利用近红外光谱测定微生物发酵产抗生素过程中多种营养成分和抗生素效价变化的方法

摘要

本发明提供一种利用近红外光谱同时测定微生物发酵产抗生素过程中的多种营养成分和抗生素效价变化的方法，具体为：利用近红外光谱技术对不同发酵周期的抗生素（包含有金霉素、土霉素、新霉素等发酵型抗生素）发酵液进行采集光谱，同时对每一个采集的样品进行化学方法检测，得到不同营养成分含量和抗生素效价变化的理化数据，将采集的近红外光谱和理化数据进行拟合建立模型。经过验证，该模型适用于不同周期抗生素发酵液中营养成分含量和抗生素效价变化的检测。该方法可以快速反馈和了解发酵情况，及时进行营养补充和工艺控制，并对抗生素效价的变化情况进行监控，且整个检测过程高效、节约、无污染。

说明书

技术领域

本发明属于近红外光谱技术领域，具体涉及一种利用近红外光谱同时测定微生物发酵产抗生素过程中的多种营养成分含量和抗生素效价变化的方法。

背景技术

现有的检测发酵液中多种营养成分含量变化和抗生素效价变化的方法需要根据不同的成分进行不同的预处理，使用不同的仪器进行检测，如检测pH值需要pH测定仪，检测总糖需要测糖仪，检测氨基氮需要使用甲醛进行反应并用氢氧化钠进行滴定，检测抗生素效价需要经过滤、加酸、煮沸、定容等再用分光光度计测定等等。现有的检测方法处理繁琐，耗费大量人力、物力和时间，而且使用大量化学试剂，对环境造成一定的污染。

公开号为CN2881620A的专利申请公开了一种抗生素效价自动分析仪，包括抑菌圈测量装置以及外设PC机用于测量抑菌斑直径，并自动判别结果、打印报告；其发明了自动测量效价抑菌圈的装置，仅在测效价装置上改动，并不能用于其它成分的检测，因此不能从根本上简化发酵液营养成分和抗生素效价的检测过程。公开号为CN102023140A的专利文献公开了一种NIR技术测定1-2丙二醇含量的方法，其运用近红外光谱技术测定1-2丙二醇，但测定物质不涉及生物发酵过程变化，测定成分较少。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用近红外光谱同时测定微生物发酵产抗生素过程中的多种营养成分和抗生素效价变化的方法。该方法可以快速反馈和了解发酵情况，及时进行营养补充和工艺控制，并对抗生素效价的变化情况进行监控，且整个检测过程高效、节约、无污染。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用近红外光谱测定微生物发酵产抗生素过程中多种营养成分和抗生素效价变化的方法，其包括如下步骤：

1）在微生物发酵产抗生素过程中的不同时间点进行取样；

2）采用漫反射方式获取每个样品的近红外光谱，同时测定每个样品的理化指标，获得理化检测数据；所述理化指标包括各营养成分的含量和抗生素效价；

3）对采集到的近红外光谱数据进行预处理，并结合主成分分析法（PCA）和偏最小二乘法计算得到近红外光谱数据与理化检测数据的拟合方程，即建立发酵液模型，利用该发酵液模型实现微生物发酵产抗生素过程中营养成分含量和抗生素效价变化的测定。

具体的，步骤2）中的营养成分包括总糖、氨基氮和氨基酸。

进一步，步骤3）具体为：利用计算机软件和化学计量学方法对采集到的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理（MSC）、一级导数预处理、平滑预处理或矢量归一预处理，并结合主成分分析法（PCA）和偏最小二乘法（PLS）计算得到近红外光谱数据与理化检测数据的拟合方程，即建立发酵液模型；然后通过交叉验证相关系数（1-VR）、交叉验证标准方差（SECV）两个指标的评价，选择交叉验证相关系数相对较大、交叉验证标准方差相对较小的模型确定为最终发酵液模型，利用该最终发酵液模型实现微生物发酵产抗生素过程中营养成分含量和抗生素效价变化的测定。在实际生产过程中，最终发酵液模型可预先经理化指标在线检测进行验证后，即可投入使用。

主成分分析法（PCA）利用降维的思想，把多指标转化为少数几个综合指标，将光谱中的有效信息提取出来。不同周期抗生素发酵液由于原辅料的使用会有一些颗粒物，而MSC对光谱的处理能消除固体颗粒大小、表面散射以及光程变化对近红外漫反射光的影响，使光谱的差异更能代表样品含量变化的差异。

本发明利用光栅型近红外光谱技术对不同发酵周期的抗生素（包含有金霉素、土霉素、新霉素等发酵型抗生素）发酵液进行采集光谱，同时对每一个采集的样品进行化学方法检测，得到不同营养成分含量和抗生素效价变化的理化数据，将采集的近红外光谱和理化数据进行拟合建立模型。经过验证，模型适用于不同周期抗生素发酵液中营养成分含量和抗生素效价变化的检测，短时间内可同时检测多种指标的含量，并可进行在线控制。

和现有技术相比，本发明检测方法的有益效果：

本发明提供了一种利用近红外光谱技术同时测定微生物发酵液中多种营养成分和抗生素含量变化的方法，以通过监控发酵过程中的营养成分变化和抗生素含量变化来及时补充营养成分和控制发酵工艺。使用该测定方法时不需要对发酵液进行任何处理，不需使用任何化学试剂，不对环境造成任何污染，且能够减少人力劳动，节约时间和成本。

附图说明

图1为不同周期金霉素发酵液的近红外光谱数据；

图2为品管部对金霉素发酵液进行理化检测的部分数据，图中TotalSuger为总糖，AN为氨基氮，CTC为抗生素效价；

图3为图1采用MSC预处理后的近红外光谱数据；

图4为采用最终金霉素发酵液模型进行检测的数据和品管部理化检测数据的对比验证，图中，QC代表品管检测数据，NIR为模型检测数据。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

一种利用近红外光谱测定微生物发酵产抗生素过程中多种营养成分和抗生素效价变化的方法，其包括如下步骤：

1）在微生物（包括金霉素、新霉素、土霉素等）发酵产抗生素过程中的不同时间点进行取样；

2）利用FOSS公司光栅型近红外分析仪采用漫反射方式获取每个样品的近红外光谱（见图1），同时通过本公司品管部（QC）测定每一个样品的理化指标，获得理化检测数据（见图2）；所述理化指标包括各营养成分（如总糖、氨基氮和氨基酸）的含量和抗生素效价；得到不同营养成分含量和抗生素效价变化数据。近红外光谱的波长范围选自400-2500nm。

品管部理化检测方法如下：

总糖测定：用碘量法。取样品1ml，置于250mL碘量瓶中，加蒸馏水30mL使之溶解。加入0.05mol/lKI溶液25.00mL，在不断摇动下缓慢滴加0.1mol/lNaOH溶液40ml至溶液呈淡黄色。密塞、暗置10分钟。加0.5mol/lH₂SO₄溶液6mL，摇匀，用Na₂S₂O₃标准溶液（0.1mol/l）滴定。接近终点时加入2ml淀粉指示液，继续滴定到溶液蓝色消失，即达终点。同时做空白试验。

氨基氮测定：取2ml样品于三角瓶内，用蒸馏水定至10ml。然后向瓶中加入甲基红指示剂2滴，1mol/lH₂SO₄加1-2滴，调节溶液至红色，静置5分钟，再用0.5mol/l的NaOH标准溶液调节溶液至橙色，加12%中性甲醛10ml，摇匀静置10min，加1%酚酞指示剂5滴，用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色为终点。

氨基氮（mg/100ml）=C×V×14.01×100/2.5（C：NaOH浓度，V：NaOH滴定体积）。

氨基酸测定：采用氨基酸分析仪进行测定，具体略。

抗生素效价测定：采用分光光度计法进行测定，具体略。

3）建立发酵液模型：具体为：利用计算机软件和化学计量学方法对采集到的近红外光谱数据进行多元散射校正预处理（MSC，见图3），并结合主成分分析法（PCA）和偏最小二乘法（PLS）计算得到近红外光谱数据与理化检测数据的拟合方程，即建立发酵液模型；然后通过交叉验证相关系数（1-VR）、交叉验证标准方差（SECV）两个指标的评价，选择交叉验证相关系数相对较大、交叉验证标准方差相对较小的模型确定为最终发酵液模型（见表1），利用该最终发酵液模型实现微生物发酵产抗生素过程中营养成分含量和抗生素效价变化的测定。

表1三种生物发酵液的近红外模型评价指标

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以金霉素为例，金霉素发酵液是由本公司保藏的金色链霉菌接种于由玉米淀粉等常规原料配制成的培养基中，按照本领域常规技术在一定的温度、湿度、pH、转速等工艺控制下得到的金霉素发酵液。

图4为采用最终金霉素发酵液模型进行检测的数据和品管部理化检测数据的对比验证。从图4中可以看出：不同周期金霉素发酵液效价指标利用两种方法（品管常规方法QC和近红外模型预测方法NIR）检测，两种方法得到的数据相当一致。经过验证可知：上述建立的最终发酵液模型适用于不同周期微生物发酵液中各营养成分含量和抗生素效价效价的检测。