一种用于对中国人群个体进行个体识别和亲子鉴定的方法和系统

摘要

本发明提供一种用于对中国人群个体进行个体识别和亲子鉴定的方法和系统，所述方法包括：获得待检测个体的DNA；获得所述DNA常染色体STR基因座、性别决定基因座Amelogenin以及Y-STR基因座DYS391的分型结果，根据分型结果进行个体识别和亲子鉴定。本发明还提供了一种用于对中国人群个体进行个体识别和亲子鉴定的系统。本发明的方案通过综合分析常染色体基因座和性别决定基因座分型结果能有效获得待检测个体的分型结果，进而为公安机关进行个体识别和亲子鉴定提供有力的技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分型方法和系统，尤其涉及一种用于对中国人群个体进行个体识别和亲 子鉴定的方法和系统。

背景技术

随着我国改革开放的步伐日益加大，人们对于家庭从一而终的传统观念亦发生了微妙的 改变，使得现代家庭的关系日趋复杂，离婚与再婚几乎每天发生在我们的周围，婚外情等考 验我们道德底线的事件也明显增加，随之而来的是全国各地法院民庭受理的关于亲子关系纷 争的案件数量不断增加。亲子关系纷争的日益增多加之DNA鉴定技术的不断发展进步，作为 依托于DNA科学鉴定技术之上的亲子鉴定越来越得到广泛认可及信赖。

据了解，在我国申请做亲子鉴定的原因是多种多样的，常见的有以下几种情况：(1)司 法亲子鉴定方面：遗产继承纠纷要确定是否亲生关系；强奸犯的认定；认领被拐卖儿童；未 婚先育落户，超生落户；遇难者(空难、海啸等)身份无法辨认；抚养权纠纷；个人亲子鉴 定；怀疑子女不是亲生；怀疑医院产房或育婴室调错新生儿；失散的家庭成员认亲；(2)刑 事案件方面：强奸致孕，需要确定犯罪嫌疑人；高度腐败的无名尸体或骸骨，需要确定身份 的；对拐卖的儿童进行的亲子鉴定；交通事故致死，亲属需要认领尸体求得应有赔偿。(3) 民事案件方面：办理移民；子女户口登记；财产继承纠纷；怀疑婴儿被调换；超生子女的血 缘鉴定；非婚生子女的血缘鉴定；失散子女的血缘鉴定；男子想证实孩子是否是亲生；被领 养的孩子寻找亲生父母；帮助寻找失散的家庭成员；鉴别双胞胎是否来自同一父亲；帮助妇 女从孩子生父处获得子女抚养费用；帮助父母亲取得亲生子女的监护权和探视权；试管婴儿 的血缘鉴定，鉴别经体外授精获得的试管婴儿有无实验室的差错；其他情况需要进行DNA亲 子鉴定的；(4)上户鉴定：在亲子鉴定领域应用非常广泛。

短串联重复序列(ShortTandemRepeat,STR)是广泛存在于人类基因组中的一类具有高度 多态性的遗传学标记，由于其具有片段小易扩增、适宜于检验微量或降解检材、各基因座的 扩增条件相似而能够实现复合扩增等特点，因而采用STR的检验系统具有灵敏、准确、快速、 信息量大等优点，尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。目 前，国内外用于生物检材个体识别检验、亲子鉴定和构建DNA数据库的商品化STR复合试 剂盒主要有：Identifiler^TM、Powerplex^TM16和DNATyper^TM19。它们分别可获得15、16、19个 常染色体STR基因座的分型结果。因这三个试剂盒检测的STR基因座部分重叠，如联合使用 最多可获得CODIS系统核心STR基因座、D2S1338、D19S433、PentaD、PentaE和D6S1043 共18个STR基因座的分型结果。如对犯罪现场生物检材进行个人识别的检测，以上试剂盒单 独使用均能够解决问题；在大多数的标准三联体：母-子-疑父的亲子鉴定中，也基本能够满足 要求。但是面临越来越多的单亲鉴定案件、祖孙鉴定案件、同胞鉴定案件，显然单独使用以 上任何一个STR荧光复合试剂盒不够，需要检测更多的STR基因座才能解决这些特殊的亲权 鉴定案件。此外，从美国血库协会(TheAmericanAssociationofBloodBanks，AABB)收集到的 STR基因座突变数据看，几乎所有STR基因座均存在基因突变现象，严重影响是否存在亲缘 关系的判断，必须增加STR基因座的检测数量。尤其值得注意的是，随着DNA数据库规模 的不断扩大，为有助于更清楚地判别检索出来的匹配数据，特别是遇到一些具有亲缘关系的 样本比对或同一认定复核时，也迫切需要引入更多的STR基因座。

此外，在打拐专项行动及亲子鉴定案件中，由于STR基因座突变现象的存在，常常需要 检验更多的STR基因座才能作出更加明确的判定。在打拐专项行动中，明确规定STR基因座 的检测数量必须达到18个。2009年全国亲子鉴定理论与实践研讨会上提出在进行单亲案件肯 定父权判断的基本标准是至少检测18个基因座无不符合孟德尔遗传规律的基因座；或检测29 个STR基因座，只有1个基因座不符合孟德尔遗传规律；或检测41个STR基因座，只有2 个基因座不符合孟德尔遗传规律。这种情况下，很难应用一个STR荧光复合试剂盒就能达到 上述要求。因此，迫切需要开发新产品用于亲子鉴定以及个体识别。

发明内容

本发明提供了一种用于对中国人群个体进行个体识别和亲子鉴定的方法，通过获得23个 常染色体STR基因座、1个性别决定基因座以及1个Y-STR基因座的分型结果，进而为公 安机关进行个体识别和亲子鉴定提供有力的技术支撑。

本发明还提供了一种STR基因座复合检测体系，可以准确获得从待检测个体的23个常染 色体STR基因座、1个性别决定基因座以及1个Y-STR基因座的分型结果。

本发明还提供了一种用于对中国人群个体进行个体识别和亲子鉴定的系统，通过该体系 通过结合常染色体基因座和性别决定基因座的分型结果，并能根据分型结果进行个体识别或 亲子鉴定。

一种用于对中国人群个体进行个体识别和亲子鉴定的方法，所述方法包括：

1)获得待检测个体的DNA；

2)获得所述DNA的23个常染色体STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin以及 Y-STR基因座DYS391的分型结果；

其中所述23个常染色体STR基因座为D1S1627、D3S4529、D2S441、D17S974、D6S1017、 D4S2408、D9S2157、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D20S1082、 D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D9S1122、D2S1776、 D5S2500和D18S51；

3)根据分型结果进行个体识别和亲子鉴定。

进一步的，所述基因座的分型结果通过测序获得。

更进一步的，所述基因座的分型结果通过STR基因座复合检测体系获得，所述STR基因 座复合检测体系包括所述23个常染色体STR基因座、性别决定基因座Amelogenin以及Y-STR 基因座DYS391，还包括用于对所述23个常染色体STR基因座、性别决定基因座Amelogenin 以及Y-STR基因座DYS391进行扩增以获得扩增产物的扩增引物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述23个常染色体STR基因座的扩增引物为序列表中 SEQIDNo.1至SEQIDNo.46的核苷酸序列；所述性别决定基因座和Y-STR基因座的扩增引 物为序列表中SEQIDNo.47至SEQIDNo.50的核苷酸序列。

本发明提供的一种STR基因座复合检测体系，包括所述23个常染色体STR基因座、性 别决定基因座Amelogenin以及Y-STR基因座DYS391，还包括用于对所述23个常染色体STR 基因座、性别决定基因座Amelogenin以及Y-STR基因座DYS391进行扩增以获得扩增产物 的扩增引物,其中所述23个常染色体STR基因座为D1S1627、D3S4529、D2S441、D17S974、 D6S1017、D4S2408、D9S2157、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、 D20S1082、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D9S1122、 D2S1776、D5S2500和D18S51。

在本发明的一个具体实施方式中，所述23个常染色体STR基因座的扩增引物为序列表中 SEQIDNo.1至SEQIDNo.46的核苷酸序列；所述性别决定基因座和Y-STR基因座的扩增引 物为序列表中SEQIDNo.47至SEQIDNo.50的核苷酸序列。

本发明提供的一种用于对中国人群个体进行个体识别和亲子鉴定的系统，包括DNA提取 体系、STR基因座复合检测体系，和推断体系；

所述DNA提取体系用于获得待检测个体的DNA；

所述STR基因座复合检测体系用于获得所述DNA的23个常染色体STR基因座、性别决 定基因座Amelogenin以及Y-STR基因座DYS391的分型结果；

所述推断体系用于根据分型结果进行个体识别和亲子鉴定。

进一步的，所述STR基因座复合检测体系包括所述23个常染色体STR基因座、性别决 定基因座Amelogenin以及Y-STR基因座DYS391，还包括用于对所述23个常染色体STR基 因座、性别决定基因座Amelogenin以及Y-STR基因座DYS391进行扩增以获得扩增产物的 扩增引物,其中所述23个常染色体STR基因座为D1S1627、D3S4529、D2S441、D17S974、 D6S1017、D4S2408、D9S2157、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、 D20S1082、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D9S1122、 D2S1776、D5S2500和D18S51。

更进一步的，所述23个常染色体STR基因座的扩增引物为序列表中SEQIDNo.1至SEQ IDNo.46的核苷酸序列；所述性别决定基因座和Y-STR基因座的扩增引物为序列表中SEQID No.47至SEQIDNo.50的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，获得所述基因座分型结果的过程包括采用与所述 基因座一一对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物，并由该扩增产物获得所述基 因座的基因型的步骤。

在本发明的另一个具体实施方式中，可以通过遗传分析仪分析所述扩增产物获得所述基 因座的基因型。进一步的，所述遗传分析仪可以是本领域技术人员常规使用的遗传分析仪， 例如AB3130或AB3500型遗传分析仪。通过ID-X软件或其他GeneMapper软 件等分析该PCR扩增产物中所述基因座的基因型。

本发明方案适用于对：人的精斑、唾液斑、组织、血痕或血液等检材来源的DNA样品进 行检测分析。

在本发明的方案中，所述23个常染色体STR基因座、性别决定基因座和Y-STR基因座 DYS391的信息如下表1所示：

表1

本发明方案中使用的这些基因座是申请人通过对中国人群的生活环境、种族起源等进行 综合分析，考察各地区民族人口的表型特征差异，包括外形特征，生理指标等，针对这些差 异进行文献和网络数据库调研，在已有研究的基础上经过大量实验和生物信息学分析筛选出 在中国人群中存在的复合扩增效率好、特异性较高的23个常染色体基因座。性别决定基因座 Amelogenin是用于性别鉴定，如果是男性结果为XY，如果是女性，结果为XX。Y-STR基 因座DYS391用于性别判断和与其它Y试剂盒进行比对。

本发明提供的优选的扩增引物序列，通过例如Autoprimer在线软件设计。扩增引物及其 相对应的基因座信息如下表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物。更进一步的， 所述PCR扩增引物可以为具有荧光的PCR扩增引物。申请人通过大量反复实验，考虑生 产成本、各个基因座引物扩增效率等方面，对上述基因座采用表2中所述的方式进行荧光标 记。

在本发明的实施方式中，通过所述遗传分析仪，将实际扩增出的产物长度、产物颜 色与表2中记载的引物要扩增的长度、产物颜色进行比对，实际扩增出的产物长度只要 与表2记载的扩增长度相等或相近即可，二者可以存在偏差，只要在本领域技术人员可 以接受的范围内即可，或者通过测序确认是所要扩增的片段即可。

表2

本发明方案具有以下优点：

1、本发明的系统和方法对于无关个体DNA检材、不同种属动物检材以及案件检材进行 了检测，证明本发明的系统和方法具有较高的准确性、组织同一性和种属特异性，并且，最 小DNA检出量为0.125ng，尤其对于常规检测方法不理想的降解检材DNA，该系统和方法仍 可以获得较好的检测效果。

2、本申请的系统和方法可以实现对单亲案件的亲权鉴定。

3、利用该系统对209例无关个体进行检测，计算出荧光标记STR复合扩增检验体系中国 汉族人群中的等位基因频率、基因型频率、观察杂合度、个体识别能力、多态性信息含量及 非父排除率。结果表明本申请构建的系统的全部23个非CODIS系统STR基因座累计匹配概 率(PM)为8.4528×10^-22，累计个体识别力(TDP)为0.99999999999999999999915472， 累计非父排除概率(CEP)为0.999999672。所述各STR基因座在中国汉族人群中具较高的 多态性，可用于法医学个体识别和亲权鉴定。

附图说明

图1：本发明方法和系统的灵敏度检测结果。

图2：本发明方法和系统的种属特异性检测结果。

图3：本发明中25个基因座的荧光标记复合扩增检验系统的等位基因分型标准物。

图4：标准品9948的已知分型结果。

图5A-5B：采用本发明的方法和系统对无关个体DNA样品的STR分型结果。

图6A-6C：采用本发明的方法和系统对已确定亲权关系的三联体实例样品中的STR分型 结果。

图7A-7B：采用本发明的方法和系统对已确定亲权关系的二联体实例样品中的STR分型结 果。

具体实施方式

一、实验材料

1.DNA样本：

标准DNA：9948；黑猩猩、大猩猩、猴、羊、猪、狗、兔等各类物种DNA样本；两个 无关个体的DNA样本；已确定亲权关系的三联体实例的DNA样本；已确定亲权关系二联体 实例(单亲)的DNA样本；209份中国北方汉族无关个体DNA样本；均来自于公安部物证 鉴定中心。

2.仪器

AB 9700型DNA扩增仪 AB公司 博日DNA扩增仪 杭州博日科技有限公司 AB 3130xl型遗传分析仪 AB公司 AB3500型遗传分析仪 AB公司

移液器 Gilson公司 台式离心机 Heraeus公司 超纯水仪 Millipore公司 漩涡振荡器 SI公司 生物安全柜 HealForce公司 GeneQuant Pro核酸蛋白定量仪 Amersham Biosciences公司

3.试剂：

Control DNA 9947A AB公司、Promega公司

实施例1、对本发明的用于对中国人群个体进行个体识别和亲子鉴定的系统的准确性

本发明的所述系统包括DNA提取体系、STR基因座复合检测体系，和推断体系；

所述DNA提取体系用于获得待检测个体的DNA；

所述STR基因座复合检测体系用于获得所述DNA的23个常染色体STR基因座、性别决 定基因座Amelogenin以及Y-STR基因座DYS391的分型结果；

所述推断体系用于根据分型结果进行个体识别和亲子鉴定，

其中所述23个常染色体STR基因座为D1S1627、D3S4529、D2S441、D17S974、D6S1017、 D4S2408、D9S2157、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D20S1082、 D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D9S1122、D2S1776、 D5S2500和D18S51。

利用所述STR基因座复合检测体系进行25个基因座的基因分型，包括：1)提取待检测个 体的DNA作为模板；2)使用所述扩增引物组对提取的DNA模板进行多重PCR扩增反应；3) 将上述扩增得到的产物使用遗传分析仪确定所述基因座的基因型。

1、提取待检测个体的DNA作为模板

使用DNAMiniM48磁珠DNA提取试剂盒提取检测个体的静脉血DNA。提 取步骤按照试剂盒说明书进行。

2、对提取的DNA模板进行多重PCR扩增反应

2.1、引物池配置

扩增引物池的配置，其中所述扩增引物组中为所述25个基因座一一对应的94对扩增引 物；本实施例中，优选的，所述25个基因座的扩增引物组为序列表中SEQIDNo.1至SEQID No.50的核苷酸序列；本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。

所述23个常染色体STR基因座的扩增引物为序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.46的 核苷酸序列；所述性别决定基因座和Y-STR基因座的扩增引物为序列表中SEQIDNo.47至 SEQIDNo.50的核苷酸序列，使用表2所示的荧光PCR扩增引物，按照下表的配置STR反应 混合物：

(2)扩增程序

将STR反应混合物置于PCR仪(AB9700型DNA扩增仪或博日DNA扩增仪)上，调整循环 程序如下表进行扩增：

6.扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

使用DNATyper500(公安部物证鉴定中心)作为内标，按照AB3130xl或3500型遗传 分析仪的使用说明书进行操作。应用GeneMapperID^TM3.2软件进行结果分析。

在本申请的分型结果图中，下面标注有方框的峰为有效峰，方框中数字代表扩增产 物的重复数和片段长度，峰的高度代表产物的丰度，峰的颜色为荧光经激发后产生的颜 色，其中，蓝色的峰代表经FAM染料标记的扩增产物，绿色的峰代表经HEX染料标记的 扩增产物，黑色的峰代表TAMRA染料标记的扩增产物，红色峰代表经ROX染料标记的 扩增产物(图3-图7B中，每幅图从上到下四行峰分别为蓝色、绿色、黑色、红色)。在 不同的分析仪中，荧光染料经激发后产生的光可能与其本身带有的颜色不同，这对本领域 技术人员来说是可以理解的。

7.分型分析

用片段分析软件GeneMapper分析上述步骤中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数 据与等位基因分型标准物(AllelicLadder)(见附图3)比较，得到实际样品的基因分型数据。

8.结果

根据以上1-7的步骤对以下样品进行检测。

1)取标准品9948，由定量PCR方法进行定量后，分别以2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、 0.0625、0.03125ng的模板量分别以30和32扩增循环数(模板量不同，循环数是可变的，本 领域技术人员可以根据需要对二者进行适当调整)，并使用本申请的系统检验并重复1次。 经测试，本发明中25个基因座的荧光标记复合扩增检验系统在DNA模板量最低至0.125ng,扩 增循环数为32下，可检出全部25个基因座。如图1所示，图4为标准品9948的已知分型结 果。

2)使用本申请的系统检测黑猩猩、大猩猩、猴、羊、猪、狗、兔等各类物种DNA样本， 对本发明方法的种属特异性进行验证，经过多次重复试验，结果如图2所示，可以看出，使 用本发明系统的分型结果在分型区无25个基因座之外的扩增产物，说明本发明的方法和系统 具有高的种属特异性。

3)使用本申请的系统检测两个无关个体DNA样品，结果见图5A-5B，分型结果支持这 两个个体为无关个体。

4)使用本申请的系统检测已确定亲权关系的三联体实例样品，获得的分型结果见图6A- 图6C,其中6A是父亲的分型结果，6B是孩子的分型结果，6C是母亲的分型结果。

对应于图6A-图6C的所述三联体实例样品父-孩子-母DNA样本的分型结果如下：

使用本发明的系统 父亲 孩子 母亲 PI D1S1627 13，14 13，14 12，13 1.28 D3S4529 14，16 14，16 15，16 1.71 D2S441 9.1，11 9.1，11 11，14 2.39 D17S974 10，11 10，12 11，12 1.92 D6S1017 10，13 10 10 1.59 D4S2408 10 10，11 10，11 1.87 D9S2157 13，14 12，14 12，14 2.84 Amelogenin X,Y X X - D6S474 14，15 14，15 14，15 1.8 D1GATA113 7，2 7，12 7，12 1.47 D18S853 11，13 11 11 1.64 D20S482 14，16 12，16 12，13 2.1 D14S1434 12，14 13，14 13 1.48 D20S1082 11，15 11 11 1.55 D17S1301 12，13 12，13 12 1.53 D12ATA63 16 14，16 14 1.98 D22S1045 12，14 11，12 11，12 2.39 D10S1248 13，16 13，15 14，15 2.07 D1S1677 14，15 14，15 14，15 1.81 D11S4463 11，13 13，14 13，14 2.04 D9S1122 12 12，13 12，13 1.63 D2S1776 9，11 8，11 8，12 1.9 DYS391 10 - - - D18S51 14，18 14，20 14，20 D5S2500 17，20 17，20 17，18 1.75

由结果可以看出，本发明系统和方法的结果支持该三联体具有亲权关系。

5)使用本申请的系统检测已确定亲权关系二联体实例(单亲)的DNA样本，最终获得 分型验证结果，见图7A-图7B。

对应于图7A-图7B的得到二联体实例(单亲)的DNA样本的分型结果如下：

由结果可以看出，本发明系统和方法的结果支持该二联体具有亲权关系。说明本申请的 系统可以实现对单亲案件的亲权鉴定。

实施例2

根据在209例中国北方汉族人群无关个体中调查获得的数据，计算出荧光标记STR复合 扩增检验体系中国汉族人群中的等位基因频率、基因型频率、观察杂合度、个体识别能力、 多态性信息含量及非父排除率。本研究所构建的体系的全部23个非CODIS系统STR基因座 累计匹配概率(PM)为8.4528×10^-22，累计个体识别力(TDP)为0.999999999999999999999 15472，累计非父排除概率(CEP)为0.999999672。所述各STR基因座在中国汉族人群中具 较高的多态性，可用于法医学个体识别和亲权鉴定。