基因的差异表达在口腔癌诊断中的应用

摘要

本发明涉及基因的差异表达在口腔癌诊断中的应用，更具体的涉及LRRC26基因的差异表达在口腔鳞状细胞癌诊断中的应用。发明人通过高通量测序平台进行转录组深度测序分析，初步筛选出在口腔鳞状细胞癌组织、癌旁组织和正常组织中差异表达明显的基因LRRC26，进一步RT-PCR实验证实了LRRC26基因与口腔鳞状细胞癌组织低表达，可用于制备口腔鳞状细胞癌辅助诊断或者预后制剂，具有重要的临床实际应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地，涉及基因的差异表达在口腔癌诊断中的 应用，更具体的涉及LRRC26基因的差异表达在口腔鳞状细胞癌诊断中的应用。

背景技术

口腔鳞状细胞癌(oralsquamouscellcarcinoma，OSCC)是口腔领面部最为常见 的恶性肿瘤，根据国际抗癌联盟/美国肿瘤研究联合委员会(UICC/AJCC)分级，肿瘤早期(I、 II)通过手术治疗预后良好，但许多患者发现时即为肿瘤晚期(III、Ⅳ)或已出现无法治疗 的局部复发。口腔位于消化道和呼吸道的起始位置，重要器官密集，且位于颜面部，故而在 临床实践工作中对于肿瘤晚期和复发转移患者无法按“无瘤原则”进行彻底的根治性手术， 尽管辅以多种治疗手段，其五年生存率近年来任没有明显增加。近年来随着遗传学与分子 生物学的蓬勃发展，通过对口腔鳞癌发生发展的分子机制的研究，尤其是对癌变过程中关 键性基因的筛选及靶向治疗的转化研究，为口腔鳞癌提供一种新的治疗方法以补充甚至替 代现有的治疗手段。

发明人通过高通量测序平台选取2例口腔鳞状细胞癌癌组织、癌旁组织及3例正常 组织的转录组深度测序分析，初步筛选出在口腔鳞状细胞癌组织、癌旁组织和正常组织中 差异表达明显的基因LRRC26，进一步RT-PCR实验证实了LRRC26基因与口腔鳞状细胞癌组织 低表达，LRRC26与口腔鳞状细胞癌具有很好的相关性，可用于制备口腔鳞状细胞癌辅助诊 断或者预后制剂，具有重要的临床实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗口腔癌制剂，所述治疗口腔癌制剂促进LRRC26基 因的表达。

本发明的目的在于提供促进LRRC26基因和/或LRRC26蛋白表达的试剂在制备口腔 癌治疗制剂中的应用。

进一步，口腔癌治疗制剂中含有促进LRRC26基因表达的载体。

进一步，口腔癌治疗制剂是指可以促进LRRC26基因的表达的制剂。本领域人员熟 知促进基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过DNA水平调控目的基 因：包括但不限于增加LRRC26基因的拷贝数、转染含LRRC26基因的过表达载体；通过转录水 平调控LRRC26基因：包括但不限于激活LRRC26基因的表达、激活调控LRRC26基因表达的启 动子、抑制负调控LRRC26基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对抑制LRRC26基因表达的 抑制子进行干扰；通过转录后水平调控LRRC26基因：包括但不限于抑制促进LRRC26基因 mRNA降解的microRNA转录表达、导入促进LRRC26基因表达的microRNA；通过翻译后水平调 控LRRC26基因：包括但不限于导入促进目的基因编码蛋白的分子、抑制负调控LRRC26基因 表达的蛋白、促进LRRC26基因表达的因子及蛋白的表达。

进一步，口腔癌治疗制剂会抑制口腔癌细胞增殖。

本发明的目的在于提供检测LRRC26基因和/其表达产物的试剂在制备口腔癌诊断 剂中的应用。

进一步，所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。

为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因LRRC26，进一步通过分子生物学方法验证了LRRC26与口腔癌的关系：LRRC26在口腔癌患 者中低表达，与口腔癌具有很好的相关性，可用于制备治疗口腔癌制剂和/或口腔癌诊断制 剂，具有重要的临床应用价值。

本发明的目的在于提供LRRC26基因在制备口腔癌诊断制剂中的应用。

进一步，所述的口腔癌的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测口 腔癌患者组织中LRRC26基因的表达。

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的 初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚 合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶 基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针 阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速 简便；三是可同时检测多种疾病。

所述的用于荧光定量PCR方法检测口腔癌中LRRC26基因的产品含有一对特异性扩 增LRRC26基因的引物；所述的基因芯片包括与LRRC26基因的核酸序列杂交的探针。

所述的用于荧光定量PCR方法检测口腔癌中LRRC26基因的产品可以检测癌组织与 癌旁组织中LRRC26基因的表达，也可以检测癌组织与正常组织中LRRC26基因的表达。

本发明的目的在于提供LRRC26基因表达产物在制备口腔癌诊断制剂中的应用。进 一步，所述的口腔癌的诊断制剂包括用免疫方法检测LRRC26蛋白的表达。优选所述免疫检 测方法检测口腔癌中LRRC26蛋白表达的为westernblot和/或ELISA和/胶体金检测方法。

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸 酶(AP)。

常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或外周血 切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标 记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2) 免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或外周血超薄切 片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微 孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体 检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜 上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的 样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动 至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截 留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十 分方便。

进一步，所述检测LRRC26蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中 的抗体可采用市售的LRRC26单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被LRRC26单克隆抗 体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止 液等。

进一步，所述检测LRRC26蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的LRRC26单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或 胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗 LRRC26单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

本发明的目的在于提供一种检测口腔癌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述 试剂盒检测基因LRRC26，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.1， 下游引物序列为SEQIDNO.2。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵 敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.1， 下游引物序列为SEQIDNO.2。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQID NO.3，下游引物序列为SEQIDNO.4。

本发明目的是提供了一种口腔癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测LRRC26蛋 白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

本发明目的是提供了一种检测口腔癌的基因芯片，所述的基因芯片包括与LRRC26 基因的核酸序列杂交的探针。

附图说明

图1RT-PCR检测癌组织LRRC26基因表达情况

图2转染过表达载体后口腔癌细胞生长曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。

实施例1

收集口腔癌及正常组织，对其进行分组及编号：3例正常组织块(编号为N1、N2、N3) 和2例癌组织块、癌旁组织块(C1、C2和P1、P2)。

对三组样品进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳。从电泳结果初步认为提取 的RNA样品质量合格，可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检 测RNA样品的提取情况，结果如表1所示。每个样品体积均为30μl。RNA-seq测序的样品要求: OD260/OD280为1.8-2.2。RIN(RNAintegritynumber)指的是RNA完整性指数,是RNA质量的 重要指标。从表1可以看出,本研究的样品均达到转录组测序的要求。

表1口腔癌RNA样品的分光光度检测

分组 浓度(ng/μl) OD(260/280) 体积(μl) 总量(μg) RIN值 质量类型 癌组织 1274.6 2.01 30 38.2 8.7 类型Ⅰ 癌旁组织 368.4 1.94 30 11.1 8.7 类型Ⅰ 正常组织 277.2 1.99 30 8.3 8.7 类型Ⅱ

实施例2高通量转录组测序及分析

测序平台：Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台

转录组测序和匹配：

我们进行分析的癌变组织、癌旁组织及正常组织3组样品来自于2例口腔癌患者和 3例健康人群。将这两组样品进行高通量cDNA测序。从这3个组织中我们分别得到4.85× 10⁷,4.91×10⁷，4.46×10⁷个读段对。我们利用TopHat将读段匹配到UCSC参考人基因组 (hg19)，唯一匹配的读段对范围在4.04×10⁷到4.49×10⁷之间，匹配到Ensembl参考基因的 读段比例在81％到89％之间。我们测序深度的平均覆盖度大概为人类基因组的130倍(按照 Ensembl数据库唯一注释的外显子区域的总长度，约为1.13×10⁸)，另外只有1％的读段定 位到rRNA，表明我们的数据库构建合理，较可靠地表现带有ployA尾巴的RNA的表达。

差异表达基因的分析：

为了计算基因的表达从而鉴定出不同样品间的差异表达基因，我们利用Cuffdiff 方法估计基因的表达，从而鉴定表达失调的基因。每个基因的标准化的表达水平按照每一 百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目(FPKM)计算。

差异表达基因的功能富集分析：为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对表 达失调的基因进行GeneOntology的功能富集分析。为了鉴别癌症特异的功能目录，我们利 用在线工具DAVID比较癌变组织、正常组织和癌变组织、癌旁组织的表达显著变化的基因进 行功能富集分析。

候选基因的选择：从上述RNA-seq测序及深度分析结果中筛选差异表达基因的候 选基因(正常组vs癌变组，癌旁组vs癌变组)，排序依据为p-value大小，LRRC26基因进入我 们的研究视野。

实施例3癌组织、癌旁组织及正常组织LRRC26基因表达情况

一材料和方法

1、材料

口腔癌自于2010年-2014年住院病例，分别取49例口腔癌患病病人的癌组织、癌旁 组织和23例健康人群正常组织做对照。

2、方法

2.1口腔癌组、癌旁组及正常组总RNA的提取

按康为世纪超纯RNA提取试剂盒(UltrapureRNAKit(DNaseI)，货号CW0597)说 明书提取口腔癌组及正常组的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA 的浓度和纯度。

采用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取，主要操作步骤如下：

1.样品处理，30-50mg组织在液氮中充分研磨后加入1mlBufferRLT，或在组织样 品中加入1mlBufferRLT后匀浆处理。

2.样品中加入BufferRLT后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使 蛋白核酸复合物完全分离。

3.以每1mlBufferRLT加入200μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 秒，室温放置2分钟。

4.4℃12,000rpm离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无 色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管(自备)中。

5.在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase的水配制)，颠倒混匀。

6.将上步所得溶液全部加入到已装入收集管(CollectionTube2ml)的吸附柱 (SpinColumnRM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心20秒，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入350μlBufferRW1，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中。

8.配制DNaseI混合液：取52μlRNase-FreeWater，向其中加入8μl10×Reaction Buffer和20μlDNaseI(1U/μl)，混匀，配制成终体积为80μl的反应液。

9.向吸附柱中直接加入80μlDNaseI混合液，20-30℃孵育15分钟。

10.向吸附柱中加入350μlBufferRW1,10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中。

11.向吸附柱中加入500μlBufferRW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12, 000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

12.重复步骤11。

13.12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻 底晾干。

14.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管(CollectionTube1.5ml)中，向吸附 柱的中间部位加入30-50μlRNase-FreeWater，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收 集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

15.总RNA完整性鉴定：取2μlRNA样品在1.5％琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)，分出 区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。

16.用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。

2.2LRRC26检测引物设计与合成

根据PCR引物设计原则，应用Premier5.0和增强版的OligoArchitect^TM软件进行 LRRC26引物设计(NM_001013653.2)。

LRRC26的上、下游引物序列分别为：

上游引物：5'-GCATGTGCGAGCCTTCTG-3'；SEQIDNO.1

下游引物：5'-TGGTGCCAGTGCTTCCAG-3'；SEQIDNO.2

产物长度为79bp。

内参β-actin上、下游引物序列分别为：

上游引物：5'-TAATCTTCGCCTTAATACT-3'；SEQIDNO.3

下游引物：5'-CCTTCATACATCTCAAGT-3'；SEQIDNO.4

产物长度为103bp。

2.3定量标准曲线的建立

标准DNA模板的制备

按照说明书，从口腔癌组织中，利用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取总RNA， 接着用康为世纪SuperRTcDNA第一链合成试剂盒(货号CW0741)进行逆转录反应，具体步骤 如下：1.将RNA模板、PrimerMix、dNTPMix、RTBuffer、SuperRT和RNase-FreeWater溶解 并置于冰上备用。

2.配置反应体系，总体积为20μl：终浓度为50pg-5μg的RNA模板、2μlPrimerMix、 4μldNTPMix、4μlRTBuffer、1μlSuperRT，加RNase-FreeWater补平到20μl。

3.涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

4.42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

将逆转录反应得到的cDNA用康为世纪2×TaqMasterMix(货号CW0682)进行常规 PCR，反应体系和条件如下：2×TaqMasterMix25μl、上下游引物各2μl、cDNA0.5μg、补平至 50μl。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；最 后72℃延伸2min。取样5μL，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯 化，将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到DH5α感受态细胞中。通过序列为SEQID NO.1和SEQIDNO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采 用NanoDropND-1000核酸定量仪定量(NanoDropTechnologies，Wilmington，Delaware)并 做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在10⁸-10²copies/ μl)。

2.3敏感性实验

取重组质粒按比例稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²个拷贝/μL，进行荧光定量 PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为 10⁸-10²copies/μL，最小检出浓度为100copies/μL。

2.4qRT-PCR检测LRRC26基因表达量

取上述49例口腔癌组、癌旁组和23例正常组超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提 取总RNA，进而用UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)进行RT-PCR。具体步 骤：

1.将RNA模板、引物、2×UltraSYBROneStepRT-qPCRBuffer(WithROX)、 SuperEnzymeMix和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。

2.RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBROneStepRT-qPCRBuffer(WithROX) 12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzymeMix0.5μl、加RNA模 板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-FreeWater补平至25μl。

3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

4.将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应： 反转录：45℃10min；95℃5min预变性，接35个循环：95℃10s，60℃30s。

对qRT-PCR反应结果使用SPSSForWindows11.5软件，相关数据采用χ2检验和 Fisher确切概率法进行处理，P＜0.05有统计学意义；qRT-PCR反应利用MedCalc统计分析软 件来计算。

根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较LRRC26基因在口腔癌组、癌旁 组和正常组中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中LRRC26在正常组织、癌旁 组织中的表达水平在明显高于肿瘤组织，其中正常组织约为肿瘤组织的9倍、癌旁组织约为 肿瘤组织的7倍(具体见图1)，以上结果验证高通量分析结果中LRRC26在口腔癌组织中低表 达。

实施例4细胞的培养

口腔鳞状癌细胞癌细胞株Tca8113细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所， 采用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，于含5％C0₂的37℃ 饱和湿度培养箱中培养。

细胞复苏：

首先将恒温水浴箱预热至37℃，细胞培养超净工作台台面用75％乙醇擦洗，然后 紫外灯消毒30min。细胞复苏的原则是快速融化，这样可以保证细胞外结晶在很短时间内即 融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。从液氮罐中 取出冻存管，插入浮板并迅速置入37℃水浴箱中，不停摇动尽快使管中液体融化。一般约 1min内融化，用乙醇消毒冻存管外壁及双手，在超净工作台内用吸管吸出细胞悬液，注入 15ml离心管内并滴加10倍体积的新鲜培养液，吹打均匀后，800rpm离心5min，除去上清，再 重复用新鲜培养液洗一次。用新鲜培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入5％CO₂的37℃饱和 湿度培养箱中静置培养，第二天观察贴壁生长情况及细胞形态，更换培养液或传代。

细胞传代：

细胞传代待细胞生长至培养瓶底部80％-90％密度时，在超净工作台中将原来的 培养液吸除，用PBS缓冲液轻缓漂洗细胞1-2次，尽量洗去残余血清，弃PBS平衡盐溶液。加入 0.5-1ml0.02％EDTA+0.25％胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中，瓶口盖好，于室温或 37℃条件下消化0.5-3min。倒置显微镜下观察消化细胞，随着时间的推移，原贴壁的细胞边 黑，逐渐趋于圆形，细胞之间间隙增大不再连接成片，表示此时消化适度。在细胞还未飘起 时立即加入适量含血清的新鲜培养液终止消化反应，并用吸管吸取培养瓶内培养液反复吹 打培养瓶底壁，使已消化的细胞脱离培养瓶底壁。吹打过程须按一定顺序操作，即要从一边 开始到另一边结束，尤其是培养瓶底壁四周的边缘地带，确保培养瓶底壁各处的细胞均被 吹打脱落。吹打时动作要轻柔不要用力过猛，同时尽可能不要出现气泡，这些都对细胞有损 伤。收集经吹打后得到的细胞悬液至15ml离心管内，800rpm离心5min，除去上清，立即加入 含血清的新鲜培养液，轻缓吹打形成细胞悬液。按1:2或1:3分配传代培养，加入适量培养液 后旋紧培养瓶盖，并在培养瓶侧面做好标记，置5％CO₂的37℃饱和湿度培养箱中继续培养。 24-48h更换培养液，一般3-4天形成细胞单层即可传代，若不马上传代可更换培养液以供实 验用。

细胞计数：

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计 数。计数结果以每毫升细胞数表示，其原理和方法与血细胞技术相同。首先将待测细胞制成 均匀的细胞悬液，血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少 许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3min，注意盖片下不要有气泡，也 不能让细胞悬液流入旁边槽中。显微镜下观察，计算计数板4个大格细胞总数，压线细胞只 计左侧和上方的，然后按下式计算：(细胞悬液的细胞数)个/ml＝(4个大格子细胞数/4)× 10⁴个/ml式中：除以4是因为计数了4个大格子的细胞数；乘以10⁴是因为计数板中每一个大 格子的体积为：1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)＝0.1mm³，而1m1＝1000mm³。

细胞活力：

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比 叫做细胞活力。最常用的方法为台盼蓝排斥试验，细胞损伤或死亡时，台盼蓝能穿透变性的 细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，即死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞 和活细胞。配制0.4％台盼蓝溶液(台盼蓝0.4g加ddH₂0至100ml,4℃保存)，制备待测的细胞 的单个细胞悬液，并作适当稀释(10⁶/ml)，用吸管取9滴细胞悬液移入小试管中，加一滴 0.4％台盼蓝溶液，混匀，在3min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，注意时间不宜 过长，否则，部分活细胞也会着色，从而干扰计数。显微镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而 活细胞拒染，根据下式求细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总 数)×100。

实施例5LRRC26基因过表达对口腔鳞状细胞癌细胞的影响

一材料和方法

1、材料

口腔鳞状癌细胞癌细胞株Tca8113细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所， pcDNA3.1质粒购自优宝生物(货号VT1001)。

2、方法

2.1载体构建

采用高保真酶扩增LRRC26序列(NM_001013653.2)，同时在序列两端增加EcoRⅠ酶 切位点，序列经测序无误后通过酶切连接入载体pcDNA3.1中，序列连入后进行载体酶切验 证是否连入，进一步通过PCR扩增及测序验证连入的方向是否正确及连入的序列是否有突 变，所有验证均符合的载体命名pcDNA3.1-LRRC26。

2.2转染

使用脂质体Lipofectamine^TM2000转染相应质粒DNA进入Tca8113细胞株细胞内： 转染前一天，采用不含抗生素的适量的培养液在实验设计要求的培养器皿中接种一定量细 胞，使得转染时细胞生长至培养器皿底部90％-95％密度；每一个转染质粒DNA样品都要都 需按照首先制备质粒DNA-Lipofectamine^TM2000复合物在适量的不含血清的Opti-MEM培养 液中稀释，轻轻混匀，使用前轻轻混匀Lipofectamine^TM2000，然后稀释适量的试剂到Opti- MEM培养液，轻轻混匀后在室温下孵育5min，孵育5min后，混合稀释的质粒DNA与稀释的 Lipofectamine^TM2000,轻轻混合，在室温下孵育20min，以便允许复合物的形成；将质粒 DNA-Lipofectamine^TM2000复合物加入到每一个包含细胞培养液的孔中，通过前后左右摇 动培养板混匀；37℃，5％CO₂培养箱孵育18-48h，在转染后4-6h可换常规培养液。

2.3MTT法测定细胞增殖

(1)96孔板中接种细胞，每个时间点每组细胞各设3个复孔，每孔接种细胞量为1.5 ×10³个，培养液用量为每孔200μl,37℃,5％CO₂培养箱中孵育；

(2)培养细胞到达设计时间点时，在待测孔中，每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml), 混匀后37℃，5％C0₂培养箱中再孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μlDMSO，在96孔板水平振荡仪上温和缓慢振荡10min；

(3)待96孔培养板内溶液降至室温后，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定 样本吸光度OD₄₉₀mm；

(4)连续测量5d，绘制细胞增殖的生长曲线。

二实验结果

构建后的载体经过EcoRⅠ酶切验证及测序验证，结果表明酶切后得到两条清晰条 带，其中较小的条带大小在1000-1500bp之间，约为1200bp，显示目的条带已经连接进载体， 进一步将载体送往测序公司，测序结果也表明目的条带已经正向连接进载体，并且没有突 变。将构建好的pcDNA3.1-LRRC26载体、pcDNA3.1空载体分别转染Tca8113细胞株，用MTT法 检测细胞生长情况，经过连续5天的检测，与转染pcDNA3.1空载体对照组相比转染 pcDNA3.1-LRRC26载体组的细胞生长受到抑制，二者具有显著性差异(具体见图2)，即过表 达LRRC26基因能够有效抑制口腔鳞状细胞癌的细胞增殖。

本发明采用生物信息学结合分子生物学实验验证，筛选出口腔癌致病相关基因 LRRC26，并提供了检测LRRC26表达水平的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含了从RNA提 取到反转录到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便临床使用，又保证了结果的一致性，具 有很好的临床应用前景。