一株协同表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶与苹果酸酶的重组高山被孢霉菌株及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及一株在高山被孢霉中协同表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD2和苹果酸酶ME2的重组菌，还涉及所述菌株的构建方法及应用。本发明采用高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型为材料，构建了一株高产花生四烯酸的高山被孢霉基因重组菌株。本发明验证了G6PD2和ME2在脂肪酸合成与脱饱和过程中发挥的重要作用，通过协同过量表达这两个基因，本发明有效实现同时达到提高脂肪酸产量与脱饱和度的效果，显著提高了ARA在总脂肪酸中的比例，并有效缩短发酵时间，对产油真菌高山被孢霉ATCC？32222的脂质合成基础理论研究及产品开发具有重要的意义。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种协同表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶与苹果酸的高山被孢霉重组菌株 及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。

【背景技术】

高山被孢霉是一种多不饱和脂肪酸(PUFAs)工业生产真菌。其生产的花生四烯 酸(ARA)已经被应用于婴儿配方奶粉，在人体的生长与代谢中发挥着重要的作用， 包括：花生四烯酸(ARA)是许多激素类生物活性物质的重要前体，对脂蛋白的代谢、 维持血管弹性、白细胞功能的发挥和血小板的激活等具有重要的调节作用；ARA是 人体大脑和视神经发育的重要物质，对提高智力和增强视敏度具有重要作用；此外， ARA还具有降低胆固醇、调节血细胞功能、预防心血管疾病、糖尿病和肿瘤等重要 功能。近年来，由于DNA测序技术与分子生物学技术的快速发展，使得高山被孢霉 脂质合成代谢通路与遗传操作系统已经被成功的解析与建立起来。但是，由于对高山 被孢霉的脂质积累的分子机制仍然缺乏足够的了解，很难从根本上提高其ARA产量。

以往对与高山被孢霉脂质合成机理的研究与遗传改造多集中于脂质合成代谢通 路本身。但是由于脂肪酸的合成与脱饱和过程需要众多酶参与催化完成，很难通过单 基因的遗传操作达到理想的提高脂肪酸产量和脱饱和度的效果。NADPH的供给是脂 肪酸合成的重要前提和限速步骤。Colin等人曾经提出，苹果酸酶(ME)产生的NADPH 是产油丝状真菌脂肪酸合成途径中的唯一限制因素。但是，在高山被孢霉中，通过过 量表达ME1使其活性提高了2倍之后，脂肪酸的积累却仅提高了30％。结合最近的 多项研究最终发现，产油微生物脂肪酸合成所需的NADPH由多种酶分别催化产生。 其中，6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)被认为是脂肪酸合成最重要的NADPH来源。 G6PD是磷酸戊糖途径的重要限速酶，其产生的NADPH在细胞的脂质合成与氧化应 激过程中发挥着十分重要的作用。高山被孢霉的基因组中含有三个可以编码G6PD的 同源基因：G6PD1，G6PD2和G6PD3。在对高山被孢霉脂质合成过程中一系列样品 的转录组学的研究中发现，G6PD2的转录水平在进入脂质积累时期以后显著提高了约 400倍。这种现象说明，G6PD2的表达与高山被孢霉的脂肪酸积累具有十分密切的联 系。此外，NADPH也为脂肪酸的脱饱提供能量。在以往对产油真菌卷枝毛霉的研究 中发现，一种与细胞膜结合的ME活性与其脂肪酸的脱饱和有着密切的关系。同样的， 在高山被孢霉中也发现，过量表达ME2可以使其脂肪酸脱饱和度提高约60％。综上 所述，在高山被孢霉中，G6PD2和ME2分别在脂肪酸合成与脱饱和过程中发挥着重 要的作用，通过协同过量表达这两个基因，可以同时达到提高脂肪酸产量与脱饱和度 的效果。

本发明以申请号为201310347934.8的中国发明专利申请中公开的高山被孢霉尿 嘧啶营养缺陷型菌株作为转化菌株，在其基础上通过进一步的基因重组方法构建了一 种新的能够同时高表达G6PD2和ME2重组菌株。申请号为201310347934.8的中国发 明专利申请所公开的全部内容均引入本申请作为现有技术参考。

CN201310347934.8公开的技术方案包括一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌 株，该菌株是通过失活MortierellaalpinaATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖 转移酶OPRTase的ura5基因构建而成的。

所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，ura5基因的失活是通过缺失654bp的 ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而实现的。

中国专利申请201310347934.8还公开一种制备上述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷 型菌株的方法，通过同源重组使高山被孢霉ura5基因中的213bp-230bp共18bp序 列缺失从而使ura5基因失活，所使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的 1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具体步骤为：首先获得ura5敲除基 因片段，并进一步构建敲除质粒pBIG4KOura5，然后用重组质粒pBIG4KOura5转化 根癌农杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG4KOura5的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉 并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。

所述方法使用的根癌农杆菌为：AgrobacteriumtumefaciensC58C1。

基因敲除使用的根癌农杆菌起始载体为：pBIG2RHPH2。

基因敲除载体构建的具体步骤如下：

1)用PCR的方法获得质粒pBluescriptIISK⁺的MCS基因片段；

2)用限制性内切酶EcoRI和XbaI对MCS基因片段和质粒pBIG2RHPH2进行 酶切，并通过连接反应将MCS基因片段插入质粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI 位点之间得到质粒pBIG4；

3)用融合PCR的方法获得并连接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段；

4)用限制性内切酶EcoRI和KpnI对敲除基因片段和质粒pBIG4进行酶切， 并通过连接反应将敲除基因片段插入质粒pBIG4获得pBIG4KOura5。

优选地，步骤3)中的敲除基因片段是通过下述步骤获得的，

首先根据NCBI数据库设计如下引物

P1：GACCGGAATTCCGACGCTGACATTACACATTTATCC

P2：TGACGGTGGTGCAGGCCAGAGGGCCAAAGATGATGTCGTGCTCAATG

P3：TTGAGCACGACATCATCTTTGGCCCTCTGGCCTGCACCACCGTCATT

P4：TGCGGGGTACCCATGCGAATCACAGATATGG

然后以高山被孢霉ATCC32222基因组为模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分 别扩增上下游片段，再以上下游片段为模板，在反应体系中加入P1、P4进行融合PCR 反应，获得KOura5敲除基因片段。

优选地，根据质粒pBluescriptIISK⁺的序列信息设计如下引物：

MCS上游：TTTCGCTAGCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT

MCS下游：AACAACAATTGGGGCTCCACCGCGGTGGCGGCCG

然后用PCR的方法获得步骤1)中的质粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。

优选地所述的根癌农杆菌介导的基因敲除方法是采用根癌农杆菌转化高山被孢 霉，具体为：取100μL根癌农杆菌与100μL高山被孢霉孢子混合，均匀涂布于铺有 玻璃纸IM固体培养基上，进行转化培养，然后筛选获得高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷 型菌株。

优选地，根癌农杆菌转化高山被孢霉的具体步骤如下：

(1)取保存于-80℃的含有质粒pBIG4KOura5的根癌农杆菌C58C1于含有100 μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线；30℃倒置避光培 养48小时；

⑵挑取单克隆接种至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液体 YEP培养基中30℃，200rpm避光培养24-48小时；

⑶4000×g离心5min收集菌体，倒掉上清，加5mLIM培养基重悬菌体，4000× g离心5min，倒掉上清，加2mLIM培养基重悬菌体；

⑷用IM培养基调整菌浓度至OD600＝0.9，30℃，200rpm避光培养至OD600＝1.5；

⑸收集高山被孢霉孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到10⁷个每100μL；

⑹取100μL根癌农杆菌与100μL孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸IM固体培 养基上，23℃避光培养48-96h；

⑺将玻璃纸转移到含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟，0.05g/L尿 嘧啶的GY平板上，25-30℃培养至产生大量孢子。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是提供一种同时高表达G6PD2和ME2的高山被孢霉重 组菌株。所述高山被孢霉的重组基因表达是通过对质粒pBIG2-ura5s-ITs进行改造并 通过根癌农杆菌转化(ATMT)的方法转化MortierellaalpinaCCFM501尿嘧啶营养 缺陷型菌株来实现的。

所述重组基因表达系统的选择标记ura5基因，G6PD2基因g6pd2和ME2基因 malE2的DNA序列来源于MortierellaalpinaATCC32222基因组 (DDBJ/EMBL/GenBankaccessionADAG00000000,firstversionADAG01000000)中。

本发明提供一种协同过量表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶和苹果酸酶同源重组高山被 孢霉菌株，所述该菌株是用含6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因g6pd2和苹果酸酶基因malE2 重组质粒的根癌农杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。

在本发明中，所述含6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因g6pd2和苹果酸酶基因malE2重组 质粒是质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2。

所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是ura5基因中的213bp-230bp之间共18bp 的序列缺失的高山被孢霉ATCC32222菌株。

本发明还提供构建上述同源重组高山被孢霉菌株的方法，包括以下步骤：

(1)提取高山被孢霉ATCC32222菌株的RNA，通过反转录获取cDNA，利用 PCR扩增分别获取g6pd2和malE2基因；

(2)构建重组质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2；

(3)用构建获得的重组质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2转化根癌农杆菌；

(4)用经过转化的含质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2的根癌农杆菌转化高山被孢 霉尿嘧啶营养缺陷型菌株；

(5)鉴定转化菌株，获得同时过量表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶和苹果酸酶基因的 同源重组高山被孢霉菌株。

其中，步骤(1)中PCR扩增g6pd2基因的引物序列如下：

G6PD2F：GCACGGGGTACCATGTCTGAGAAGAAGAAGCATCTTT

G6PD2R：GCTCCCCCCGGGTTAATGGTCAGTCCTTGTGTCCT

步骤(2)中构建pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2时，先用质粒pBIG2-ura5s-Its和6- 磷酸葡萄糖脱氢酶基因g6pd2构建重组质粒pBIG2-ura5s-g6pd2；再利用转化质粒 pBIG2-ura5s-g6pd2和苹果酸酶2基因malE2表达元件进一步构建重组质粒 pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2。

步骤(2)包括如下步骤：用PCR的方法从高山被孢霉cDNA中获得g6pd2基因， 将g6pd2基因用限制性内切酶KpnI和XmaI酶切，插入到KpnI和XmaI酶切过的 pBIG2-ura5s-ITs的多克隆位点MCS中，得到质粒pBIG2-ura5s-g6pd2；利用PCR从 质粒pBIG2-ura5s-malE2获得ME2表达单元，并利用限制性内切酶XbaI酶切质粒 pBIG2-ura5s-g6pd2，将酶切过的质粒基与ME2表达单元使用In-FusionHDCloningKit 进行连接，得到重组质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2。

步骤(1)中PCR扩增malE2基因的引物序列以及步骤(2)中获得ME2表达单 元可以参考现有技术如中国专利申请CN201310524221.4中公开的内容。

步骤(3)中所使用的根癌农杆菌为根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensC58C1。

步骤(4)中所使用的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是ura5基因中的213 bp-230bp之间共18bp的序列缺失的高山被孢霉MortierellaalpinaATCC32222菌株。

本发明还涉及上述重组高山被孢霉菌株在制备脂肪酸中的用途。

其中所使用的质粒pBIG2-ura5s-ITs与质粒pBIG2-ura5s-malE2(GuangfeiHao, HaiqinChen,DuKai,XiaoyunHuang,YuandaSong,ZhennanGu,LeiWang,HaoZhang, WeiChen,YongQ.Chen.IncreasedFattyAcidUnsaturationandProductionof ArachidonicAcidbyHomologousOverexpressionoftheMitochondrialMalicEnzymein Mortierellaalpina.Biotechnologyletters,2014,36(9):1827-1834.)为本领域技术人员根 据现有技术可以直接获得的产品，或参考中国专利申请CN201310524221.4中公开的 内容直接获得。

本发明的高山被孢霉(Mortierellaalpina)MA-g6pd2-malE2-3于2015年10月 12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11395。

【附图说明】

图1为构建质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2的示意图。

图2为过表达菌株中g6pd2基因和malE2基因的转录水平。

图3为过表达菌株中G6PD和ME的酶活水平。

图4为过表达菌株中NADPH水平。

图5为过表达菌株的总脂肪酸含量和ARA含量。

图6为发酵罐培养MA-g6pd2-malE2-3菌株的培养基葡萄糖残量、细胞干重、脂 肪酸产量与ARA产量的变化。

【具体实施方式】

以下通过实施例来进一步阐述本发明，下例实施例中未注明具体条件的实验方 法，基本上都按照常见的分子克隆手册进行实验操作。

实施例1：高山被孢霉ATCC32222基因组生物信息学分析

根据已经公开的高山被孢霉ATCC32222基因组信息(DDBJ/EMBL/GenBank accessionADAG00000000,firstversionADAG01000000)预测的蛋白质编码序列经 BLAST对蛋白数据库NR(www.ncbi.nlm.nih.gov)，KOGs和COGs，KEGG， UniRef100和Swiss-Prot，BRENDA搜索比对。使用InterProScan软件对蛋白质结构 数据库进行比对。预测得到编码G6PD2的g6pd2基因coding序列全长1545bp，如 SEQNo.1所示。

实施例2：高山被孢霉总RNA提取

⑴取出适量在液氮中冻存的高山被孢霉ATCC32222菌体于无菌无酶研钵中充分 研磨。

⑵加入TRIzol(购自美国美国加利福尼亚州Invitrogen公司)试剂1mL，继续研 磨后室温放置至溶解。

⑶吸取1mL步骤⑵的液体于无酶离心管中，加入200μL三氯甲烷混均。

⑷吸上清于新的无酶离心管中，在12000×g、4℃下离心15min。

⑸加入等体积异丙醇，静置15min，然后再在12000rpm、4℃下离心15min。

⑹用无酶枪头将混合物中的异丙醇尽量吸出。

⑺所得沉淀用70％(体积比)乙醇洗一次，然后在12000×g、4℃下离心15min。

⑻用无酶水溶解总RNA，-80℃储存。

⑼浓度测定：取2μL总RNA于离心管中，以Nanodrop2000测定浓度。

⑽跑胶：取1μg总RNA，通过1.2％(质量体积比)琼脂糖电泳检测总RNA完 整性。

实施例3：获得g6pd2基因以及ME2表达单元DNA片段

⑴取1μg总RNA为模板，按照PrimeScriptRTreagentkit(购自日本滋賀县TaKaRa 公司)试剂盒说明进行操作，获得高山被孢霉cDNA。

⑵根据基因组生物信息学分析结果，针对预测的g6pd2基因以及In-FusionHD CloningKit(购自美国加利福尼亚州ClontechLaboratories)说明书，设计引物如下(酶 切位点用下划线表示)：

G6PD2F：GCACGGGGTACCATGTCTGAGAAGAAGAAGCATCTTT

G6PD2R：GCTCCCCCCGGGTTAATGGTCAGTCCTTGTGTCCT

InFusF：

CTCTCCTATGAGTCGTTTACCCAGAATGCACAGGTACACTTGTTTAGAGGTC TAGATTTAGTTGATGTGAGAGTTGTGAGATTCGTG

InFusR：

AAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCT CTAGACCTCTAAACAAGTGTACCTGTGCATTCTGGG

⑶以cDNA和质粒pBIG2-ura5s-malE2(参考公开的中国发明专利申请CN 201310524221.4)为模板，用以上两对引物进行PCR反应，得到g6pd2基因和malE2 表达单元。

⑷将得到的PCR产物连接到pEGM-Teasy(购自美国威斯康辛州Promega公司) 载体上，经3730DNA测序仪鉴定后，转化大肠杆菌TOP10，-80℃保存。

实施例4：协同表达质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2的构建

用限制性内切酶KpnI和XmaI将g6pd2基因酶切，插入到KpnI和XmaI酶切过 的pBIG2-ura5s-Its(参考公开的中国发明专利申请CN201310524221.4)的多克隆位 点(MCS)中，得到质粒pBIG2-ura5s-g6pd2。利用限制性内切酶XbaI酶切质粒 pBIG2-ura5s-g6pd2，使用In-FusionHDCloningKit(购自美国加利福尼亚州Clontech Laboratories)按照说明书将酶切过的质粒基与ME2表达单元进行连接，得到质粒 pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2。

连接产物pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2转化大肠杆菌TOP10感受态。转化方法如下：

⑴无菌状态下取100μL大肠杆菌TOP10感受态细胞，加入2μL连接产物，混匀。

⑵将步骤⑴得到的感受态细胞移入电转杯中，避免气泡。

⑶将电转杯放入Bio-Rad电转仪，电转条件设定1.8kV，5ms，开始电转。

⑷电转后的感受态细胞移至含有900μLSOC复苏培养基的离心管中，在37℃下， 100rpm培养1h。

⑸取200μL培养物涂布在100μg/mL的卡那霉素抗性YEP固体培养基平板上， 倒置37℃培养过夜。

挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果确认连接成功。获得质粒 pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2。

其中，SOC复苏培养基含有20g/L胰蛋白胨(Tryptone)、5g/L酵母粉、0.5g/L NaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl₂、20mM葡萄糖，余量为水；YEP固体培养基含 有10g/L胰蛋白胨(Tryptone)、10g/L酵母粉、5g/LNaCl、20g/L琼脂，余量为水。

实施例5：质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2转化根癌农杆菌

⑴无菌状态下取100μL根癌农杆菌C58C1感受态细胞，加入0.5μL质粒 pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2，混匀。

⑵将步骤⑴得到的感受态细胞移入电转杯中，避免产生气泡。

⑶将电转杯放入Bio-Rad电转仪，电转条件设定2.5kV，5ms，开始电转。

⑷电转后的感受态细胞移至含有900μLSOC复苏培养基的离心管中，在30℃下， 100rpm培养2h。

⑸取200μL培养物涂布在100μg/mL的卡那霉素与100μg/mL的利福平抗性YEP 固体培养基平板上，倒置30℃培养48h。

挑取阳性转化子，菌落PCR验证，结果确认质粒转化成功。

实施例6：根癌农杆菌介导转化高山被孢霉

在已有的国内外文献有关根癌农杆菌转化方法报道的基础上，做了适当的优化调 整，具体成功实施例如下：

⑴取保存于-80℃的含有质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2的根癌农杆菌C58C1于含 有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线，30℃倒置 避光培养48h。

⑵挑取单克隆接种至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液体 YEP培养基中30℃，200rpm避光培养24-48h。

⑶4000×g离心5min收集菌体，倒掉上清。加5mLIM培养基重悬菌体，4000 ×g离心5min后倒掉上清。再加2mLIM培养基重悬菌体。

⑷用IM培养基调整菌浓度至OD600＝1.0。在30℃、200rpm下避光培养至 OD600＝1.5。

⑸收集高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株(根据CN201310347934.8说明书中公 开的尿嘧啶营养缺陷型菌株获得)孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到10⁷个 /100μL。

⑹取100μL步骤⑷的根癌农杆菌与100μL步骤⑸得到的孢子混合，均匀涂布于 铺有玻璃纸IM固体培养基上，23℃避光培养48-96小时。

⑺将玻璃纸转移到含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的GY平板上。 25-30℃培养至有明显生长的菌落产生。

⑻及时挑取明显生长的菌落，转移至含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢 噻肟的SC平板上，待鉴定。

其中，MM培养基成分是以组分1.74g/LK₂HPO₄，1.37g/LKH₂PO₄，0.146g/L NaCl，0.49g/LMgSO₄·7H₂，0.078g/LCaCl₂，0.0025g/LFeSO₄·7H₂O，0.53g/L (NH₄)₂SO₄，7.8g/LMES，1.8g/L葡萄糖，0.5％甘油构成的。

IM培养基是在MM培养基的基础上添加200μM乙酰丁香酮(AS)构成的。

SC培养基含有5g/L酵母氮源(不含氨基酸和硫酸铵)、1.7g/L(NH₄)₂SO₄、20g/L 葡萄糖、20mg/L腺嘌呤、30mg/LTyrosine络氨酸、1mg/LMethionine甲硫氨酸、2mg/L Histidine组氨酸、4mg/LLysine赖氨酸、4mg/LTryptophan色氨酸、5mg/LThreonine 苏氨酸、6mg/LIsoleucine异亮氨酸、6mg/LLeucine亮氨酸、6mg/LPhenylalanine苯 丙氨酸和2mg/LArginine精氨酸，余量为水。

液体YEP培养基含有10g/LTryptone,10g/L酵母粉，5g/LNaCl，余量为水。

GY培养基含有20g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，1g/LK₂HPO₄，0.25g/L MgSO₄·7H₂O，10g/LKNO₃，余量为水，固体培养基添加1.5％琼脂粉。

实施例7：重组高山被孢霉的鉴定

⑴将挑取在SC平板上的高山被孢霉菌落于25-30℃培养3-5天，至明显生长。

⑵挑取菌落边缘的新生菌丝，接种于新鲜的含有100μg/mL壮观霉素和100 μg/mL头孢噻肟的SC平板上直至产孢子。

⑶用3mL生理盐水冲刷共培养的平皿表面，收集液体于一个无菌1.5mL离心管 中。过25μm滤膜。

⑷取200μL涂布于新鲜的含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的SC 平板上直至产孢子。共传代3次。

⑸将步骤⑷中明显生长的菌落分别接种到含有1mg/mL5-FOA和不含有1 mg/mL5-FOA的GY固体平板上，25℃培养2-4天。

⑹观察高山被孢霉在两种平板上的生长情况。挑出在不含有1mg/mL5-FOA平板 上生长的菌落，接种于GY斜面上。

⑺提取具有尿嘧啶营养缺陷型表型高山被孢霉基因组。设计两对与启动子和终止 子特异性结合的引物进行PCR验证：

HisproF1：CACACACAAACCTCTCTCCCACT

TrpCR1：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC

HisproF2：GTGTTCACTCGCATCCCGC

TrpCR2：AGGCACTCTTTGCTGCTTGG

进行PCR反应，鉴定为重组高山被孢霉菌株。

⑻重组菌株保存于GY斜面上。

实施例8：阳性转化子的g6pd2基因和malE2基因转录水平RT-qPCR检测

根据预测的g6pd2基因、malE2基因序列和内参18SrDNA序列设计引物：

malE1RTF：GGCTGTTGCCGAAGGGACT

malE1RTR：GGCAAAGGTGGTGCTGATTTC

G6PD2RTF：CCTTGCAGGACCGTAACGAGA

G6PD2RTR：TGAAAGCCGTCGTCTGTG

18SRTF：CGTACTACCGATTGAATGGCTTAG

18SRTR：CCTACGGAAACCTTGTTACGACT

通过与实施例2和实施例3相同的操作，获得实施例6的重组高山被孢霉菌株的 cDNA。

使用ABI-Prism7900sequencedetectionsystem(购自美国加利福尼亚州Applied Biosystems公司)，按照SYBRGreenPCRMasterMix购自美国加利福尼亚州Applied Biosystems公司)的说明进行RT-qPCR反应。

反应体系为：10μlSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、8μL无 酶水、1μL模板。PCR循环设置为50℃2min、95℃10min、40个循环。18SrRNA 作为内参基因。所有样品重复检测三次。

结果如图2所示。

M.alpina为野生型对照；MA-g6pd2-malE2-1、MA-g6pd2-malE2-2和 MA-g6pd2-malE2-3为含有重组质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2的三株重组菌株，所示 重组菌株中g6pd2与malE2的表达量均显著升高，证明g6pd2与malE2基因在三株重 组菌株中均成功过量表达。

实施例9：重组菌株细胞内G6PD活性测定

⑴液氮研磨菌体提取细胞总蛋白。

⑵配制活性测定体系：50mMTris/HClpH8.0、5mMMgCl₂、0.3mMNADP⁺、 粗蛋白约0.1mg/mL。

⑶30℃保温2min，待数值基本稳定后，加入6-磷酸葡萄糖至终浓度为2.5mM。

⑷所得反应体系于波长340nm处测定3min，采用光度法根据单位时间内吸光值 的变化计算酶活。酶活以每mg蛋白每分钟产物的增加量或底物的减少量表示。

测定结果如图3所示。

M.alpina为野生型对照；MA-g6pd2-malE2-1、MA-g6pd2-malE2-2和 MA-g6pd2-malE2-3为含有重组质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2的三株重组菌株，结果 显示三株重组菌株中G6PD的酶活均显著升高。

实施例10：重组菌株细胞内ME活性测定

⑴液氮研磨菌体提取细胞总蛋白。

⑵配制活性测定体系：80mMKH₂PO₄/KOHpH7.5、0.6mMNADP⁺、3mM MgCl₂、粗蛋白液(蛋白约30mg)。

⑶30℃保温2min，待数值基本稳定后，加入苹果酸(pH6.8)，其浓度为25mM。

⑷所得反应体系于波长340nm处测定3min，根据单位时间内吸光值的变化计算 酶活。

测定结果如图3所示。

M.alpina为野生型对照；MA-g6pd2-malE2-1、MA-g6pd2-malE2-2和 MA-g6pd2-malE2-3为含有重组质粒pBIG2-ura5s-g6pd2-malE2的重组高山被孢霉，所 示重组菌中ME的酶活均显著升高。

实施例11：高山被孢霉脂质提取

⑴将高山被孢霉原养型菌株与实施例6得到的重组菌株于发酵培养基中，28℃、 200rpm下于摇瓶中培养168小时。

⑵收集菌体并冷冻干燥。

⑶取100mg干重菌丝，加入2mL4mol/L盐酸。

⑷80℃水浴0.5小时，然后置于-80℃下15min。再重复一次。然后再置于80℃ 水浴0.5小时。

⑸冷却至室温，加入1mL甲醇，混匀。

⑹加入1mL氯仿，震荡10min。6000×g离心3min。收集氯仿。

⑺重复步骤⑹两次。

⑻合并氯仿，加入1mL饱和氯化钠水溶液，混匀后于3000×g离心3min。收 集氯仿层于新瓶。剩余液体加入1mL氯仿，3000×g离心3min。合并氯仿共计4mL。

⑼氮吹干燥步骤⑻所得氯仿，然后加入1mL乙醚并转移至洁净的已经称重的瓶 中。氮吹干燥得到脂肪酸甲酯，称重得到总脂肪重量。向所得的脂肪酸甲酯中加入1 mL正己烷，震荡混匀再转移至气相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液。

实施例12：高山被孢霉脂肪酸GC/MS检测

使用GC-MS(GC-2010Plus，MS-QP2010Ultra设备，购自日本京都ShimadzuCo.) 分析实施例11得到的脂肪组构成。

色谱柱为30m×0.25mmRtx-Waxcolumn。氦气为载气，温度程序为：40℃保持5 min，以20℃每min升高至120℃，以5℃每min升高至190℃，保持5min，再以5℃ 每min升高至220℃，保持17min。

分析结果见图5A、B，其中黑色代表野生型高山被孢霉菌株M.alpina，灰色条 纹代表g6pd2基因和malE2基因协同表达菌株MA-g6pd2-malE2-1、MA-g6pd2-malE2-2 和MA-g6pd2-malE2-3。

由图5A所示结果可以看出，三株重组菌株MA-g6pd2-malE2-1、 MA-g6pd2-malE2-2和MA-g6pd2-malE2-3中总脂肪酸含量相对于对照菌株均有明显 提高，其中MA-g6pd2-malE2-3提高最为显著，达到44％；同时如图5B所示，细胞 内ARA的含量也有显著增加。

实施例13：高山被孢霉的发酵罐培养

根据实施例12及图5的结果，选择脂肪酸产量最高的菌株MA-g6pd2-malE2-3 进行发酵罐培养。

高山被孢霉孢子接种到装有50mLKendrick培养基的250mL三角瓶中，28℃、 200rpm下培养120h后收集菌丝，用分散器打碎10s。取0.3g碎菌丝接种于装有50 mLGY(或用Kendrick培养基替代)的250mL三角瓶中，在28℃、200rpm条件下 培养36h，收集菌丝，用分散器打碎10s，取0.3g碎菌丝接种于装有50mLKendrick 培养基的250mL三角瓶中，再于28℃、200rpm下培养36h后，此时所有菌丝处于 同步生长状态。将种子以10％体积比接种于含有3.6LBroth培养基的7.5L发酵罐中， 以28℃、通无菌空气量0.5vvm、搅拌500rpm条件培养168h。其中，每隔24h收 集样品，编号并进行检测。

Kendrick培养基含有50g/L葡萄糖，2g/LL-酒石酸铵，7g/LKH₂PO₄，2g/L Na₂HPO4，1.5g/LMgSO₄·7H₂O，1.5g/L酵母粉，0.1g/LCaC1₂·2H₂O，8mg/L FeCl₃·6H₂O，1mg/LZnSO₄·7H₂O，0.1mg/LCuSO₄·5H₂O，0.1mg/LCo(NO₃)2·6H₂O， 0.1mg/LMnSO₄·5H₂O，余量为水。

发酵罐中Broth培养基含有50g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，1.0g/LKH₂PO₄，0.25 g/LMgSO₄·7H₂O，10g/LKNO₃，余量为水。

如图6和表1所示，与原养型高山被孢霉相比，MA-g6pd2-malE2-3菌株展现了 更快的葡萄糖消耗速录与脂肪酸积累速率。其中，原养型菌株的细胞干重(DCW) 在168h时为21.9±0.8g/L，对应总脂肪酸产量(TFA)为10.1±0.6g/L，即原养型菌 株的脂肪酸含量在168h仅达到细胞干重的46.1％。相比之下，由于g6pd2基因的过 量表达使得MA-g6pd2-malE2-3菌株具有了更快的葡萄糖消耗速录与脂肪酸积累速 率，其细胞干重在120h为21.1±0.9g/L，对应总脂肪酸产量为11.7±0.5g/L，即在120 h内总脂肪酸含量达到了细胞干重的55.5％，在大幅缩短发酵时长48h的前提下实现 总脂肪酸产量的显著增长。

总脂肪酸(TFA)产量方面，原养型菌株120h的产量为6.5±0.3g/L，重组菌株 的对应产量为11.7±0.5g/L，实现脂肪酸的产能由1.4±0.1g/(L·d)升高到了2.3±0.1 g/(L·d)，增幅64.3％。

同时，由于malE2基因的过量表达使得ARA(C20:4)占总脂肪酸的含量相对于 野生型菌株也有显著升高，在168h时，原养型菌株的ARA产量为4.4±0.3g/L，占 总脂肪酸产量的43.6％，而重组菌的对应ARA产量为6.8±0.2g/L，占总脂肪酸的 57.1％，占细胞干重的31.6％。

综合同时表达g6pd2基因和malE2基因的效果，对比120h的产脂肪酸能力，其 中重组高山被孢霉在120h内ARA总产量为6.3±0.3g/L，ARA产能达到了1.3±0.1 g/(L·d)，而原养型菌株的对应总产量为2.5±0.2g/L，折合0.5±0.0g/(L·d)，即120h 内重组菌的ARA产能较原养型菌株提高2.6倍。

表1发酵罐培养高山被孢霉菌株的脂肪酸组成

可见，G6PD2和ME2分别在脂肪酸合成与脱饱和过程中发挥着重要的作用，通 过协同过量表达这两个基因，本发明有效实现同时达到提高脂肪酸产量与脱饱和度的 效果，显著提高了ARA在总脂肪酸中的比例，并有效缩短发酵时间。

虽然本发明专利已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉 此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰。因此本发明 的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。