA合成阻碍剂中的至少一种并用。

＜2＞根据所述＜1＞所述的并用抗抗酸菌药，其中，WecA及其直系同源的活性阻 碍剂含有下述结构式(1)表示的化合物，MurX及其直系同源的活性阻碍剂含有下述结 构式(2)表示的化合物。

[化学式6]

[化学式7]

结构式(2)中，“Me”表示甲基。

＜3＞根据所述＜1＞所述的并用抗抗酸菌药，其中，WecA及其直系同源的活性阻 碍剂含有衣霉素，RNA合成阻碍剂含有利福平。

＜4＞根据所述＜1＞～＜3＞中任一项所述的并用抗抗酸菌药，其中，抗酸菌是结 核分枝杆菌。

＜5＞一种抗抗酸菌药的筛选方法，其特征在于，包含对针对WecA及其直系同源 的被检验物质的活性进行测定的工序。

＜6＞根据＜5＞所述的抗抗酸菌药的筛选方法，其中，抗酸菌是结核分枝杆菌。

＜7＞一种WecA及其直系同源的活性阻碍剂，其特征在于，含有下述结构式(1) 表示的化合物。

[化学式8]

产业上的可利用性

本发明的并用抗抗酸菌药对抗酸菌具有优异的药效，能够很好地用于治疗感染了 现在成为非常大的问题的结核分枝杆菌的患者。

根据本发明的筛选方法，能够获得具有优异的抗抗酸菌作用的抗抗酸菌药。

本发明的WecA及其直系同源的活性阻碍剂可以很好地用作所述抗抗酸菌药的有效 成分、本发明的筛选方法中的试剂。