奶牛脂肪肝疾病以及奶牛围产期相关代谢疾病的牛血清microRNA分子标记

摘要

本发明涉及分子遗传学，提供了一组奶牛脂肪肝疾病以及奶牛围产期相关代谢疾病的牛血清microRNA分子标记，利用该分子标记可以用于奶牛生产实践中对于患病牛的早期发现和诊断，大大提高诊断的准确性，可以极大程度地避免经济损失。并可用于奶牛的品种选育和种质改良。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学，提供了奶牛脂肪肝疾病以及奶牛围产期相关代谢疾病的牛血清 microRNA分子标记。

背景技术

脂肪肝，是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多，使肝脏中脂肪含量超过5％ (占肝湿重的比例)的病变。脂肪肝是围产期奶牛一种主要的代谢疾病，其发病率在世界各 地高低不一，大致范围在30％～70％之间。我国奶牛脂肪肝的发病率超过30％，美国为35.0％～ 66.0％。死亡率可高达25％。脂肪肝是围产期奶牛一种主要的代谢疾病，尤其常高发于高产奶 牛。患脂肪肝病的奶牛健康状况和繁殖性能都会受到严重影响，且常伴随有其他疾病，如乳 房炎、皱胃移位、胎衣不下和子宫炎等，甚至发展为酮病，使奶农遭受巨大损失。

目前，对于脂肪肝的诊断主要包括血液生化指标检测及影像学诊断。前者检测血液中相 关的生化指标，但是特异性相对较差；后者无创伤性、简单快速，但并不适用于奶牛，有研 究表明，奶牛肝脏甘油三酯含量与超声波图像之间没有明显的相关性。脂肪肝的诊断金标准 仍是肝脏穿刺活检，肝活检虽然可以准确且较直观地诊断奶牛脂肪肝，但会受到取材部位及 范围等的影响，且对奶牛的应激较大，不易被现场人员接受；另一方面，而且采肝样时需要 熟练的操作技术，所以探究一种新的无创伤性的诊断方法是非常有必要的。该研究的目的就 是发掘一种血清学指标用于便捷准确地检测、诊断奶牛是否患有脂肪肝。

miRNA是一类长约22nt的非编码RNA，通过抑制翻译或降解mRNA控制基因表达。miRNA 可稳定地存在于血浆和血清中而免受RNase的破坏，且在相同生理状态的物种血清/血浆中表 达水平非常稳定。体液中的miRNA可能反映了组织中miRNA的变化水平，血清miRNA表达水 平与机体的生理状态相关，血清miRNA作为疾病诊断标志物已受到相当关注。目前对于人的 酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝的诊断也正在开发血清microRNAs作为分子诊断的标记。例 如，在非酒精性脂肪肝病人的血清miR-16表达量显著升高。另外，许多microRNAs与肝脏的 正常功能戚戚相关。miR-27a、miR-145和miR-378等于与脂肪细胞分化相关，miR-122和miR-33 与脂质代谢相关，miR-21、miR-29c和miR-194与肝脏脂肪变性相关。关于血清miRNA与奶 牛脂肪肝的关系目前未见报道。

发明内容

本发明的发明人在上述技术背景下，提供了奶牛脂肪肝疾病以及奶牛围产期相关代谢疾 病的牛血清microRNA分子标记，利用该分子标记可以用于奶牛的品种选育和种质改良，并可 在奶牛生长实践中对于患病牛的早期发现和诊断，大大提高诊断的准确性，可以极大程度地 避免经济损失。

本发明所提供的分子标记主要包括：成熟miRNAs的序列，其编号及对应的核苷酸序列为：

miR-16-5p，编号MIMAT0000785，其核苷酸序列如SEQNO.12所示；

miR-29c-3p，编号MIMAT0000803，其核苷酸序列如SEQNO.13所示；

上述分子标记是从如下备选分子标记中筛选出来的：其编号及对应的核苷酸序列为：

cel-miR-39-3p，编号MIMAT0000010，其核苷酸序列如SEQNO.11所示；

miR-16-5p，编号MIMAT0000785，其核苷酸序列如SEQNO.12所示；

miR-29c-3p，编号MIMAT0000803，其核苷酸序列如SEQNO.13所示；

miR-21-3p，编号MIMAT0004711，其核苷酸序列如SEQNO.14所示；

miR-27a-3p，编号MIMAT0000799，其核苷酸序列如SEQNO.15所示；

miR-33-5p，编号MIMAT0000812，其核苷酸序列如SEQNO.16所示；

miR-122-5p，编号MIMAT0000827，其核苷酸序列如SEQNO.17所示；

miR-145-5p，编号MIMAT0000951，其核苷酸序列如SEQNO.18所示；

miR-194-5p，编号MIMAT0000969，其核苷酸序列如SEQNO.19所示；

miR-378a-3p，编号MIMAT0003379，其核苷酸序列如SEQNO.20所示。

除此之外，本发明的发明人还针对上述成熟miRNAs的序列，公开了其前体序列以及 miRNAs表达检测所用的引物序列，具体如下：

上述分子标记对应的前体，其编号及对应的核苷酸序列为：

cel-miR-39-3p，编号MI0000010，其核苷酸序列如SEQNO.1所示；

miR-16-5p，编号MI0000844，其核苷酸序列如SEQNO.2所示；

miR-29c-3p，编号MI0000865，其核苷酸序列如SEQNO.3所示；

miR-21-3p，编号MI0000850，其核苷酸序列如SEQNO.4所示；

miR-27a-3p，编号MI0000860，其核苷酸序列如SEQNO.5所示；

miR-33-5p，编号MI0000874，其核苷酸序列如SEQNO.6所示；

miR-122-5p，编号MI0000891，其核苷酸序列如SEQNO.7所示；

miR-145-5p，编号MI0000918，其核苷酸序列如SEQNO.8所示；

miR-194-5p，编号MI0000937，其核苷酸序列如SEQNO.9所示；

miR-378a-3p，编号MI0003719，其核苷酸序列如SEQNO.10所示。

所述的分子标记的表达检测所用的引物，其对应的核苷酸序列为：

cel-miR-39-3p-F，其核苷酸序列如SEQNO.21所示；

miR-16-5p-F，其核苷酸序列如SEQNO.22所示；

miR-29c-3p-F，其核苷酸序列如SEQNO.23所示；

miR-21-3p-F，其核苷酸序列如SEQNO.24所示；

miR-27a-3p-F，其核苷酸序列如SEQNO.25所示；

miR-33-5p-F，其核苷酸序列如SEQNO.26所示；

miR-122-5p-F，其核苷酸序列如SEQNO.27所示；

miR-145-5p-F，其核苷酸序列如SEQNO.28所示；

miR-194-5p-F，其核苷酸序列如SEQNO.29所示；

miR-378a-3p-F，其核苷酸序列如SEQNO.30所示。

为了验证上述分子标记的作用，发明人采集了131头产后60天内(以分娩日期为第1 天，泌乳天数为35.5±21.9天)奶牛的血清，根据血清游离脂肪酸(NEFA)、血清谷草转氨 酶(AST)和血清葡萄糖(Glu)三个指标联合诊断，将131头奶牛分别为疑似奶牛脂肪肝群 和正常肝脏奶牛群，然后在疑似脂肪肝群和正常奶牛群中分别选择指标极端个体分为正常奶 牛对照组和脂肪肝奶牛试验组(各8头)，以cel-miR-39-3p为内参基因，分别进行了上述9 种miRNAs的血清学表达检测，它们是miR-21-3p、miR-27a-3p、miR-378a-3p、miR-122-5p、 miR-29c-3p、miR-16-5p、miR-33-5p、miR-194-5p和miR-145-5p。

结果显示：与正常奶牛个体相比，miR-16-5p和miR-29c-3p(miR-16-5p，编号 MIMAT0000785，其核苷酸序列如SEQNO.12所示；miR-29c-3p，编号MIMAT0000803，其核苷 酸序列如SEQNO.13所示)在脂肪肝奶牛个体中表达极显著降低(P<0.01)，这两个miRNAs 可以作为奶牛脂肪肝的分子诊断标记；并由此本发明所提供的分子标记可以在奶牛的品种选 育和种质改良上的应用；还可以在制备奶牛脂肪肝疾病以及奶牛围产期相关代谢疾病的早期 诊断试剂盒中的应用。

综上所述，用本发明所提供的microRNA分子标记作为诊断标记不仅方法简便快速，有 助于在奶牛生长实践中对于患病牛的早期发现和诊断，而且可大大提高诊断的准确性，可以 极大程度地避免经济损失，并且可以未来可用于奶牛的品种选育和种质改良以及奶牛脂肪肝 疾病以及奶牛围产期相关代谢疾病的早期诊断试剂盒的制备。

附图说明

图1为正常奶牛与脂肪肝奶牛血清中miRNA的相对表达情况柱状图，

图2为miR-16-5p作为分子标记诊断脂肪肝的ROC曲线图；

图3为miR-29c-3p作为分子标记诊断脂肪肝的ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1.围产期奶牛脂肪肝患病与否的预诊断以及极端患病个体和正常个体的选择

1.样品采集

试验动物来自山东泰安A养殖场和山东青岛B养殖场。选取的131头泌乳早期(以分娩 日期为第1天，泌乳天数为35.5±21.9天)的中国荷斯坦奶牛。自由采食，饮水。采集样品 日早晨饲前进行采血20ml，无抗凝室温静置1h后，4℃3000rpm离心取血清，分装后置 于-80℃保存备用。

2.试剂

游离脂肪酸(NEFA)测试盒(南京建成生物工程研究所)；天冬氨酸氨基转移酶IFCC法 检测试剂盒(四川省迈克科技有限责任公司)；血糖(GOD-PAP)法测定试剂盒(四川省迈克 科技有限责任公司)。

3.生化指标检测

使用NEFA测试盒，采用比色法，按照说明书测定血清NEFA含量；使用AST和Glu测 定试剂盒，在日立7020全自动生化分析仪中测定血清AST和Glu含量，根据Reid等报道 (Reid,I.,S.Dew,R.Collins,M.Ducker,G.Bloomfield,andS.Morant.The relationshipbetweenfattyliverandfertilityindairycows:Afarminvestigation [J].JournalofAgricultureScience.,1983,101:499–502.)将NEFA、AST和Glu的 测定值代入公式Y＝-0.51-0.003NEFA+2.84Glu-0.0528AST中，计算Y值。若Y＞1为正常肝 脏；若0＜Y＜1为轻度脂肪肝；若Y＜0为重度脂肪肝。然后，选取8头重度脂肪肝奶牛(Y <0)和8头健康奶牛(Y>1)分别作为试验组和对照组进行血清学标记表达检测试验。

4.统计分析

试验数据用平均值±标准差(`X±S)表示，数据统计采用SPSS17.0软件中one-wayANOVA 进行分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

5.围产期奶牛血液生化指标检测结果与分析

本试验根据血清中几种主要生化指标的变化来诊断脂肪肝，因为血糖水平的高低是反应 分娩后机体体况的重要指标，而且可以衡量产后奶牛是否能量处于负平衡状态；血清中NEFA 值的高低是反应机体动用体脂的情况，即是一个反应机体是否动用体脂的重要指标；而AST则 是反应肝脏损伤的重要指标。有人用统计学分析法发现，上述三种指标和组织学检查法符合 率为85％，所以可以说利用血液生化分析法来诊断奶牛脂肪肝是一种切实可行的方法。将各 受试奶牛测得的NEFA、Glu和AST值代入公式Y＝-0.51-0.003NEFA+2.84Glu-0.0528AST中， 当Y＞1时为正常；Y＜1时为脂肪肝。由此算得，患脂肪肝的病牛为64头，占总头数的48.85％。 正常牛与脂肪肝患牛血清中NEFA、Glu和AST值的比较见表1。

表1.正常牛与脂肪肝牛血清中NEFA、Glu和AST值的比较

由上表可以看出，围产期患脂肪肝奶牛与正常奶牛相比，血清中游离脂肪酸和谷草转氨 酶含量升高、血糖含量降低，且均差异极显著(P＜0.01)。游离脂肪酸浓度升高表明脂肪动 员增加；谷草转氨酶浓度升高表明肝功能不全；血糖浓度降低表明存在能量负平衡。

根据上述血液生化指标的检测结果，我们选了8头脂肪肝奶牛(Y<1)作为试验组，8头 健康奶牛作为对照组(Y>1)(奶牛信息见表2)，并且，两组奶牛的血清学指标分别具有极 端的NEFA、AST和Glu值(P＜0.01)。试验组奶牛的胎次与对照组无差异。

表2.试验组脂肪奶牛与对照组正常奶牛的血清学指标比较

实施例2.奶牛血清miRNA在对照组与试验组的差异表达

1.血清miRNA提取

取选取的奶牛血清400μl，加入400μl裂解液MZ，振荡器振荡混匀30sec，室温放 置5min，加入内参cel-miR-39-3p，按照miRcutemiRNA提取分离试剂盒说明书提取miRNA。 提取的miRNA溶于15μlRNase-FreeddH₂O。取1μl样品，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀及浓度，OD₂₆₀/OD₂₈₀应在1.8-2.0之间。置于-80℃保存备用。

2.miRNA反转录

miRNA反转录合成cDNA用TaKaRa公司的PrimeScript^TMmiRNART-PCRKit，按 说明书操作。反转录体系(20μL)：2×miRNAReactionBufferMix10μl，0.1％BSA2μl， miRNAPrimeScriptRTEnzymeMix2μl，miRNA(1μg)及RNaseFreeddH₂O共6μl； 反应条件：37℃60min，85℃5sec，4℃保存。

3.qRT-PCR

将9个(miR-21-3p、miR-27a-3p、miR-378a-3p、miR-122-5p、miR-29c-3p、miR-16-5p、 miR-33-5p、miR-194-5p和miR-145-5p)miRNAs在奶牛血清中进行qRT-PCR验证，根据miRBase 数据库的miRNA基因序列设计和合成PCR反应上游引物如序列表SEQNO.21-30所示；

miRNA实时荧光定量PCR采用SYBRGreenI染料法，在ABI7500荧光定量PCR仪(ABI) 中进行，以cel-miR-39-3p作为内参基因，按TaKaRa公司的PrimeScript^TMmiRNA RT-PCRKit说明书操作；

PCR反应体系(20μL)：SYBRPremixExTaqII(2×)10μl，PCRForwardPrimer (10μM)0.8μl，Uni-miRqPCRPrimer(试剂盒中自带)(10μM)0.8μl，ROXReference DyeII(50×)0.4μl，模板(cDNA溶液)2μl，dH2O6μl；

反应程序：95℃预变性10s→(95℃5s，60℃40s)×40cycles→(95℃15s， 60℃1min，95℃15s)×1cycle。经过优化PCR反应条件后，进行实时荧光定量PCR 检测，在读取Ct值时对于每个cDNA样品均设3个重复。

4.统计分析

试验数据用平均值±标准差(`X±S)表示，数据统计采用SPSS17.0软件中one-wayANOVA 进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。miRNA的相对表达量用2^-ΔΔCt法来计算。miRNA 相对表达丰度使用GraphPadPrism5.01进行绘制(如图1所示)，可见miR-16-5p和 miR-29c-3p在脂肪肝奶牛个体中表达极显著降低(P<0.01)。

实施例3miR-16-5p和miR-29c-3作为脂肪肝诊断分子标记的准确性检测

为检测诊断的准确性，用MedCalc11.4.2.0软件中ROCcurves命令进行分析，并构建 ROC(receiver-operatingcharacteristic，ROC)曲线，用以判断真阳性率和假阳性率之间 的偏差。具体方法是：在Date窗口的第一行命名变量名称为diagnosis和test，diagnosis 中脂肪肝为1，非脂肪肝为0，test为对应的2^-△△Ct数值，使用Statistics/ROCcurves/ROC curveanalyze过程，以test为variable，diagnosis为classificationvariable，作ROC 曲线分析。用曲线下面积(theareaundertheROCcurve,AUC)来分别评价miR-16-5p和 miR-29c-3作为分子标记诊断奶牛脂肪肝的灵敏度(sensitivity)和特异性(specificity)。 用t-test方法对ROC曲线的显著性进行了检验，获得95％的置信区间(confidenceinterval， CI)下AUC的数值和标准值(criterion)两个参数，作为评价ROC曲线的可信度和准确性的 参数。其中，以获得最佳诊断准确性(最佳临界点)时的标准值(2^-△△Ct数值)为分界点，将 被测试对象分为脂肪肝和非脂肪肝的。

结果显示，两个miRNA的ROC曲线分析结果(如图2)显示：miR-16-5p的AUC＝0.984， 95％的CI为0.768-1.000，灵敏度＝87.5％，特异性＝100.0％，此时标准值为0.0038；miR-29c-3p 的AUC＝0.984，95％的CI为0.768-1.000，灵敏度＝87.5％，特异性＝100.0％，此时标准值为0.0055。 两者AUC大小都达到0.984，因此miR-16-5p和miR-29c-3p对奶牛脂肪肝的诊断能力相同， 都分别可以达到较高的准确度和可靠性。

实施例4miR-16-5p和miR-29c-3用于诊断脂肪肝的检测盒

一种奶牛脂肪肝疾病以及奶牛围产期相关代谢疾病中的早期诊断试剂盒，该试剂盒能 够快速、特异的区分脂肪肝代谢紊乱奶牛。具体技术方案是：该诊断试剂盒，包括血清miRNAs 提取裂解液MZ，内参cel-miR-39-3p(编号MIMAT0000010，其核苷酸序列如SEQNO.11所示)， miRNA提取分离试剂,miRNA反转录试剂,反转录通用引物,miR-29c-3p和miR-16-5p的特异 性引物(miR-16-5p-F，其核苷酸序列如SEQNO.22所示；miR-29c-3p-F，其核苷酸序列如SEQ NO.23所示)，qRT-PCR试剂。

具体可参考实施例2中记载的技术方案；

反转录体系(20μL)：2×miRNAReactionBufferMix10μl，0.1％BSA2μl，miRNA PrimeScriptRTEnzymeMix2μl，miRNA(1μg)及RNaseFreeddH₂O共6μl；反应条 件：37℃60min，85℃5sec，4℃保存。

miRNA的定量PCR体系：可采用SYBRGreenI染料法，在ABI7500荧光定量PCR仪(ABI) 中进行。以cel-miR-39-3p作为内参基因，

PCR反应体系(20μL)：SYBRPremixExTaqII(2×)10μl，PCRForwardPrimer (10μM)0.8μl，Uni-miRqPCRPrimer(试剂盒中自带)(10μM)0.8μl，ROXReference DyeII(50×)0.4μl，模板(cDNA溶液)2μl，dH2O6μl。

反应程序：95℃预变性10s→(95℃5s，60℃40s)×40cycles→(95℃15s， 60℃1min，95℃15s)×1cycle。

经过优化PCR反应条件后，进行实时荧光定量PCR检测，在读取Ct值时对于每个cDNA样 品均设3个重复。miRNA的相对表达量用2^-ΔΔCt法来计算。与正常奶牛相比较，miR-16-5p和 miR-29c-3p如果出现极显著降低(P<0.01)，即可诊断为脂肪肝疑似奶牛。

该试剂盒的有益效果：(1)本试剂盒通过cel-miR-39-3p作内参表达校正，与正常奶牛 比较，诊断疑似脂肪肝奶牛的发病与否，为围产期罹患脂肪肝奶牛的早期诊断提供参考依据； (2)本试剂盒可以特异性检测miR-16-5p和miR-29c-3p在血清中的表达量，不受其它因素的 干扰；(3)本试剂盒特异性强、敏感性高、结果稳定等优点，具有广泛的临床应用前景和巨 大的商业价值。

实施例5miR-16-5p和miR-29c-3用于奶牛的品种选育和种质改良

A奶牛品种内，取50头疑似围产期脂肪肝奶牛的血液并制备血清，同时取50头正常奶 牛的血样作为对照。B奶牛品种内，取50头疑似围产期脂肪肝奶牛的血液并制备血清，同 时取50头正常奶牛的血样作为对照。通过提取血清miRNA，反转录后经定量PCR，利用 miR-16-5p和miR-29c-3p的表达判断品种内确定奶牛的发病与否，获得发病个体的概率。这 样，miR-16-5p和miR-29c-3p可作为品种内抗围产期代谢病优秀个体的选留，下一代获得种 质改良。另外，通过比较品种间两组患病奶牛间的miR-16-5p和miR-29c-3p的表达高低特征， 与品种间的抗病力(发病率)相关联进行分析，这样就可以利用miR-16-5p和miR-29c-3p作 为分子标记进行抗脂肪肝(围产期代谢病)品种的辅助选育。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说， 凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。