三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明提供了一种三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变的检测试剂盒，其包括特异性引物及其相关反应溶液，本发明同时提供了试剂盒的检测方法，本发明设计巧妙、简易可行、结果准确可靠，可在各级医院进行推广，对于评估TNBC患者发生肿瘤转移的风险提供了帮助，有助于临床上对该类患者进行早期干预及治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因诊断学领域，为检测与三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变的试剂盒，通过检测TNF-α基因启动子区308G>A遗传变异（rs1800629）预测三阴性乳腺癌的转移风险。

背景技术

三阴性乳腺癌（triple-negativebreastcancer，TNBC）作为一种特殊亚型，特指雌激素受体（estrogenreceptor，ER）、孕激素受体（progestronereceptor，PR）、表皮生长因子受体2（humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2）均为阴性的乳腺癌，约占全部乳腺癌的15%，好发于年轻妇女，大约1/3的患者术后2-3年内发生复发和转移，并且在复发后快速进展直至死亡。在TNBC患者中及早评估其转移风险，筛选出转移风险高的患者并对该人群进行密切检测及早期干预治疗将有助于临床上改善TNBC患者预后。尽管三阴性乳腺癌转移风险高且预后较差，目前并未存在能够评估TNBC患者转移风险的分子生物学及基因诊断方法。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种快速有效的检测TNF-α基因启动子区308G>A遗传变异从而检测三阴性乳腺癌的试剂盒，同时提供了其具体检测方法。

本发明试剂盒中的各组分及含量如下：

10×PCR反应缓冲液1.0ul；

25mMMgCl₂溶液0.5ul；

2.5mMdNTPMixture1.0ul；

5U/ulTaqDNA聚合酶0.25ul；

10uM引物F0.25ul；

10uM引物R0.25ul；

10×内切酶反应缓冲液2μl；

10U/μlNcoI内切酶0.5μl。

灭菌蒸馏水13.5ul；

所述引物F的序列如下：5’-CCCCAAAAGAAATGGAGGCAATAGGTTTTGAGGGCCATG-3’（SEQ:ID:NO:1）；

所述引物R的序列如下：5’-GTTGGGGACACACAAGCATC-3’(SEQ:ID:NO:2)；

本试剂盒为一人次检测用量，保存温度-20℃。

具体检测步骤如下：

1）取三阴性乳腺癌患者外周血基因组DNA；

2）PCR反应：

反应体系总体积为10ul，包括10×PCR反应缓冲液1.0ul，25mMMgCl₂溶液0.5ul，dNTPMixture(2.5mM)1.0ul，TaqDNA聚合酶0.25ul（5U/ul），特异性引物对F和R（10uM）各0.25ul，灭菌蒸馏水6.0ul，DNA1.0ul；反应条件为95℃5分钟，此后进行35个循环的98℃10秒、55℃30秒、72℃30秒，最后一步为72℃5分钟；

3）限制性内切酶酶切

在步骤2）所得产物加入试剂盒中所包含10×内切酶反应缓冲液2μl，NcoI内切酶0.5μl(10U/μl)，去离子水7.5μl，在37℃条件下水浴1小时；

4）3％琼脂糖凝胶电泳检测上述所得酶切产物，根据电泳条带大小判断是否存在TNF-α308G>A遗传变异，判断方法如下：

（1）若rs1800629位点上两个等位基因均存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见仅171bp处存在条带；

（2）若rs1800629位点上仅一个等位基因存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见171bp、131bp处均存在条带；

（3）若rs1800629位点上并未存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析仅在131bp处可见条带。

携带A等位基因的三阴性乳腺癌患者发生肿瘤远处转移的风险高（OR=5.83,95%CI:1.64–20.76,P=0.004）。

TNF-α基因启动子区域的rs1800629号SNP位点的多态性与女性三阴性乳腺癌的远处转移相关，因此，可用于评估三阴性乳腺癌的转移风险。当三阴性乳腺癌患者DNA的TNF-α基因启动子区域的rs1800629号SNP位点基因型为AA或AG时，个体的肿瘤转移风险较高。

尽管三阴性乳腺癌转移风险高且预后较差，目前并未存在能够评估TNBC患者转移风险的分子生物学及基因诊断方法。本发明的创新点在于从分子生物学及基因诊断水平上，首次提供筛选三阴性乳腺癌患者中存在高转移风险人群的技术方法。本发明通过针对rs1800629位点进行巧妙的引物设计，仅依靠普通PCR及琼脂糖凝胶电泳，即可发现TNBC患者中是否存在TNF-α基因308G>A变异。该技术方法设计巧妙、简易可行、结果准确可靠，可在各级医院进行推广，对于评估TNBC患者发生肿瘤转移的风险提供了帮助，有助于临床上对该类患者进行早期干预及治疗。

附图说明

图1为不同类型患者的电泳检测结果对比图。

具体实施方式

为更清楚地阐明本发明的技术方法，以下将对该发明的技术方案进行详尽阐述，举例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。具体操作步骤如下：

实施例1：

一种三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒，其组分及含量如下：包括10×PCR反应缓冲液1.0ul，25mMMgCl₂溶液0.5ul，dNTPMixture(2.5mM)1.0ul，TaqDNA聚合酶0.25ul（5U/ul），特异性引物F和R（10uM）各0.25ul，灭菌蒸馏水6.0ul。本试剂盒为一人次检测用量，保存温度-20℃。

步骤1：三阴性乳腺癌患者外周血DNA提取：

使用血液基因组DNA提取系统（离心柱法）提取患者外周血基因组DNA。

步骤2：PCR反应，复制目的片段：

（1）根据TNF-α启动子区基因序列设计特异性引物扩增包含rs1800629位点的DNA片段设计引物序列如下：

F:5’-CCCCAAAAGAAATGGAGGCAATAGGTTTTGAGGGCCATG-3’

R:5’-GTTGGGGACACACAAGCATC-3’；

（2）PCR反应：

反应体系总体积为10ul，包括10×PCR反应缓冲液1.0ul，25mMMgCl₂溶液0.5ul，dNTPMixture(2.5mM)1.0ul，TaqDNA聚合酶0.25ul（5U/ul），特异性引物对F和R（10uM）各0.25ul，灭菌蒸馏水6.0ul，DNA1.0ul。反应条件为95℃5分钟，此后进行35个循环的98℃10秒、55℃30秒、72℃30秒，最后一步为72℃5分钟。

步骤3：限制性内切酶酶切

使用本检测试剂盒，在步骤2所得产物加入试剂盒中所包含10×内切酶反应缓冲液2μl，NcoI内切酶0.5μl(10U/μl)，去离子水7.5μl，在37℃条件下水浴1小时。

步骤4：3％琼脂糖凝胶电泳检测步骤上述所得酶切产物，根据电泳条带大小判断是否存在TNF-α308G>A遗传变异。判断方法如下：

1.若rs1800629位点上两个等位基因均存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见仅171bp处存在条带。提示：三阴性乳腺癌患者具有肿瘤转移的高风险；

2.若rs1800629位点上仅一个等位基因存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见171bp、131bp处均存在条带(40bp处还有一条带，但量少基本不可见)。提示：三阴性乳腺癌患者具有肿瘤转移的较高风险；

3.若rs1800629位点上并未存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析仅在131bp处可见条带(40bp处还有一条带，但量少基本不可见)。提示：三阴性乳腺癌患者具有肿瘤转移的低风险。

携带A等位基因的三阴性乳腺癌患者发生肿瘤远处转移的风险高（OR=5.83,95%CI:1.64–20.76,P=0.004）。

不同类型的患者的电泳检测结果如图1所示rs1800629位点上两个等位基因均存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见仅171bp处存在条带（泳道6）。提示：三阴性乳腺癌患者具有肿瘤转移的高风险。rs1800629位点上仅一个等位基因存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析可见171bp、131bp处均存在条带（泳道3）。提示：三阴性乳腺癌患者具有肿瘤转移的较高风险。rs1800629位点上并未存在308G>A遗传变异，PCR产物进行电泳分析仅在131bp处可见条带（泳道1、2、4、5）。提示：三阴性乳腺癌患者具有肿瘤转移的低风险。

验证试验

采用实施例1的方法，我们对募集到的具有完整病历资料及分型明确的768例乳腺癌（TNBC163例）和565例无肿瘤病史的健康女性对照进行了基因型分析。乳腺癌患者和正常对照均为中国大陆汉族妇女。患者经组织病理学确诊，无年龄限制；正常对照无肿瘤病史，经体检无肿瘤体征，年龄（±5岁）与病例匹配。收集研究对象的年龄、身高、体重、疾病亚型、肿瘤临床特征等信息。研究对象的基本情况见表1。每个研究对象均知情同意参加本研究并捐献2ml外周静脉血，用于分离制备淋巴细胞基因组DNA。研究结果表明，在校正了BMI、肿瘤大小、淋巴结转移、初潮年龄、是否绝经、癌症家族史等因素后，TNF-α基因启动子区308G>A遗传变异（rs1800629）与TNBC患者肿瘤的远处转移相关（OR=5.83,95%CI:1.64–20.76,P=0.004）。

表1.研究对象的基本信息

表1.研究对象的基本信息

<110>山东省肿瘤医院

<120>三阴性乳腺癌转移相关易感基因TNF-α突变的检测试剂盒及检测方法

<160>2

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(39)

<223>引物

<400>1

CCCCAAAAGAAATGGAGGCAATAGGTTTTG30

AGGGCCATG39

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>2

GTTGGGGACACACAAGCATC20