共交联磷酸盐化的和/或磷酸盐官能化的聚多糖类水凝胶

摘要

一种共交联磷酸化多糖水凝胶，基于(i)葡聚糖、和(ii)透明质酸和/或其盐，所述透明质酸和/或其盐任选地为官能化的，在水凝胶中，所述葡聚糖和透明质酸(和/或其盐，任选地官能化的)通过磷酸二酯和/或聚磷酸二酯共价键互相结合。

说明书

技术领域

本发明涉及基于透明质酸的水凝胶领域。特别地，本发明涉及通过透明质酸与葡聚糖的共交联获得的磷酸化水凝胶，及其制备方法。本发明还涉及所述水凝胶用于活性成分和细胞的封装和缓释的用途，所述活性成分和细胞用于人类和兽医再生医学。

背景技术

玻尿酸或透明质酸(CASNo.9004-61-9，在本文中也缩写为HA)属于粘多糖家族。其为二糖聚合物，更具体地为线性非硫酸化粘多糖,其中包含通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键结合在一起的葡萄糖醛和N-乙酰基-D-葡糖胺D-酸的重复单元(参见Tammi等人在ProgressinHistochemistry&Cytochemistry杂志上发表的文献“Hyaluronanmetabolisminskin”，29(2):1-81，1994)。

透明质酸发现于许多哺乳动物的组织中，更具体地在细胞外组织基质中。由于其结合水分子的能力，其主要作用是组织的水合作用。如果其分子量超过约2MDa并且其质量分数超过约0.1％，其会形成水凝胶；根据其分子量和质量分数，它以这种形式存在于某些组织中，例如关节中，尤其是关节滑液中。它还具有其它作用，例如对诸如细胞迁移、组织分化、血管再生和免疫细胞调节等生物现象的调节作用。因此，现有技术基于其分子量将该分子归于完全不同的功能。

透明质酸在体内经一组酶(称为透明质酸酶)分解(参见K.S.Girish和K.Kemparaju在LifeSciences杂志上发表的文章“Themagicgluehyaluronananditseraserhyaluronidase:Abiologicaloverview”，80(2007年)，p.1921至1943)；也有其它酶参与这一过程。

基于透明质酸的水凝胶是已知的，并且用于很多医疗应用中，特别是以注射形式用于皮肤重建、美容外科及皮肤科、或者用于软骨和骨关节的重建的矫形术(例如，用于膝关节的粘弹性补充治疗)。它们也可以用作细胞培养基用于研究和细胞治疗，或者用于化学治疗。

根据其制备方法和用途，基于透明质酸的可注射的水凝胶可以分为三种不同的类别：

-“导电”水凝胶，包含单独的交联透明质酸(HA)或者与其它聚合物结合的透明质酸，用于在整容手术或粘弹性补充治疗(体内平衡的恢复)中填充皱纹；

-“诱导”水凝胶，包含交联透明质酸，含有生长因子和/或其它所谓的生物活性分子，用于在原位传递中控制它们；

-用于细胞移植的水凝胶，由多种组分构成：聚合物、蛋白质和细胞。

对于人类医学或兽医学的用处，水凝胶必须满足多种标准(参见M.N.Collins和C.Birkinshaw发表的文章“Hyaluronicacidbasescaffoldsfortissueengineering-Areview”,CarbohydratePolymers92(2013),1262-1279,2013；GDPrestwich发表的文章“Hyaluronicacid-basedclinicalbiomaterialsderivedforcellandmoleculedeliveryinregenerativemedicine”，J.ControlledRelease155(2011),193-199)。例如，水凝胶必须是可生物降解的、生物相容的以及可再吸收的；而且它必须易于在生理条件下使用。

通常，术语“生物相容性”是指非生物材料与生物系统相互作用的这样一种能力，要求其通过对宿主具有适当的反应以满足特定功能。

长期以来胶原蛋白(糖蛋白家族)被用作可再吸收的、可注射的填充物。然而，胶原蛋白存在某些缺点，包括出现过敏反应、以及在体内快速降解的风险。

这些都是其被透明质酸盐替代的原因，无论其来源和制备方法(动物、生物技术)，透明质酸盐没有任何过敏反应并且是生物相容的。

当前，透明质酸水凝胶，特别是其盐和/或衍生物，已广泛应用于化妆品领域，特别是用于填充皱纹和皮肤缺损。

透明质酸及其盐可以单独用于水凝胶的制备，也可以与其它聚合物(胶原蛋白、明胶、壳聚糖、硫酸软骨素等等)组合使用，以促进不同组分的协同作用，并且更可靠地模拟细胞外基质。

由于沿着所述链存在的羧基、羟基和乙酰胺官能团，透明质酸可以经化学改性。一方面，这些基团可以用于交联；另一方面，这些基团也可以用于官能化，以提供新的生物性能或改善固有的生物和/或物理化学性质。交联涉及两个多糖链之间和/或同一个链的两个部分之间键的形成。其导致粘度和/或分子量增加，并且驱动其它物理和物理化学性质的改性。

因此，由透明质酸制备水凝胶具有多种可能性。

文献FR2918377描述了一种粘性共交联凝胶，其包含至少一个第一强交联多糖凝胶、和至少一个第二弱交联多糖凝胶，所述第一凝胶通过共价键与第二凝胶结合。强交联凝胶和弱交联凝胶优选地基于透明质酸钠；交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。

文献US6586493描述了一种水凝胶，其得自包含部分不饱和多糖和非-血管生成透明质酸的混合物，所述部分不饱和多糖被交联基团取代。所述混合物的交联是通过加入自由基聚合引发剂(特别是苯乙酮(光引发剂))实现的。由于自由基聚合产生的大量降解产物一旦形成就可能被限制在生成的水凝胶中，因此这个过程是非常不利的。

本发明的目的是提供一种新的基于多糖的水凝胶，其对增加的降解具有良好的抵抗性并且没有细胞毒性，对于美容外科、皮肤科、眼科、骨科用于软骨和骨关节重建、以及人类和兽医再生医学的用途而言，其是可注射的并且是生物相容的。

发明内容

本发明涉及共交联的磷酸化多糖水凝胶，基于(i)葡聚糖和(ii)透明质酸和/或其盐，任选地官能化的透明质酸和/或其盐，在水凝胶中所述葡聚糖和所述透明质酸(和/或其盐，任选地官能化的透明质酸和/或其盐)通过磷酸二酯和/或聚磷酸二酯共价键结合在一起。

有利的是，透明质酸或其盐，为由三偏磷酸钠官能化的磷酰基透明质酸(和/或其盐)。

在本发明一个特定的实施方案中，三偏磷酸钠官能化的透明质酸(和/或其盐)中磷酸盐的浓度介于0.01mEq/g至4mEq/g，更优选地介于0.1mEq/g至2mEq/g。

在本发明另一个实施方案中，水凝胶中磷酸盐的浓度介于0.1mEq/g至3mEq/g，更优选地介于0.1mEq/g至2mEq/g。

本发明还涉及一种制备基于葡聚糖和透明质酸的共交联的磷酸化多糖水凝胶和/或其盐(任选地官能化的)的方法，其中：

a)提供葡聚糖溶液；

b)通过向所述葡聚糖溶液中加入碱金属氢氧化物溶液(例如氢氧化钠)，使得该葡聚糖中的至少一个羟基被激活，从而得到活化的葡聚糖溶液；

c)向所述活化的葡聚糖溶液中加入三偏磷酸钠；

d)向步骤c)中获得的溶液中加入透明质酸和/或其盐，任选地官能化的透明质酸和/或其盐。

有利的是，同时进行该方法的步骤c)和d)，将三偏磷酸钠和透明质酸(和/或其一种盐，任选地官能化的)同时添加至该方法步骤b)中获得的溶液中。

有利的是，在18至25℃的温度下实施所述方法的步骤a)至d)。

在该方法一个特定的实施方案中，步骤b)中加入的碱金属氢氧化物的浓度介于0.1M至1M之间，优选地介于0.1M至0.5M之间。

在该方法另一个特定的实施方案中，该方法步骤d)中加入的透明质酸和/或其盐为用三偏磷酸钠官能化的透明质酸。

有利的是，以粉末的形式添加透明质酸和/或其盐(任选地官能化的)。

本发明还涉及用于制备药物的本发明水凝胶，以及能够通过本发明方法制得的水凝胶，将单独植入或与细胞(任选的干细胞)一起用于细胞疗法；或者将以湿形式用于局部应用中；或者将用于运送活性分子和活性成分，以及更具体的生长因子，优选的生长因子选自：成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源性生长因子(PDGFs)、转化生长因子(TGFs)，血管内皮生长因子(vEGF)，骨诱导生长因子(BMPs)；或者将用于再生医学中，并且更具体地用于人类和/或兽医再生医学。

本发明的最终目的是本发明水凝胶用于骨传导和/或骨诱导的用途，即其用于骨再生的用途。

附图说明

图1至8阐明了本发明的某些方面。

图1为红外光谱(IR)，其示出本发明方法(实施例1)中的反应混合物在25℃下从同时添加透明质酸和三偏磷酸钠TMP开始24小时内的红外曲线的变化(曲线a：添加后22分钟；曲线b：添加后32分钟；曲线c：添加后42分钟；曲线d：添加后52分钟；曲线e：添加后120分钟；曲线f：添加后24小时得到的凝胶)。x轴表示波数，以cm^-1为单位；y轴表示透过率(以％表示，无量纲)。

图2的图表示出碱金属氢氧化物的浓度和三偏磷酸钠的浓度对葡聚糖交联的影响。

图3为根据本发明制备的共交联水凝胶在24小时后的³¹PNMR谱图。

图4示出在3M浓度的NaOH的存在下，三偏磷酸钠在25℃下的两个³¹PNMR谱图。

图5为³¹PNMR光谱，其能够确定凝胶样品中磷酸盐的量，所述凝胶样品通过在强酸介质(HCl4N)中的水解脱水。

图6的图表以浓度和官能化程度(按照分光光度法在450nm处读取)的函数的形式示出由三偏磷酸钠官能化的透明质酸(HH)对人皮肤成纤维细胞的增殖的影响。

图7的图表比较了未被本发明水凝胶吸收的成纤维细胞生长因子在其与水凝胶于NaCl溶液中接触24小时后质量百分比。

图8的图表示出本发明水凝胶对细胞增殖的影响，特别是对干干细胞(被称为“循环血管内皮前体细胞”)增殖的影响。

具体实施方式

定义

在本发明公开的内容中，术语“透明质酸”包含透明质酸盐。

术语“磷酸化的水凝胶”是指这样一种水凝胶，其化学结构包括至少一个磷酸二酯和/或聚磷酸二酯共价键。

术语“共交联剂”是指这样的试剂，其能够在两种不同的多糖之间形成共价键，更具体地在透明质酸(任选官能化的)或者其一种盐和葡聚糖之间形成共价键；所述共交联剂选自用于使这些相同的多糖交联的已知交联剂。因此，在本发明的上下文中，术语“共交联剂”和“交联剂”指的是相同的化学试剂(即三偏磷酸钠)。

术语“共交联多糖水凝胶”是指这样一种水凝胶，其包括至少两个不同的、通过共价键结合在一起的多糖。

术语“共交联磷酸化多糖水凝胶”是指这样一种水凝胶，其包括至少两种不同的、通过如下所示的磷酸二酯和/或聚磷酸二酯共价键结合在一起的多糖(R₁和R₂分别表示第一和第二经取代的多糖)。

术语“官能化的透明质酸”(本文中缩写为HH)是指被多种有机基团(至少部分地)取代的透明质酸(或其一种盐)。

在以下对本发明的详细描述中，所提及的反应机理仅是假设和启发式模型，其不限制本发明的范围。

详细说明

在本发明的上下文中，申请人已经证明，透明质酸(任选官能化的)或其一种盐，在其与活化的葡聚糖的混合物中，使用三偏磷酸钠作为交联剂，能够获得具有改进的生物学特性的共交联磷酸化水凝胶。申请人已经证明，通过共交联磷酸化多糖水凝胶实现了本发明的目的，所述水凝胶是通过下文中详细描述的特定的和优化的方法获得的。

根据本发明，透明质酸可以任选地以生理上可接受的盐的形式使用，并且可以被官能化。

根据第一方面，本发明涉及一种制备共交联磷酸化多糖水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供葡聚糖溶液；

b)通过向所述葡聚糖溶液中加入碱金属氢氧化物溶液(例如，氢氧化钠NaOH)，使得该葡聚糖中的至少一个羟基被激活，从而得到活化的葡聚糖溶液；根据下述反应，此步骤使得所述至少一个羟基转化为醇化基团，由此转化所得葡聚糖被称为“活化的葡聚糖”：

DexOH+NaOH→DexONa

c)向所述活化的葡聚糖溶液中加入三偏磷酸钠。如以下反应方案1.1所示，此步骤通过葡聚糖醇化基团中的氧对三甲基磷酸酯中磷的亲核攻击使得活化的葡聚糖交联。根据以下反应方案，在交联的过程中可能发生多种反应(来自DexONa的箭头象征葡聚糖醇化物中的氧对三偏磷酸盐的亲核攻击)。

反应方案1：活化葡聚糖的可能的交联反应

d)将透明质酸(HA)、任选官能化的透明质酸(HH)、或其一种盐加入步骤c)所得溶液中；优选地，该添加以粉末形式进行，而不是加入透明质酸溶液(任选官能化的、或其一种盐)。在透明质酸(HA或HH)的添加过程中和水凝胶的形成过程中，保持反应介质处于搅拌状态。此步骤期间的温度有利地介于18℃至25℃。

此步骤d)使得活化的葡聚糖与透明质酸、任选官能化的透明质酸、或其一种盐共交联，从而形成共交联磷酸化多糖水凝胶，直到获得所述水凝胶为止，保持所述混合物处于搅拌状态。反应时间通常介于10至40分钟(优选地介于20至30分钟)，以便形成所述水凝胶。然后，将制得的水凝胶放置在室温下(通常为18-25℃)，从而结束反应。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)的分析表明多糖链上存在磷酸酯(参见图1和实施例中提供的解释)。

因此，根据本发明的磷酸化水凝胶包含第一多糖(葡聚糖)和第二多糖(透明质酸、任选官能化的透明质酸、或其一种盐)，所述多糖通过磷酸二酯和/或聚磷酸二酯共价键结合在一起。

三偏磷酸钠或STMP(CASNo.7785-84-4)具有分子式Na₃P₃O₉，是对人类无毒的化合物(参见，例如K.Woo和P.A.Seib在CarbohydratePolymers杂志上发表的文章，1997(33)，263-271)，其商业应用于食品工业。三偏磷酸钠可能受到亲核攻击从而使STMP环打开。科学文献中已提出多糖醇化物对三偏磷酸钠的亲核攻击的反应机理(参见S.Lack等人在CarbohydrateResearch杂志上发表的文章“High-resolutionnuclearmagneticresonancespectroscopystudiesofpolysaccharidescross-linkedbysodiumtrimetaphosphate:aproposalforthereactionmechanism”，342(2007)，P.943-953)。

使用三偏磷酸钠作为交联和共交联剂对本发明方法是至关重要的，因为它有可能得到不溶于水的交联磷酸盐化多糖。此外，由于这种化学试剂的具体使用，以及透明质酸(任选的官能化的透明质酸)与葡聚糖之间的协同效应，相对于简单交联的透明质酸水凝胶(即不加入其它的多糖，透明质酸自身进行交联)，本发明的共交联磷酸化多糖水凝胶对透明质酸酶(负责体内透明质酸降解的酶)具有更好的酶促降解抗性。最后，就细胞增殖而言，本发明水凝胶具有非常明显的改进。

以下列出制备共交联磷酸化水凝胶的条件。

首先，通过三偏磷酸钠制备基于交联葡聚糖的水凝胶。葡聚糖的交联反应分两步发生；第一步包括葡聚糖中最具反应性的羟基(即葡聚糖中C₂上的羟基)的活化，以形成葡聚糖醇化物(本文中也称为活化的葡聚糖)，以及随后的葡聚糖醇化物对三偏磷酸钠的亲核攻击(参见上述反应方案)。

在交联反应中，观察到某些副反应。其中特别是磷酸盐桥的碱性水解，因此使水凝胶增溶(参见下文反应方案No.2)。另一个副反应为三偏磷酸钠碱性降解为三聚磷酸钠(TPP)(参见下文反应方案No.3)。这些副反应在本发明的上下文中是不希望的。

反应方案No.2：磷酸盐桥碱性水解的示例

反应方案No.3：三偏磷酸钠碱性降解为三聚磷酸盐(TPP)

为了限制这些副反应，发明人发现了碱金属氢氧化物和三偏磷酸钠STMP的最佳浓度范围(参见图2：图2中所示的碱金属氢氧化物的浓度对应于葡聚糖活化阶段碱金属氢氧化物的浓度；所示出的STMP浓度对应于反应介质(葡聚糖+碱金属氢氧化物+STMP)中STMP的浓度)。所述氢氧化物的浓度优选介于0.5M和5M之间，从而使所述葡聚糖的羟基活化。在优选的实施方案中，活化步骤中所述氢氧化物的浓度介于0.5M和1M之间。类似地，反应介质中STMP的浓度优选介于0.26M和1M之间，其对应于[STMP]/[OH]比介于0.1和0.4之间。事实上，对于氢氧化物浓度高于5M的情况，其促进磷酸盐桥的碱性水解，对葡聚糖的交联不利。此外，对于STMP浓度低于0.26的情况，观察到没有交联，而对于浓度高于1M的情况，所述STMP变得不溶于水。

有利地，本发明方法在18℃到25℃的温度下进行。事实上，即使提高反应介质的温度具有缩短溶液胶凝时间的作用，但是它加速了所形成的磷酸盐桥的水解。这就是为什么在室温下实施该方法是更有利的，其目的是为了限制所形成的磷酸盐桥的水解。低于18℃时，交联反应变得非常慢。

在制备方法的描述中，该方法的各个步骤在碱性介质中进行，其pH值基本上相同。在pH值能达到8至14之间的碱性介质中实施各步骤，优选地pH值为8至10之间。

在本发明方法一个非常有利的实施方案中，将透明质酸、任选的官能化的透明质酸、或其一种盐与三偏磷酸钠同时(和分别地)加入反应介质中；由此将该方法的步骤c)和d)结合在一起。申请人能够观察到，由该方法获得了最好的胶凝结果。事实上，对于透明质酸(或官能化的透明质酸)在碱性介质中的稳定性问题，同时添加其与三偏磷酸钠是有利的。有利地以粉末的形式添加HA和/或HH，这一点同样适用于三偏磷酸钠；相对于以溶液添加的形式，这种做法促进交联并且减少副反应的量级。在任何情况下，无论是以粉末的形式(优选的)还是以溶液的形式(较不优选)实施该方法，有利的是在单独的空间中同时加入HA和/或HH、以及三偏磷酸钠，即添加粉末和/或溶液是分开的，在反应混合物的不同位置进行。

优选地，本发明方法中使用的透明质酸(HA和/或HH)具有介于10kDa至5000kDa之间的分子量，优选地介于10kDa至1200kDa之间，并且更优选地介于25kDa至1200kDa之间。这种选择的动机产生于本发明含有磷酸化透明质酸(任选官能化的)的水凝胶的应用，所述透明质酸具有用于以下生物效应的分子量：

-低分子量的透明质酸，即低于50kDa，优选地介于25kDa至50kDa，并且更优选地介于10kDa和50kDa，其优选用于诱导血管生成作用；

-分子量介于50kDa至300kDa的透明质酸，优选用于细胞增殖和迁移；

-分子量高于800kDa且至高达5000kDa的透明质酸，优选用于维持组织水合作用的效应。

优选地，本发明方法中所用的葡聚糖具有介于10kDa至2000kDa之间的分子量，优选地介于40kDa至500kDa之间，这是由于与本发明水凝胶的应用相关的原因(只是这种优选没有HA和HH的分子量的优选那么重要)。

在特别有利的实施方案中，本发明方法步骤d)中添加的透明质酸(步骤d)可能与步骤c)同一时间进行)为三偏磷酸钠官能化的透明质酸)。所述官能化透明质酸的合成分成两步进行。在所谓活化步骤的第一步中，添加氢氧化钠溶液以活化所述透明质酸的羟基。优选的是，活化阶段在低于8的碱性pH值条件下进行，否则可能会发生新的副反应，即环状三偏磷酸盐分子的自发开环。然后将醇化物形式的三偏磷酸钠加入透明质酸溶液中，从而进行所谓的官能化步骤。

在本发明方法的步骤d)之后，根据本领域技术人员熟悉的常规技术对官能化、磷酸化的透明质酸进行纯化和干燥，特别地可以使官能化的透明质酸在乙醇(或丙酮)中沉淀从而除去残余痕量的共交联剂，然后用渗透水透析直到pH值和透析水的电导分析接近渗透水的值(pH＝5.6、电导分析<30μs/cm)。可以对如此纯化的透明质酸进行冻干处理。

发明人已经观察到，本发明水凝胶在透明质酸酶的存在下的酶促降解比在葡聚糖酶的存在下的酶促降解快；并且，如果水凝胶是强交联的，其分别在两种酶存在时的降解均得以减慢。

对于本发明水凝胶作为细胞培养的培养基的应用(特别是在研究和细胞治疗)，一个重要的方面是透明质酸被磷酸盐的官能化程度。从磷酸盐浓度仅为0.01mEq/g开始就观察到细胞增殖的改善。所述含量优选地至少为0.05mEq/g，而且甚至更优选地至少为0.1mEq/g(单位“mEq/g”也被称为“毫当量/克”，相当于每克产品的1毫摩尔)。

本发明产品具有许多优点，并且就以下性质具有特别优良的折中：物理化学性质、生物相容性、移植、对酶促降解的抗性、无细胞毒性。通过优化实施透明质酸与葡聚糖的共交联获得这一结果，从而制备基于共交联磷酸化多糖的水凝胶。

我们在此以举例的方式示出本发明水凝胶的几种用途。

对于本发明水凝胶在细胞治疗中的用途，制备本发明水凝胶，并且引入合适的细胞营养素(氨基酸等)和生长因子。可以通过冷冻干燥和/或冷冻的形式储存该产品。冻干产品复水后，所述水凝胶可以用于局部(例如作为敷料)或以注射的方式使用。

对于本发明水凝胶作为活性成分的传输系统的用途，以粉末形式制备本发明水凝胶，水合所述水凝胶(无论是用生理血清或预定量的一种或多种活性成分，例如生长因子和/或抗炎剂和/或抗生素，或富含血小板的血浆，以获得具有所需稠度的水凝胶(饱和凝胶))，并且将所述产物沉积在目标部位(例如，轻微骨折、轻微撕裂、或腱或肌肉撕裂)。

本发明的其它目的、特征和优点将展现在以下实施例中，其不对本发明构成任何限制。

实施例1：

根据本发明的方法使用透明质酸(HA)和葡聚糖制备共交联的水凝胶

i)用0.5M的NaOH溶液活化葡聚糖的羟基

将0.9克葡聚糖T100(CASNo.9004-54-0、100,000g/mol)置于50ml水溶液中，然后向所得溶液中加入5ml浓度为0.5M的氢氧化钠。室温下，搅拌该混合物、持续搅拌30分钟。

ii)向步骤a)的溶液中同时加入0.1克透明质酸(500K、摩尔重量400-600kDa、HA/HA+葡聚糖的比＝10％)和1.02克三偏磷酸钠(作为交联剂)(以粉末形式、空间上分开)。

室温下，继续搅拌混合物直至胶凝，然后将所得凝胶在25℃下保持5小时。

iii)洗涤、纯化和干燥所得水凝胶

在不锈钢制的筛上研磨水凝胶，并收集在丙酮溶液中。用水进行多次洗涤，同时监测pH值，直至所得洗涤液的pH<7；对于所实施的每个洗涤步骤，使用具有醋酸纤维素过滤器的布氏漏斗对水凝胶进行过滤。最后用丙酮洗涤，然后于烘箱中在真空、60℃的条件下干燥所得水凝胶。

iv)化学特性

透明质酸(500K、摩尔重量400-600kDa)和葡聚糖T100在共交联反应中IR光谱的变化参见图1。实验条件如下：

FT-IR“SpectrumOne”PerkinElmer仪器公司的光谱仪，由ATR(衰减全反射)探针进行分析。

主要IR吸收带的特征示于下表1中。

表1：主要IR吸收峰的特征

波数(cm^-1)基团振动模式1260P＝O(磷酸盐)伸长1153第二-OH伸长1087第二-OH价键振动(vC-O)1006第一-OH价键振动(vC-O)906P-OR(磷酸酯)伸长

在共交联反应中，用红外光谱监测反应示出了醇化物对三偏磷酸钠的亲核攻击，所述伯醇的特征峰(1006cm^-1)减弱，取而代之的是仲醇的特征峰(1153cm^-1)。1260cm^-1和906cm^-1处的红外吸收峰表明磷酸和膦酸酯(磷酸二酯键)的形成。

对所收集的水凝胶的³¹PNMR谱图(Bruker250MHz-NMR磷分析；方式：质子照射；频率：101MHz)也进行了分析(D₂O溶剂)并示于图3中。位移δ＝-4.3ppm、δ＝-10.5ppm和δ＝-19.5ppm处的特征信号显示磷酸酯的形成。

v)磷酸盐含量的测定

使用根据本发明所得水凝胶进行磷酸盐测试，脱水，然后于下列条件下在酸性介质(HCl4N)中水解：

在酸性介质中水解所述以酯的形式结合在糖类基序上的磷酸盐和聚磷酸盐。处理完成后，它们被中性地转化为正磷酸的单体基序。³¹PNMR给出这样的信号，位于-0.64的特征位移是正磷酸的特征。因此，确定水解产物中磷酸盐的存在量是可能的。以苯基膦酸PhPO₃H₂作为基准物(参见图5)。

磷酸盐含量：1.06mEq/g(1mEq/g相当于每克脱水的凝胶经水解后产生1毫摩尔的磷酸)。

实施例2：经三偏磷酸钠(TMP)官能化的透明质酸(HH)的制备：得到磷酸化透明质酸

本实施例的目的是制备能够用于本发明方法步骤d)的官能化透明质酸。

将0.20克分子量分布在400kDa至600kDa范围内的透明质酸(SigmaAldrich公司-CASNo.9004-61-9-500K、400-600kDa)置于30ml水溶液中，然后在所得溶液中加入0.3ml浓度为0.1M的氢氧化钠(CASNo.:1310-73-2)。室温下，搅拌该混合物、持续搅拌30分钟。

将0.09克三偏磷酸钠(SigmaAldrich公司、CASNo.7785-84-4)溶解于10ml水中，然后将其加入到活化的透明质酸溶液中。室温下，搅拌该混合物、持续搅拌3小时。

然后用1M的盐酸溶液(CASNO.7-647-01-0)中和反应介质，从而使pH值接近6，并且使反应介质在97％的乙醇(SigmaAldrich公司-CASNo.64-17-5)中沉淀。

将沉淀物溶解在渗透水中，并且在透析膜中透析48小时。然后，将溶液在细胞(Millipore)中浓缩并且进行冻干。

细胞增殖试验

该试验的目的是量化透明质酸的官能化对于人皮肤成纤维细胞的增殖的影响。基于溴脱氧尿苷的掺入检测(BrdUELISA试剂盒-罗氏)，采用ELISA试验对细胞的增殖进行评价。BrdU为DNA中含氮碱基的类似物，其将在细胞分裂期间DNA复制的过程中掺入到DNA中。因此能够使用与酶结合的特异性抗体对其进行检测，然后可以进行比色试验并且对增殖进行评价。

对于它们的前体，根据官能化透明质酸的官能度和浓度(参见下图6和下表2)，其具有多种行为：

-未观察到增殖有任何改善，所有的浓度组合：(HH015、HH016、HH017、HH023和HH024)；

-观察到增殖有相同程度的改善，但是最佳浓度低于AH1200的浓度：HH020和HH025(0.1mg/ml或0.25mg/ml的峰与AH1200的0.5mg/ml或1mg/ml的峰相比)；

-观察到增殖有很明显的改善：HH021和HH022。

表2：官能化的透明质酸的化学性质

实施例3：根据本发明方法使用官能化透明质酸(HH)和葡聚糖制备共交联水凝胶

i)用0.5M的NaOH溶液活化葡聚糖的羟基

将0.9克葡聚糖T100(CASNo.9004-54-0；Mw＝100,000g/mol)置于50ml水溶液中，然后向所得溶液中加入5ml浓度为0.5M的氢氧化钠。室温下，搅拌该混合物、持续搅拌30分钟。

ii)添加官能化透明质酸(HH22)和交联剂

将1.02克三偏磷酸钠和0.2克官能化透明质酸(HH22)同时加入(以粉末的形式、空间上分开的)到步骤a)的溶液中。室温下，继续搅拌混合物直至胶凝，然后将所得凝胶在25℃下保持5小时。

iii)洗涤、纯化和干燥所得水凝胶

在不锈钢制的筛上研磨水凝胶，并收集在丙酮溶液中。

用水进行多次洗涤，同时监测pH值，直到所得洗涤水的pH值小于7。对于所进行的每个洗涤步骤，用醋酸纤维素过滤器在布氏漏斗上对所得水凝胶进行过滤。

最后用丙酮洗涤，然后于烘箱中在真空、60℃的条件下干燥所得水凝胶。

iv)细胞毒性

为了评价细胞的附着和增殖能力，在基于葡聚糖和官能化透明质酸的水凝胶的存在下，对本发明水凝胶不具有细胞毒性进行检验。对此，对培养基中化合物的释放进行评价。将干燥的水凝胶置于6孔培养皿(每种水凝胶6孔)，并使之在4ml培养基中溶胀：

-DMEM(DMEM＝杜氏改良伊戈尔培养基-PAA)，一种含有氨基酸、矿物盐(KCl、MgSO₄、NaCl、NaH₂PO₃)、葡萄糖和维生素(叶酸、烟酰胺、核黄素和维生素B12))的细胞培养基+2.5％FBS(胎牛血清-PAA)用于其中3个孔；

-DMEM+10％SVF用于其它3个孔。

然后将凝胶放置在37℃培养箱中72小时。收集培养上清液，然后以1200rpm的速度离心5分钟，以便从上清液除去任何凝胶碎片。然后将200μl各上清液加入96孔培养皿中，所述培养皿在4小时前已经接种了5000成人皮肤成纤维细胞(HDFa-TebuBio公司)，从而使HDFa有时间附着。各上清液在三个独立的孔中进行测试。将细胞置于37℃培养箱96小时，随后进行MTT生存测试。

该测试基于四唑盐的降解，其通过线粒体脱氢酶降解为甲臜(一种积聚在线粒体内的不溶性紫色化合物)。在37℃下所述细胞在0.625μg/ml的MTT的存在下培育4小时后，倾倒除去培养基，通过加入100μl的乙醇/DMSO混合物(体积比体积)使所得结晶溶解。然后，通过分光光度法在570nm的波长下读出结果。

基于葡聚糖和官能化透明质酸的水凝胶无一对人皮肤成纤维细胞具有毒副作用。

vi)细胞增殖试验

在两种实验条件下进行测试：(i)在水凝胶薄层上接种细胞；(ii)在水凝胶直接在培养基中溶胀的时候将细胞混合至水凝胶中。

在水凝胶的存在下进行细胞培养72小时后，对细胞活性进行评价。细胞接种之后，水凝胶被真核生物透明质酸酶消化。对收集到的细胞进行台盼蓝排斥的活性检验。用光学显微镜和扫描显微镜观察干细胞对水凝胶的定殖，以证实细胞在水凝胶中的分布。

实施例4：成纤维细胞生长因子(FGF)释放试验

该实施例的目的在于演示本发明水凝胶在其降解时以可控的方式释放扩散生长因子的能力。在该实施例中，合成四种受测的本发明磷酸化水凝胶(DPD1、DPD2、DPD3、DPD4)和两种对照水凝胶(DP1、DP2)。对照水凝胶DP1和DP2仅由葡聚糖形成。这些水凝胶的组分列于下表3中。这些组分可以包含葡聚糖T100(100,000g/mol)和/或葡聚糖T500(500,000g/mol)。

表3合成的水凝胶的组分

为了证明本发明水凝胶与成纤维细胞生长因子之间的亲和力，进行生长因子释放实验。在合成的水凝胶(5mg)溶胀的时候，使该水凝胶与生长因子(50ng)接触，然后置于4℃温度下的磷酸盐缓冲液(SPB)中。在相互作用12小时之后，将缓冲液替换为氯化钠水溶液(1M的NaCl)并保持12小时，然后再替换为1.5M的NaCl溶液并保持12小时。最后，收集上清液，以便通过化验确定未被水凝胶吸收的生长因子的百分比。

不束缚于任何特定的理论，氯化钠盐水溶液的使用，通过增加离子强度，使得成纤维细胞生长因子不被吸收，从而特别地使之从待测水凝胶中分离。根据水凝胶的组分，成纤维细胞生长因子的吸收能力是不同的。如图7所示，本发明水凝胶(DPD1、DPD2和DPD3)在与NaCl溶液接触24小时之后仍保留了40质量％的生长因子，而相比之下仅由葡聚糖形成的对照水凝胶(DP1和DP2)在24小时后释放了超过70％的生长因子。

因此，本发明水凝胶可以用于生长因子的受控释放。因此，随着时间变化的受控扩散是可能的，使得生长因子随着水凝胶的降解而释放。

实施例5：细胞增殖试验

该试验的目的是为了测试本发明水凝胶中的细胞增殖，特别是干细胞，并且更具体地为循环内皮祖细胞(CEP)的增殖。循环内皮祖细胞是未成熟的细胞，存在于外周血中，在此它们的生理作用是维持血管的完整性。它们起源于骨髓，然后传递到血液中，在那里形成非常稀有细胞群。它们参与新血管的形成，例如血管损伤后的血管再生过程中。在培养过程中，这些细胞形成血管内皮细胞集落，从而迅速地获得强大的增殖能力。在水凝胶介质上进行循环内皮祖细胞的培养，这将使它们存活并增殖，并且通常使用明胶作为对照培养基。

在这些实施例中，对不同初始量的CEP干细胞进行了测试，并且在培养48小时后，对CEP细胞进行计数。其结果以质量百分比表示，并且以所述水凝胶的总质量为基准。根据这些结果以及图8所示，无论最初引入的细胞数量的多少，对照水凝胶DP1和DP2不会促进或者甚至不能使细胞增殖。本发明水凝胶，更具体而言水凝胶DPD4，是一种显著促进细胞增殖的培养基，对于初始引入的3000个细胞，该水凝胶使细胞增殖增加了100％(参见图8中的结果)。