OsJMJ714影响水稻籽粒大小以及盐胁迫耐性的功能及其应用

摘要

本发明公开了一个水稻JMJC家族成员OsJMJ714在影响籽粒大小及其对盐胁迫的耐性方面的应用。通过转基因技术创建所述转OsJMJ714基因水稻，获得的转基因植株籽粒大小以及盐胁迫耐性改变的水稻材料，因此OsJMJ714基因在改良水稻农艺性状如籽粒大小与胁迫耐性方面具有很好的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种调控水稻籽粒大小以及盐协迫耐性的基因及 其在农作物转基因改良中的应用。

背景技术

种子大小是决定水稻产量的重要因素之一，长期以来一直是很多作物育种改良的 重要目标,其调控机制备受关注。生长素作为最重要的植物激素之一，参与了植物生长发育 的众多重要过程。尽管生长素的合成、运输和信号转导在模式植物拟南芥中研究已比较深 入，然而其在作物中的研究和对作物产量的影响仍知之甚少。丝裂原活化蛋白激酶MAPKs是 生物体中广泛存在的蛋白激酶，它们在植物生长发育以及胁迫反应过程中发挥了重要作 用。中国科学院遗传与发育生物学研究所和中国水稻所合作鉴定了一个水稻矮杆小粒突变 体dsg1，DSG1编码一个丝裂原活化蛋白激酶OsMAPK6细胞生物学分析表明DSG1是通过调控 细胞分裂而调节了细胞数目，进而影响了水稻种子大小及其生物量。中国科学院遗传与发 育生物学研究所储成才研究员和中科院院士李家洋课题组合作通过对一水稻大粒显性突 变体(Biggrain1,Bg1-D)的研究，发现BG1编码一个受生长素特异诱导的早期响应的未知 功能蛋白，在水稻茎和穗的维管组织中特异表达。BG1过表达株系生长素极性运输能力显著 增强，并导致水稻籽粒显著增大。田间试验表明，BG1过量表达株系与对照相比千粒重增加 25%，产量增加21%。BG1过量表达植株生物量也显著提高。华中农业大学克隆的GS5是一个种 子大小的正调控因子，可以促进水稻颖壳细胞的横向分裂，进而增大颖壳的宽度，最终增大 种子的大小以及增加谷粒的重量和单株产量。研究表明，通过GS5的调控，水稻谷粒可增宽 8.7%，粒重可增加7%，单株产量可提高7.4%。这为作物高产育种提供了具有自主知识产权的 新技术。华中农业大学张启发院士鉴定控制水稻粒形基因GS3，证实了GS3是调控谷粒大小 的主要基因，揭示了基因所编码蛋白的结构与功能之间的关系。研究还发现，几乎所有的优 良粳稻品种都带有完整的GS3蛋白，表现为中等粒型，而优良长粒型籼稻品种的GS3蛋白无 功能，通过对该基因的导入和替换，能有效地改变水稻品种的粒型，表明GS3对水稻的产量 和品质有重要的决定作用，是粒型的变异和演化的主要决定因子之一。这些研究为解析种 子大小的遗传调控机制以及改良水稻品质与产量奠定了良好的基础。

盐对植物造成伤害有两种类型，一种是游离于根表面的离子导致的渗透胁迫，另 一种是钠离子或者氯离子进入植物体内产生离子毒害。许多耐盐植物耐盐的原因是这些植 物可以有效控制盐离子的摄入并将它们储存在细胞组分和组织中以应对外界高盐对其造 成的伤害。植物在受到盐胁迫时，往往改变自身形态以适应胁迫。植物可以通过调整根的生 长和根的结构来响应盐胁迫。单子叶植物的初生根在幼苗的早期发育和后续的侧根形成阶 段有重要作用。单子叶植物水稻的侧根起始于韧皮部中柱鞘细胞。盐胁迫信号通过调控初 生根的生长和侧根的发育来调整根系结构。盐胁迫是通过减少细胞分裂和伸长来抑制初生 根的生长，对侧根的影响相对复杂，中浓度的盐离子可以促进侧根的起始，高浓度盐离子引 起渗透胁迫并阻断侧根的起始。

植物生长发育由遗传调控和表观遗传调控协同决定，表观遗传修饰影响染色质构 型的开发或关闭进而导致基因的活化或沉默。含JumonjiC(JmjC)结构域的蛋白具有组 蛋白去甲基化酶功能，拟南芥和水稻JMJC蛋白影响组蛋白去甲基化和DNA甲基化修饰并对 花期和花器官发育进行精细调控。本发明对水稻中编码JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶 OsJMJ714基因超表达，导致水稻体内的组蛋白H3K9脱甲基化和DNA甲基化的修饰发生变化， 并影响水稻籽粒大小与盐胁迫耐性。

发明内容

本发明人创建水稻OsJMJ714基因过表达的转基因水稻，证实OsJMJA714调控水稻 籽粒大小及其对盐碱逆境的应答反应。在正常生长状态下，OsJMJ714转基因水稻籽粒变小， 而该基因沉默的转基因水稻种子比野生型的大；抗逆性表型分析发现该基因过表达降低水 稻对盐胁迫的耐性，而该基因沉默则提高转基因水稻的耐性，表明OsJMJ714基因在水稻农 艺性状与胁迫耐性方面具有应用价值。

本发明提供的技术方案是：一种水稻JMJ714基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所 示，以及简并序列，称为OsJMJ714基因。该基因过表达影响水稻籽粒大小和盐胁迫耐性形成 等过程。

所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

本发明还提供包含所述的基因的表达载体，优选为植物表达载体。

本发明还提供包含所述的基因的宿主细胞。

本发明还提供所述的基因在培育抗逆作物品种的应用，是将包括所述基因的表达 载体导入植物中，筛选获得抗逆性降低的植株，优先为水稻，所述抗逆性质为盐胁迫敏感。 这样可以制作盐胁迫敏感的水稻品种材料。

本发明还提供所述的基因在培育改变了籽粒大小的应用，是将所述基因导入植物 中，筛选获得改变了水稻籽粒大小，所述植物为农作物，优选为水稻。

通过本发明可以通过基因沉默技术，使水稻中的OsJMJ714基因表达降低或不表 达，因而可以获得抗逆性（盐胁迫）增强的水稻品种，或者籽粒变大的水稻品种。

本发明研究表明OsJMJ714调控水稻籽粒大小及其在水稻应答盐碱逆境胁迫反应 中发挥重要的作用。通过转基因技术创建OsJMJ714基因超表达和基因沉默的的转基因水 稻，超表达的转基因水稻籽粒变小和盐胁迫耐性降低，而该基因沉默的转基因水稻的籽粒 变大，盐胁迫耐性提高，进而可以利用该基因进行水稻等农作物的重要农艺性状和胁迫耐 性的遗传改良。

附图说明

图1转OsJMJ714基因水稻的的分子鉴定，A：DNA水平检鉴定转基因水稻；B：RNA水平 鉴定转基因水稻；C：OsJMJ714基因沉默转基因水稻的表达水平分析。

图2OsJMJ714调控水稻株籽粒大小。

图3OsJMJ714调控水稻耐盐性。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 制，仅仅作示例说明。

实施例一：转基因水稻材料的创建与鉴定

1、OsJMJ714基因重组植物表达载体的构建

利用OsJMJ714（基因号：Os09g0483600）编码区序列为模板，通过生物信息学分析设计 OsJMJ714-F5'-AGTGGATCCATGGAGCGCGCAGTGCGGGA-3'，OsJMJ714-R5'-GG CGGTACCTCAATCATTCGTCTCCTCGA-3'。从cDNA文库中PCR扩增OsJMJ714全长为1080bp的编码 区序列片段，利用BamHI和KpnI对PCR片段和植物表达载体pCAMBIA1205进行双酶切，然后进 行连接并转入大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆进行鉴定和测序分析，获得插入OsJMJ714基 因并且读码框正确的重组植物表达载体pCAMBIA1205-JMJ714，导入农杆菌AGL0中。

利用人工miRNA技术敲除水稻中的OsEAR因子的水稻材料创建

根据靶基因的作用位点通过生物信息学分析设计约21碱基的amiRNA引物，以内源 miRNA前体（pre-miRNA）骨架为模板，采用重叠PCR构建amiRNA基因;将amiRNA基因克隆到 相应的植物转化载体上；通过转基因技术将amiRNA导入植物体中，利用植物的miRNA加工 作用体系表达amiRNA并沉默靶基因。具体构建过程如下：

首先，针对研究目标基因利用WMD3软件Designer模块(http:// wmd3.weigelworld.org)，设计amiRNA序列，然后通过Oligo模块以pNW55为载体设计amiRNA 的重叠PCR引物，每个基因设计4条引物，（（ImiR-s1thagTTGACATTAAGTATGCCTACTcaggagat tcagtttga,IImiR-a1thgAGTAGGCATACTTAATGTCAActgctgctgctacagcc,IIImiR*s1th ctAGTAGGCATACTTAATGTCAAtcctgctgctaggctg,IVmiR*a1th aaTTGACATTAAGTATGCCTACTagagaggcaaaagtgaa）。结合通用引物G-4368(5’- CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’)和G-4369(5’-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’)以 质粒pNW55(克隆有水稻内源miRNA基因osa-MIR528的254bp的前体miRNA序列)为模板，运用 3对引物G-4368+PrimerII，PrimerI+PrimerIV，PrimerIII+G-4369进行PCR扩增。分别 将PCR产物回收后混合作为模板，运用引物对(G-4368+G-4369)进行融合PCR，获得554bp的 扩增产物。割胶回收后克隆到pMD18-Tsimple载体并测序验证，运用BamHI/KpnI双酶切后 转入植物转化载体pCAMBIA5300-amiERF2，导入根癌农杆菌AGL0中。进一步利用农杆菌介导 法侵染日本晴愈伤组织，分化后获得转基因植株。

、农杆菌侵染愈伤发转化水稻

1）水稻胚愈伤的诱导与继代：将水稻种子（越光）脱壳，用75%乙醇浸泡1min，用次氯酸 钠溶液浸泡30min，无菌水冲洗，用次氯酸钠重复浸泡15min，用无菌水冲洗。将灭菌后的水 稻种子于灭菌滤纸上晾干，种于诱导培养基中。28℃暗培养2周。分离愈伤组织转移至诱导 培养基28℃继代3次。挑取颜色淡黄且质地松散愈伤颗粒28℃暗培养3天。

2）菌种活化及扩繁：在28℃条件下，将含有目的基因表达载体（pCAMBIA1205- JMJ714,pCAMBIA5300-amiERF2）的农杆菌分别于YEB固体培养基上划线培养2天。

3）农杆菌与愈伤组织的共培养：取适量菌体悬浮于100μMAS+AA液体培养基中，菌 液OD值达0.3时，使愈伤组织浸入菌液中，轻摇20分钟。弃菌液，取出愈伤，滤干多余菌液，转 移到NB固体培养基上22℃暗培养3天。

4）筛选抗性愈伤：挑选共培养的愈伤组织，无菌水漂洗，滤干后铺于筛选培养基 上，28℃暗培养2周后继代一次。

5）预分化与分化：选生长旺盛呈乳白色的愈伤组织转至预分化培养基上，28℃暗 培养1周，28℃光照培养2周，见到绿点时继代一次，4周后分化成苗。

6）生根与壮苗：将长势较好的幼苗移至生根培养基上，培养2周后移栽。

7）将生长正常的转基因苗移栽温室培养至种子的收获。

8）得到的转基因阳性植株的幼苗。

、转基因水稻材料的鉴定

T0代水稻移栽至土壤中驯化培养，待其长势稳定，状态良好时，剪取叶片，CTAB法提取 DNA，PCR鉴定各转基因株系中的潮霉素抗性基因，以中花17水稻DNA为负对照，以重组植物 表达载体为正对照，7个转基因株系DNA水平鉴定均为阳性（图1A）。提取DNA水平鉴定为阳 性的转基因株系叶片总RNA，反转录得cDNA第一条链，RT-PCR鉴定过表达植株，OsActin为内 参，证实7个转基因株系植株中OsJMJ714基因表达上调（图1B），从RNA水平上确定为阳性株 系。pCAMBIA5300-amiERF2基因沉默的转基因表达水平采用荧光定量PCR分析，如图1C所示， Ri19和Ri21转基因株系中的表达水平低于对照（非转基因水稻）的表达水平。

实施例二：JMJ714影响水稻籽粒大小

水稻籽粒大小与其产量和品质等性状密切相关。我们发现JMJ714过表达的水稻籽粒变 小，如图2所示，与野生型种子相比，JMJ714过表达的转基因水稻种子变小，包括种子的长度 和宽度都比野生型的有所降低；进一步选取50粒成熟的种子进行籽粒大小的统计分析，野 生型籽粒的平均长度为0.7cm，两个转基因材料的为0.61cm与0.60cm；野生型的每粒宽度 为0.332cm，两个转基因株系的分别为0.294cm和0.289cm，这些结果表明该基因参与水稻籽 粒大小的调控过程，其过表达导致水稻种子变小，影响水稻的产量；而该基因表达沉默的转 基因水稻的种子变大，表明该基因表达降低可以提高水稻种子的大小和产量。

实施例三：OsJMJ714过表达降低水稻的耐盐性

我们对3周的WT和JMJ714过表达的转基因水稻材料用1%的NaCl处理8天，然后去掉盐 水，在水中恢复培养7天，结果如图3所示，JMJ714过表达的转基因水稻几乎全部死亡，而WT 中还有部分（约35%）能存活下来，但是该基因沉默的转基因水稻的大部分（约60%）能存活下 来，表明JMJ714过表达导致水稻对盐胁迫的耐性降低，而该基因表达降低可以调高转基因 水稻的耐盐性。

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>OsJMJ714影响水稻籽粒大小以及盐胁迫耐性的功能及其应用

<160>2

<210>1

<211>1080

<212>DNA

<400>1

1ATGGAGCGCGCAGTGCGGGAGCTGTGGGCGGAGTCGCGGGACCTGCTGGGCCTCCACTCC

61CCGGACGACGCCGCCGCCGCCGACGCCGCGATGCCCCGCGCCGAGATGCCCCCGACGCCG

121CTCGCGTTTCTCCGCGACCACGTCTCGCCGGGGCGCCCTCTCCTCGTGTCCTCCGCCGCC

181ACCAGCCACTGGCCGGCCGCCTCGCTGTGGCCGACCGACTCCTACCTCACCGACGCGCTC

241CGCTCCACCGCCGTCTCGCTCCACCTCACCCCCGACGGCCGCGCCGACGCCCTCGCCCCG

301CACCCGCGCCCGAGCCACCCCGGCGCCAAGTGCTTCGCCTCCGCGCACGTCCGCCAGGTC

361GACTTCCCCACCGCCGTGCGCCTCATCCGGAGCTCCGATCCGGCCTCCGGCCTGGTGGCC

421TACGCGCAGCAGCAGGACGACTGCCTGCGCGGGGAGTACGCCGCCGTCGCCGGCGACGTG

481GACGCGCACGTGCCCTGGGCCAGCGACGCGCTCGGCTGCCTCCCCGAGGCCGTCAACCTC

541TGGATCGGCAGCGCCTGCTCCCAGACCTCCTTCCACAAGGACCACTACGACAACATCTAC

601GTCGTCGTCTCCGGCGAGAAGCACTTCCTCCTCTTGCCCCCCACCGAGCACCACCGCCTC

661TACGTCCGCGACTACCCCGCCGCCCACTACGCCGCGGAAGATGAAGCGGAGCTGAGGCTT

721AAGCTGGAGCTGGAGGAGCCCGAGAGGATCGTGCCATGGAGCAGCGTTGACCCCTACCCG

781CCGTCGCCGGAGGAGGCGGCCGCGCAGGCGTCATCCTTCCCGCTCTACTTCGAGGGGCCG

841AGGCCGATCCGCTGCACGGTGCGCGCCGGCGAGATGCTCTACTTGCCGAGCATGTGGTTT

901CACCATGTGAGCCAGAGCCCCGGGCCGAACGGGCTCACCATTGCAGTGAACTACTGGTAT

961GACATGCAGTTTGACATTAAGTATGCCTACTTCAACTTCTTGAGGTCATTGGAGATCGAT

1021GGTAGTTCGTCGAAAAAGACGGATGCTTTGGAAGACGATCTCGAGGAGACGAATGATTGA

<210>2

<211>359

<212>氨基酸

<400>2

MERAVRELWAESRDLLGLHSPDDAAAADAAMPRAEMPPTPLAFLRDHVSPGRPLLVSSAATSHWPAASLWPTD SYLTDALRSTAVSLHLTPDGRADALAPHPRPSHPGAKCFASAHVRQVDFPTAVRLIRSSDPASGLVAYAQQQDDCLR GEYAAVAGDVDAHVPWASDALGCLPEAVNLWIGSACSQTSFHKDHYDNIYVVVSGEKHFLLLPPTEHHRLYVRDYPA AHYAAEDEAELRLKLELEEPERIVPWSSVDPYPPSPEEAAAQASSFPLYFEGPRPIRCTVRAGEMLYLPSMWFHHVS QSPGPNGLTIAVNYWYDMQFDIKYAYFNFLRSLEIDGSSSKKTDALEDDLEETND