一种体外套式环介导等温扩增法的检测嗜肺军团菌的试剂及检测嗜肺军团菌的方法

摘要

本发明提供了一种体外套式环介导等温扩增法的检测嗜肺军团菌的试剂，它包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物Loop-f、环引物Loop-r，套引物FNP、套引物BNP；本发明还提供了运用上述试剂的体外新型高效等温扩增检测嗜肺军团菌的方法，可以快速准确地检测嗜肺军团菌，对样本的检测只需30-45分钟左右即可完成，比加入环引物的LAMP反应时间缩短30%-50%左右，对疾病的快速诊断具有重要的现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外检测嗜肺军团菌的试剂及方法。

背景技术

嗜肺军团菌（Legionellapneumophila）于1976年首次在美国被发现，是一种革兰氏阴性条件致病菌，主要通过污染建筑物中的水系传播，易大规模爆发和流行。该菌感染后发病进程快，死亡率高。在西欧国家，每年军团菌的发病人数接近10万例。随着经济发展，中央空调的普遍使用，军团菌爆发的危险性日益增加，已有多个国家将军团肺炎列为法定传染病。我国卫生部2003年颁布了《集中式空调通风系统卫生规范》，目的就是为了切断嗜肺军团菌的传染源和传播途径。目前该菌是国境口岸微小环境重点关注的微生物病原体，也是卫生检疫在口岸卫生监督的重要环节，2007年曾经在杭州机场口岸有报道检出。

军团菌病的传播特点与军团菌的生存方式有很大关系。在人工水体中，供水温度较高,或者供水管道和蓄水池的管壁和池壁上形成积垢和生物膜，就会为军团菌的大量增殖提供适宜的环境和营养条件。冷却塔的循环水和空调的冷凝水，由于水温较高，管道中容易藏污纳垢，且容易形成死水区，为军团菌提供了良好的栖息和繁殖环境。空调通风系统中军团菌大量繁殖容易形成微生物气溶胶，如遇管道渗漏，冷却塔或蒸发凝水中染有军团菌，送风时，带菌的水即被吹成细小微粒或气溶胶。在夏秋季节，军团病容易发生在配备有封闭式中央空调的公共场所中，人群普遍易感。嗜肺军团菌培养要求苛刻，生长缓慢，一般从水样收集到培养鉴定需要7～10天。培养结果受标本采集质量、操作技术的影响，阳性率不一。血清免疫学方法灵敏度和特异性不高。新型等温扩增检测方法应用于嗜肺军团菌，可对嗜肺军团菌进行快速检测，提高检测效率，并控制在比较低的成本，并对仪器设备的要求较低，有利于在基层单位中的推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外套式环介导等温扩增法的检测嗜肺军团菌的试剂，可以用于快速准确地检测嗜肺军团菌。为此，本发明采用以下技术方案：

它包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物Loop-f、环引物Loop-r，套引物FNP、套引物BNP；引物基因序列如下：

外引物F3：GCTGCAACCGATGCCACA；

外引物B3：TTGGGCCAATAGGTCCGC；

内引物FIP：

TTGCTGTTCGGTTAAAGCCAATTGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCG；

内引物BIP：

ACTGAAAACAAAAACAAGCCAGGCGCGTTGCTGGCTTACCAGTTT；

环引物Loop-f：CATGCAAGACGCTATGAGTGG；

环引物Loop-r：CGGGTTTAACACCATTTCCA；

套引物FNP：

TTCAGCAGTACGCTTAGCCATCAAAATCAAGGCATAGATGTTAATCCG；

套引物BNP：

AAGCGGATGAAAATAAAGTAAAAGGGCCATCAATCAGACGACCAGTAT。

本发明第二个目的是提供运用上述试剂的体外新型高效等温扩增检测嗜肺军团菌的方法，可以快速准确地检测嗜肺军团菌。为此，本发明采用以下技术方案：

反应体系如下：引物混合物1μL，10×buffer2.5μL，模板DNA1μL，BstDNA聚合酶1μL，浓度为8mol/L的甜菜碱2μL，浓度为100mmol/L的dNTP1μL，浓度为100mmol/L的MgSO₄1.2μL，Eva_green1μL，加入灭菌去离子H₂O补足25μL混匀；各引物在引物混合物中浓度分别如下：F3、B3各1μmol/L，FIP、BIP各15μmol/L，Loop-f、Loop-r各5μmol/L，FNP、BNP各15μmol/L；

所述方法的步骤为：将阴性对照、阳性对照和待测样本分别按上述反应体系孵育63℃40-45分钟进行反应，结果判断可采用以下方式：

在荧光定量PCR仪上观察实时荧光曲线，出现S形扩增曲线者含有嗜肺军团菌，结果为阳性，未出现S形扩增曲线者，则为没有嗜肺军团菌，结果为阴性；或者：

取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，检测样本孔中如产生阶梯状条带则含有嗜肺军团菌，反之没有嗜肺军团菌。

环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)依赖于4条能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，不需要热变性的DNA作为模板，在恒温下就可进行高效、快速、高特异地扩增靶序列。

本发明所提供的检测嗜肺军团菌试剂，其引物之间的关系采用本发明所提供的体外套式快速环介导等温扩增方法中的方案，利用上述方案建立的套式恒温扩增嗜肺军团菌检测方法具有操作简便，高效、快速、特异性高的优点；该方法的建立，对样本的检测只需30-45分钟左右即可完成，比加入环引物的LAMP反应时间缩短30%-50%左右，对疾病的快速诊断具有重要的现实意义。

附图说明

图1为嗜肺军团菌等温扩增的特异性试验产物电泳结果，1:marker，2：标准株33152，3-4：嗜肺军团菌，5：长滩军团菌标准株，6：大肠杆菌，7：金黄色葡萄球菌，8：沙门氏菌9：阴性对照。

图2为嗜肺军团菌等温扩增的灵敏度试验产物电泳结果，M为marker，2为3×10⁶拷贝/μL，3为3×10⁵拷贝/μL，4为3×10⁴拷贝/μL，5为3×10³拷贝/μL，6为3×10²拷贝/μL，7为3×10¹拷贝/μL，8为7为3×10⁰拷贝/μL，9为阴性对照。

图3为嗜肺军团菌不同方式等温扩增比较结果，1为套式LAMP扩增反应，2为加入环引物的LAMP扩增反应，3为阴性对照。

具体实施方式

实施例1嗜肺军团菌的检测。

引物设计。

根据嗜肺军团菌mip基因的保守序列，设计一系列引物，分别是外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物Loop-f、环引物Loop-r，套引物FNP、套引物BNP。引物基因序列如下：

外引物F3：GCTGCAACCGATGCCACA；

外引物B3：TTGGGCCAATAGGTCCGC；

内引物FIP：

TTGCTGTTCGGTTAAAGCCAATTGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCG；

内引物BIP：

ACTGAAAACAAAAACAAGCCAGGCGCGTTGCTGGCTTACCAGTTT；

环引物Loop-f：CATGCAAGACGCTATGAGTGG；

环引物Loop-r：CGGGTTTAACACCATTTCCA；

套引物FNP：

TTCAGCAGTACGCTTAGCCATCAAAATCAAGGCATAGATGTTAATCCG；

套引物BNP：

AAGCGGATGAAAATAAAGTAAAAGGGCCATCAATCAGACGACCAGTAT。

在上述引物中，外引物F3、B3和内引物FIP、BIP是常规环介导等温扩增法（LAMP）的引物；

加入环引物Loop-f、环引物Loop-r，可使LAMP反应中引物和核酸模板接触的位置增加2个；等温扩增反应不但能用套内引物FNP与BNP根据核酸模板进行扩增，同时也可以和外侧常规LAMP引物扩增的产物结合并扩增，使和核酸模板接触的位置又增加了4个；

套内引物FNP不但可以和套内引物的BNP联合进行扩增反应，同时也能跟外侧的常规内引物BIP联合进行扩增，增大了与核酸模板结合和扩增的机会，反之，套内引物BNP也可以和套内引物的FNP联合进行扩增反应，同时也能跟外侧的常规内引物FIP联合进行扩增反应；

利用上述引物对目的基因进行环介导等温扩增，常规LAMP反应和加入环引物的LAMP的扩增产物只有1种产物的循环序列，加入环引物不改变产物的序列；在加入套内引物后，产物就是4种扩增产物的循环序列，即内引物FIP、BIP的扩增产物，套内引物FNP、BNP的扩增产物，内引物FIP和套内引物BNP的扩增产物，套内引物FNP和内引物BIP的扩增产物。

核酸的提取。

采用采用嗜肺军团菌标准株ATCC33152,用BCYE培养基在CO2孵箱中培养48h培养后，挑取菌落，按试剂盒说明书提取DNA。

套式环介导等温（LAMP）扩增的反应体系与反应条件。

反应体系如下：10×buffer2.5μL，引物混合物1μL（各引物在引物混合物中浓度分别如下：F3、B3各1μmol/L，FIP、BIP各15μmol/L，Loop-f、Loop-r各5μmol/L，FNP、BNP各15μmol/L），模板DNA1μL，BstDNA聚合酶1μL，甜菜碱（8mol/L）2μL，dNTP(100mmol/L)1μL，MgSO₄(100mmol/L)1.2μL，Eva_green1μL，加入灭菌去离子H₂O补足25μL，混匀，在63℃恒温反应60分钟。

特异性试验。

同时将长滩军团菌标准株、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等菌株，按试剂盒根据说明书提取核酸，与嗜肺军团菌同时进行检测。扩增反应体系为10×buffer2.5μL，引物混合物1μL（各引物在引物混合物中浓度分别如下：F3、B3各1μmol/L，FIP、BIP各15μmol/L，Loop-f、Loop-r各5μmol/L，FNP、BNP各15μmol/L），模板DNA1μL，8UBstDNA聚合酶1μL，10UAMV逆转录酶1μL，甜菜碱（8mol/L）2μL，dNTP(100mmol/L)1μL，MgSO₄(100mmol/L)1.2μL，Eva_green1μL，加入灭菌去离子H₂O补足25μL，混匀，在63℃恒温反应45分钟后。反应电泳结果见图1。

反应结果说明除嗜肺军团菌核酸出现比普通LAMP反应条带排列更密的阶梯状条带的阳性结果外，阴性对照、长滩军团菌标准株、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等，显示为阴性；在荧光定量PCR仪上可见，仅有嗜肺军团菌出现扩增曲线，其他病毒均为出现扩增曲线，显示了该方法具有很好的特异性。

灵敏度试验。

用外引物（F3，B3）进行扩增PCR扩增，将PCR产物纯化回收试剂盒进行纯化回收，对纯化后的PCR产物测定OD值，根据产物长度和OD值进行拷贝数计算，将产物十倍倍比稀释到3×10⁰拷贝/μL。将核酸进行10倍递进稀释，取1μL作为模板加入反应体系中，在63℃恒温条件下，反应60min。在荧光定量PCR仪上观察实时荧光反应图，结果见图2；并取2μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，见图2，2-7泳道均出现梯状条带，表示出现有阳性扩增反应。可以判定本方法的检测极限约为30拷贝/μL。

加入环引物LAMP反应与套式LAMP反应的扩增时间比较。

将加入环引物LAMP和套式环介导等温扩增反应采用相同样本、相同反应条件同时在荧光定量PCR仪上进行检测，反应条件为63℃，55s，荧光采集5s，60个循环。加入环引物的反应体系为：10×buffer2.5μL，引物混合物1μL（各引物在引物混合物中浓度分别如下：F3、B3各1μmol/L，FIP、BIP各15μmol/L，Loop-f、Loop-r各5μmol/L），模板DNA1μL，BstDNA聚合酶1μL，甜菜碱（8mol/L）2μL，dNTP(100mmol/L)1μL，MgSO₄(100mmol/L)1.2μL，Eva_green1μL，加入灭菌去离子H₂O补足25μL。套式环介导等温扩增的反应体系：10×buffer2.5μL，引物混合物1μL（各引物在引物混合物中浓度分别如下：F3、B3各1μmol/L，FIP、BIP各15μmol/L，Loop-f、Loop-r各5μmol/L，FNP、BNP各15μmol/L），模板DNA1μL，BstDNA聚合酶1μL，甜菜碱（8mol/L）2μL，dNTP(100mmol/L)1μL，MgSO₄(100mmol/L)1.2μL，Eva_green1μL，加入灭菌去离子H₂O补足25μL。结果见图3。由图3实时荧光反应图可见套式LAMP的反应时间可在15-25分钟左右，加入环引物的LAMP反应时间为30分钟左右。

实施例2，环境样本中嗜肺军团菌的检测。

采用空调水样本分离的20份磁珠保存的菌种，取出磁珠培养，挑取菌落，根据抽提试剂盒根据说明书提取DNA，反应体系如下：10×buffer2.5μL，引物混合物1μL（引物混合物中各引物浓度分别如下：F3、B3各1μmol/L，FIP、BIP各15μmol/L，Loop-f、Loop-r各5μmol/L，FNP、BNP各15μmol/L），模板DNA1μL，8UBstDNA聚合酶1μL，甜菜碱（8mol/L）2μL，dNTP(10mmol/L)2μL，MgSO₄(100mmol/L)1.2μL，Eva_green1μL，加入灭菌去离子H₂O补足25μL，混匀,以灭菌双蒸水为阴性对照。在荧光定量PCR仪上反应程序为63℃，55秒，63℃，5秒，读取荧光值，60个循环。20份样本中有11份出现扩增曲线，套式环介导等温扩增嗜肺军团菌检测结果为阳性，其他未出现扩增曲线，结果为阴性。结果与嗜肺军团菌荧光PCR试剂检测结果相符。

<110>浙江国际旅行卫生保健中心

<120>一种体外套式环介导等温扩增法的检测嗜肺军团菌的试剂及检测嗜肺军团菌

的方法

<130>

<160>8

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gctgcaaccgatgccaca18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ttgggccaataggtccgc18

<210>3

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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