优化富含蛋白质的微藻生物质的生产效率、感官质量和时间稳定性的方法

摘要

本发明涉及一种优化小球藻(Chlorella)属的富含蛋白质的微藻生物质的下游加工的方法，所述生物质是先前通过在异养条件下和在光不存在下发酵来制备的，所述方法包含：1)提供包含以生物质干重计超过50％蛋白质的生物质；随后在低温下实施以下步骤：2)在发酵结束时收获该生物质，3)洗涤并浓缩该生物质，4)任选地，裂解该生物质，之后在无低温压力下5)任选地，浓缩该生物质浆液，6)施用热处理，7)干燥以这种方式获得的该生物质以获得产物，在该热处理步骤6)之前或之后施用将pH调节到7的步骤。

说明书

本发明涉及一种优化富含蛋白质的微藻生物质的生产效率、感官质量和时间稳定性的方法，所述微藻为小球藻(Chlorella)属，更具体地为普通小球藻(Chlorellavulgaris)、耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)或原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)。

背景技术

所属领域技术人员熟知，小球藻是一种潜在的食物来源，因为它们富含蛋白质和其他必需营养素。

具体地，其含有45％蛋白质、20％脂肪、20％碳水化合物、5％纤维以及10％矿物质和维生素。

在替代性食物来源的寻找中，日益考虑使用微藻(且主要其蛋白质)作为食品，以满足全球对动物蛋白逐渐增加的需求(如FAO所报道)。

此外，欧盟至今已经受多年的植物蛋白的结构性短缺，近年来累计短缺超过两千万吨大豆等效物，目前从南美洲进口。

因此设想大量生产某些富含蛋白质的微藻作为减小此“蛋白质短缺”的可能方式。

广泛的分析和营养学研究已显示，这些藻类蛋白等效于常规植物蛋白，或甚至质量更优。

但是，由于将源自微藻的材料纳入感官上可接受的食物制剂中的高生产成本和技术困难，微藻蛋白的广泛分布仍处于初级阶段。

已报道来自多个物种的具有高比例蛋白质的微藻生物质(参见贝克尔(Becker，生物技术研究进展(BiotechnologyAdvances))(2007)，25:207-210中的表1)。

另外，现有技术中的多个专利申请案(例如专利申请案WO2010/045368)教示，可能调节培养条件以进一步增加微藻生物质的蛋白质含量。

优选地，对于具有这种能力的微藻，在光不存在下且在可同化碳源存在下以异养方式实施培养。

这些用于异养生长的途径通过抑制微藻中叶绿素的合成使得既可能大量生产微藻又可能改良其感官质量，叶绿素是含有其的食物制剂中明显绿茶风味的来源。

为了富集蛋白质含量，在富含氮的培养基中在充足碳源(例如葡萄糖)存在下培养微藻。在这种情形中，氮是由有机来源提供还是由无机来源提供无关紧要。

以这种方式产生的微藻生物质通常含有以细胞干重计至少40％、或甚至高达50％-60％蛋白质。

然而，从以下意义上来说，任何事都不能想当然：除针对产生富含蛋白质的生物质进行的工作、具体地对适宜发酵条件的研究以外，为将所述生物质纳入目标食物制剂中所进行的下游加工会产生其他困难。

照惯例，下游加工包含若干个步骤：

-收集从其生长培养基分离的微藻，

-巴士消毒和洗涤，

-任选地使细胞破碎打开，以从其释放目标分子，

-干燥。

收集细胞的第一步骤是使用一或多个固体/液体分离步骤来实施。

该生物质通常是通过沉降、离心或过滤来收集，并且有时需要另一个絮凝步骤。

在这个使得生物质能被浓缩50到200倍的第一步骤之后，必须快速处理微藻悬浮液，否则其会快速分解。

第一个操作是对所述悬浮液进行巴氏消毒，也就是说将其加热以限制或抑制微生物负荷(污染性细菌的生长)，并且以使容易产生不良气味或风味(“败味”)的某些酶失活。

这个操作照惯例是在高温下短时间进行(其称为“高温/短时间”-HTST-或超高温-UHT-工艺)。

第二个操作是洗涤，推荐用于完整细胞(用多个体积的蒸馏水或去离子水)以清除可溶性杂质。

如果设想破碎打开或破裂细胞的步骤，那么若干个途径是可能的：机械(匀浆器、珠磨、超声波研磨)或非机械(碱途径、冷冻/解冻循环、有机溶剂或渗透冲击)。

根据要破碎的微藻细胞壁的性质和要分离的产物的性质来选择该方法。

最后一个下游加工步骤是将所述悬浮液(完整或裂解的细胞)脱水。已采用若干种方法来干燥小球藻属、栅藻属(Scenedesmus)和螺旋藻属(Spirulina)的微藻。最常用的是喷雾干燥、在干燥滚筒上干燥和冷冻干燥。喷雾干燥是工业规模下最常用的方法。

然而，某些生物质对氧化的敏感性使得需要添加抗氧化剂。

尽管适用于微藻的方法和方法组合多种多样，但所属领域技术人员仍有六个主要困难(下文列为a)到f))尚未令人满意地解决，具体来说是：

a)在下游加工期间蛋白质产率的损失，

b)在使生物质的热失活步骤后蛋白质含量令人遗憾的损失(其可导致高达25％损失)，

c)尽管进行推荐的洗涤步骤，仍生成失控的不良风味或气味(异常特征(offnote))，

d)迄今仍无法解释的所产生批次的时间稳定性和稳定性的再现性的缺乏，因为一些批次是稳定的，而另一些批次不稳定，

e)最终产物中微生物污染的风险，和

f)由于较差的生物质浓缩因素的管理，纯化过程的总能效的下降。

发明内容

为了克服这些缺点，申请公司已选择进行工作来实施适宜的下游加工步骤，其效率可通过以下方式来测量：

a)计算所产生生物质的蛋白质含量和产率和/或干生物质的含量，以及

b)感官分析方法，和/或

c)借助一种由申请公司研发的非常独特的加速陈化方法测量所产生批次的时间稳定性的方法。

本发明涉及一种优化小球藻属微藻的富含蛋白质的生物质的下游加工的方法，所述生物质已事先通过在异养条件下和在光不存在下发酵来制备，所述方法包含：

1)提供包含以生物质的干重计超过50％蛋白质的生物质；

然后，在低温下：

2)在发酵结束时回收生物质，

3)洗涤并浓缩该生物质，

4)任选地裂解该生物质，

然后，在无低温约束下：

5)任选地浓缩生物质悬浮液，

6)施用热处理，

7)干燥所得生物质以获得产物，

在热处理步骤6)之前或之后施用将pH调节至7的步骤。

优选地，生物质包含以干重计超过50％的蛋白质，优选地超过55％，更优选地超过60％、65％或70％。

当在低温下实施这些步骤时，将温度保持在低于8℃，优选地低于4℃。优选地，贯穿本发明方法的步骤2)到4)期间施用这个低温。

优选地，热处理是在低于100℃的温度下进行30秒到5分钟的高温/短时间(HTST)热处理。

或者，热处理是在介于100℃与150℃之间的温度下进行5到30秒的超高温(UHT)热处理。

优选地，每1体积生物质用至多6体积水、优选地用至多3体积水洗涤生物质。

优选地，通过添加KOH或NaOH、优选地通过添加KOH将生物质悬浮液中和到pH7。

优选地，通过研磨、优选地珠磨来裂解生物质中的细胞。

优选地，通过离心或蒸发来浓缩生物质。

任选地，可依据以下参数中的一或多者来测定加工微藻生物质的步骤对产物质量的影响：

-测量生物质中的细胞干重；

-测量糖含量；

-测定蛋白质的量；

-分析挥发性有机化合物；

-测量酶活性，特别是脂氧合酶活性；

-测量着色或色素含量；

-测量金属、特别是铁、铜或镍的含量；

-测定氧化程度。

具体地，比较若干个生物质加工操作对产物质量的影响并选择得到最佳结果的加工操作。

在一具体实施例中，小球藻属微藻选自由普通小球藻、耐热性小球藻和原壳小球藻组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。

具体地，这种方法的目标是研发以高产率产生富含蛋白质的微藻生物质的优化方法；所述生物质没有不良风味或气味且具有时间稳定性。

实施方式

本发明涉及一种优化方法，其使得可满足产生富含蛋白质的微藻生物质的所有特殊要求，更具体地在所述生物质的蛋白质生产效率方面、在感官质量方面和在时间稳定性方面满足要求。

因此本发明涉及一种优化小球藻属微藻的富含蛋白质的生物质的下游加工的方法，所述生物质已事先通过在异养条件下和在光不存在下发酵来制备，所述方法包含：

1)提供包含以生物质的干重计超过50％蛋白质的生物质；

然后，在低温下：

2)在发酵结束时回收生物质，

3)洗涤并浓缩该生物质，

4)任选地裂解该生物质，

然后，在无低温约束下：

5)任选地浓缩生物质悬浮液，

6)施用热处理，

7)干燥所得生物质以获得产物，

在热处理步骤6)之前或之后施用将pH调节至7的步骤。

根据本发明方法的步骤1)，生物质包含以干重计至少50％的蛋白质。甚至更优选地，其包含以干重计至少55％、60％、65％或70％的蛋白质。

本发明的优选微藻可在异养条件下(在作为碳源的糖上并且在光不存在下)生长。申请公司建议选择小球藻属的富含蛋白质的微藻。所用微藻可非穷尽性地选自原壳小球藻、凯氏小球藻(Chlorellakessleri)、微小小球藻(Chlorellaminutissima)、小球藻、耐热性小球藻、黄绿小球藻(Chlorellaluteoviridis)、普通小球藻、瑞氏小球藻(Chlorellareisiglii)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、嗜糖小球藻(Chlorellasaccarophila)、凯氏拟小球藻(Parachlorellakessleri)、拜氏拟小球藻(Parachlorellabeijerinkii)、圆形原壁菌(Protothecastagnora)和莫氏原壁菌(Protothecamoriformis)。优选地，本发明所用微藻属于原壳小球藻物种。

在一个非常具体的实施例中，耐热性小球藻的藻种是来自美国奥斯汀得克萨斯大学(UniversityofTexasatAustin,USA)的藻类培养物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgae)的藻种UTEX1663。在一个非常具体的实施例中，原壳小球藻的藻种是来自英国苏格兰的藻类与原生动物培养物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeandProtozoa)的藻种CCAP211/8D。在液体培养基中培养微藻以产生适当生物质。根据本发明，在含有碳源和氮源的培养基中在光不存在下(异养条件)培养微藻。固体和液体生长培养基一般可在文献中获得，并且关于制备适用于众多种微生物品系的具体培养基的建议可在线参见例如www.utex.org/，一个由奥斯汀德克萨斯大学运营的关于其藻类培养物保藏中心(UTEX)的站点。生物质的产生是在发酵罐(或生物反应器)中进行。

生物反应器、培养条件和异养生长和繁殖方法的特定实例可以任何适宜方式组合，以改良微藻生长的效率和蛋白质含量。所述生物质的产生方法为所属领域技术人员所熟知。

本发明方法的步骤2到4是在低温下实施，也就是说在低于8℃、优选地低于4℃的温度下实施。这个低温使得能停止/减慢细胞代谢以及微生物污染物的发展。

此外，如申请公司已注意到，在低温下实施这些步骤的另一个优点在于，冷却以及有限的加氧促进对引起“异常特征”并且是最终产物的不稳定性的来源的氧化现象的限制。

更具体地说：

-在本发明方法的步骤2)中，在发酵结束时回收生物质。

有利地，在残留营养源(具体地残留葡萄糖)用完后尽快回收生物质。

这些条件使得能优化所产生生物质的生产效率，并且使得能限制必须在洗涤步骤期间去除的残留可溶性物质的浓度。

-在本发明方法的步骤3)中，洗涤并浓缩生物质。

在发酵结束时通过在水中稀释洗涤生物质除去残留可溶性物质(盐、未代谢的糖等)。

每体积生物质用至多6体积水、优选地每体积生物质用至多3体积水，并且在一个非常具体的实施例中，每体积生物质用约1体积水洗涤生物质。

这个操作使得可能显著改良细胞纯度(降低在发酵结束时源自非细胞组份的固体的分数)。

以这种方式减小这种可溶性物质的负载，这种可溶性物质是生物质的感官性质劣化的潜在来源。

这个操作有利地在低温条件下实施。

然后将生物质浓缩到15％到40％固体，优选地20％-30％固体。

其可通过离心使用例如AlfaLavalFEUX510离心机来浓缩。

-在步骤4)中，任选地裂解所得生物质。

研磨或减小细胞壁和细胞内组份。

可使用多种技术来实施裂解，例如微珠研磨和高压匀浆技术。

优选模式是微珠研磨，特别是使用珠磨机的微珠研磨。

照惯例，使用NETZSCHLabstar珠磨机和直径0.5mm的硅酸锆珠粒。

裂解程度可变。例如，可设想50％、60％、70％、80％、90％或95％细胞的裂解程度。

本发明方法的最后三个步骤是在无低温约束的情况下实施。

-在步骤5)中，任选地浓缩所得生物质悬浮液。

通过蒸发来浓缩生物质。可使用任何类型的蒸发器，例如旋转蒸发器、强制流蒸发器、降膜式蒸发器或刮板式薄膜蒸发器。

通过蒸发来浓缩有助于在干燥前通过优化方法的能量性能来改良浓缩因素。这种浓缩还使得可能剥除任何可能对最终产物的感官性质有害的挥发性产物。

-在步骤6)中，施用热处理。

这种热处理起到安全措施的作用以消除最终产物中的任何微生物风险。

照惯例，其是由HTST或UHT处理组成。此外，这种热处理有助于改良最终产物的感官性质。

具体地设想两种不同类型的热处理。

第一种类型是生物质的高温/短时间(HTST)热处理，例如在低于100℃的温度下进行30秒到5分钟。

第二种类型是UHT(超高温)热处理。优选地，UHT热处理是在介于100℃与150℃之间的温度下进行5到30秒，优选地在介于120℃与140℃之间的温度下进行5到15秒。

-在步骤7)中，干燥所得生物质以获得产物。

优选地，干燥是通过喷雾干燥来实施。

喷雾干燥是在喷雾干燥器中实施，其中将呈微细液滴的分散液形式的液体悬浮液喷雾到经加热空气流中，所携载的材料被快速干燥并形成干粉。

现有技术中有多种装置用于喷雾干燥富含脂质的化合物。可能在所提议的设备和技术的文献说明中容易地发现：例如，在1991年由朗曼科学与技术(LongmanScientific&Technical)出版并且在1994年再版的K.马斯特(K.Masters)的喷雾干燥手册(SprayDryingHandbook)中，特别是在其第5版中(可在大英图书馆(BritishLibrary)或国会图书馆(LibraryofCongress)在ISBN0-470-21743-X下获得)，或在喷雾干燥手册(SprayDryManual)，2005中(可在网站www.bete.com获得)。

例如，喷雾干燥可在尼罗移动式小型(NiroMobileMinor)单效喷雾干燥塔或在具有旋风分离器的FiltermatFMD125上实施。

最后的关键步骤在于在热处理步骤6)之前或之后将(已裂解或未裂解的)生物质悬浮液的pH中和到7。

这种中和可通过添加NaOH或KOH、优选地KOH将pH调节到7来实施。这种使用浓氢氧化钾的中和使得可能使下游和生产批次之间的任何可能的pH波动变平滑，并且还改良感官性质。

还可选择添加一或多种抗氧化剂(在将pH中和到7的步骤之前或之后)。

有利地，可能选择抗坏血酸和/或生育酚混合物，优选地抗坏血酸与生育酚的组合。

照惯例，所用比例为150ppm/干物质的抗坏血酸和500ppm/干物质的生育酚混合物(xppm/干物质意指xmg/kg干生物质)。

应明确理解，抗氧化剂的性质取决于要稳定的基质的性质。其必须改良最终产物关于氧化改质的风险的稳定性，且由此通过保持稳定的物理化学和感官概况来改良最终产物的保存。

加工微藻生物质的步骤对产物质量的影响可另外通过以下方式来测定：

o测量产率的损失，具体地分析特别是因热处理期间的“溶解”和其在洗涤时的消除(如果在下游实施后一步骤)引起的细胞固体的损失以及蛋白质含量的损失。

已显示，这种固体损失主要由蛋白质部分组成(其使得可解决上文确定的困难a)和b))；

o具体地由形成以评估各个批次的感官性质的感官小组测定所产生批次的感官质量(以解决困难c))；

o具体地通过加速陈化测试测量时间稳定性，所述测试由初始样品和置于炉中在密封条件和60℃下10天的这个相同样品的比较性感官分析组成(以解决困难d))。

感官分析是根据所述测试来实施。这种分析使得可能突出显示任何氧化描述符，由此使得可能评估样品关于这种氧化降解的稳定性；

o测量在方法的多个步骤中微生物负载随时间的变化(以解决困难e))；

o分析在这一系列操作期间固体(浓缩因素)的变化(以解决困难f))。

申请公司已定义三个评估质量所必需的特征：

-产物中干生物质和/或蛋白质的含量；

-产物的感官质量；和

-产物的时间稳定性。

此外，对于产物质量的评估，还可考虑其他参数，特别是以下参数：

-测量生物质中的细胞干重；

-测量糖含量；

-测定蛋白质的量；

-分析挥发性有机化合物；

-测量酶活性，特别是脂氧合酶活性；

-测量着色或色素含量；

-测量金属、特别是铁、铜或镍的含量；

-测定氧化程度。

借助以下实例将更好地理解本发明，这些实例打算具有非限制性和说明性。

实例

通过原壳小球藻生物质的下游加工产生若干个批次，所述生物质是通过在异养条件下和在光不存在下发酵来制备。所用藻种是原壳小球藻和参照物UTEX250。

各个步骤是如下文所定义的来实施。

HTST处理：生物质的高温/短时间(HTST)热处理，在低于100℃的温度下进行30秒到5min，具体地在75℃下进行1分钟。

洗涤：每体积生物质用至多6体积水洗涤。

添加抗氧化剂：添加抗坏血酸和生育酚混合物，比例优选为150ppm/干物质的抗坏血酸和500ppm/干物质的生育酚混合物。

喷雾干燥：在尼罗移动式小型单效喷雾干燥塔上或在具有旋风分离器的FiltermatFMD125上进行喷雾干燥。

研磨：使用珠磨机进行珠磨。照惯例，使用NETZSCHLabstar珠磨机和直径0.5mm的硅酸锆珠粒。

浓缩：通过旋转蒸发器(实验室规模)或任何其他类型的大规模蒸发器(强制流、降膜式、刮板式薄膜等)浓缩/蒸发20％到30％固体。

UHT处理：在介于100℃与150℃之间的温度下进行5到30秒，优选地在介于120℃与140℃之间的温度下进行5到15秒。

按以下方式研究所获得批次的质量。测定或测量以下参数中的一或多者。

感官质量：由约18人的感官小组针对一组感官描述符评估所产生批次的感官质量。专家小组按顺序强度量表(NFV09-015:1985)评估在3％水溶液中和在55℃下所述批次(样品存于封闭玻璃罐中)的嗅觉性质。

时间稳定性：这个参数是在由申请公司研发的加速陈化测试期间测量，所述测试由初始样品和置于炉中在密闭条件和60℃下10天的此种相同样品的比较性感官分析组成。感官分析使得可能突出显示任何氧化描述符，由此使得可能评估样品对于这种氧化降解的稳定性。

测量产率损失：

-测量细胞干重(DCW)和/或

-测量干生物质和/或

-蛋白质含量。

此外，还可评估其他参数。

糖含量：通过液相色谱测定糖(葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖)的含量。在通过离子交换色谱分离后，通过安培计分析来检测各种物质。

挥发性有机化合物：通过SPME/GC测定挥发性有机化合物的含量。

热处理的分析：通过光学显微术观察细胞形态中产生的变化。

测量着色：借助分光比色计在400nm到700nm的波长下在D65或C施照体下且使用CIE19312°观测器测量反射率测量。测定指数“L”、“a”和“b”，其中“L”对应于亮度，“a”对应于绿色至红色标度，并且“b”对应于蓝色至黄色标度。

色素含量：在将细胞破碎打开后，用90％丙酮萃取色素。然后通过分光光度计分析萃取物。基于在不同波长下记录的吸光度通过计算来量化色素。

金属分析：通过使用磺基硝酸混合物矿化来破坏有机材料，且随后在适当稀释后通过发射光谱法来测定。

测定氧化程度：在异辛烷中稀释后，在232nm下测量吸光度。