透明颤菌血红蛋白突变体及其在基因工程菌中的可控表达

摘要

本发明公开了一株可控表达密码子优化后的透明颤菌血红蛋白突变基因的重组枯草芽孢杆菌及其应用，所述菌株为重组枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis/PBE-Pxyl-vgb)，保藏编号为CGMCC？No.10787。利用密码子优化后的透明颤菌血红蛋白突变基因vgh，构建枯草芽孢杆菌表达载体PBE-Pxyl-vgb；将该表达载体PBE-Pxyl-vgb电转入枯草芽孢杆菌中，获得了重组枯草芽孢杆菌(PBE-Pxyl-vgb)。利用此菌株生产中温α-淀粉酶时，按照实际发酵过程的需要加入或者不加木糖，来启动或者关闭透明颤菌血红蛋白的表达，实现透明颤菌血红蛋白基因的可控表达，避免了一直表达此蛋白对发酵液中营养物质及氧气的过多消耗，因而提高了重组枯草芽孢杆菌对氧的利用效率。结果显示，重组枯草芽孢杆菌的中温α-淀粉酶的发酵水平比原始菌株提高了303％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可控表达的颤菌血红蛋白突变体及其重组枯草芽孢杆菌和应用，利用密 码子优化后的透明颤菌血红蛋白突变基因，在枯草芽孢杆菌中用木糖诱导表达，因而提高了 重组枯草芽孢杆菌菌体对氧气的摄取能力，以提高中温α-淀粉酶的产量，属于基因工程技术 领域。

背景技术

中温α-淀粉酶是由枯草芽孢杆菌经液体深层发酵及后提取技术精制而成的淀粉酶制剂。 此酶以钙离子为必需因子并作为稳定因子和激活因子，也有部分淀粉酶为非钙离子依赖型。 此酶既作用于直链淀粉，亦可作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部α-1,4糖苷键，能 够将淀粉水解成长短不一的糊精及少量的低分子糖类从而使淀粉糊的粘度迅速下降。广泛应 用于淀粉糖、酒精、味精、啤酒、以及饲料、纺织印染退浆等行业。

目前，中温α-淀粉酶主要生产菌株为枯草芽孢杆菌，其通过微生物发酵法生产，而微生 物的发酵过程中，氧气对好氧微生物的生长繁殖和进行能量物质代谢尤为重要，但微生物只 能利用溶解在培养基中的氧，从而使氧气供应成为限制发酵产量的一大瓶颈。

透明颤菌(Vitreoscilla)是一种专性好氧的丝状革兰氏阴性细菌，可在池沼或腐烂的蔬菜 中分离得到。此菌可在限氧条件下大量诱导合成透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin， VHb)，该蛋白是一种氧调节蛋白，能特异性的结合氧气，并且高速释放，从而促进微生物细 胞内氧的传递，提高氧的利用率，这种特性使透明颤菌在有限空间中能迅速的捕捉氧气维持 其正常的生理代谢。VHb的天然启动子包括P1和P2两个部分，该启动子受溶氧浓度的诱导， 当溶氧降至5％大气饱和度以下时可强力启动下游基因表达(Khoslac，etal.JBacteriol， 1989,171(11)：5995-6004)。鉴于革兰氏阳性菌的核糖体缺少S1蛋白，绝大多数革兰氏阴性 菌的基因不能在革兰氏阳性菌中直接表达。因此，有必要对VHb进行适当的改造，使之能够 适应不同的宿主或具有更好的特性。近年来，对VHb的基因改造已经展开，主要包括根据宿 主密码子偏向性进行合成(吴巧雯，等.中国农业科学，2004，37(10)：1439-1443)、定点 突变(KinY，etal.JIndMicrobiolBiotechnol，2005，32(4)：148-54)、易错PCR(Andersson CI，etal.BiotechnolBioeng,2000，70(4):446-55)等方法。另外，在异源表达的过程中所 使用的启动子都是一些起始后不能再停止的的启动子，如β-内酰胺酶基因启动子(章银梅， 等.遗传学报，2000，27(2)：183-188)、P43启动子(廖瑜玲，等.生物技术通报，2010，9： 176-180)、SacB启动子(王凤寰，等.中国食品学报，2012，12(8)：11-16)等，同时部分 强启动子的过表达VHb基因会造成物极必反的效果，也会造成发酵培养基中有限物质的浪 费，增加成本。

Barbarra等用来自巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)木糖基因的表达元件构建了基于 木糖启动子Pxyl的整合表达载体pAX01，Pxyl由自己编码的xylR阻遏蛋白严格控制表达， 相对于其他的用IPTG诱导的启动子如Pspac启动子，其调控更严谨，诱导效率更高(Barbarra etal，1996)。

针对枯草芽孢杆菌中中温α-淀粉酶合成途径复杂、发酵过程中需要消耗大量的氧气、通 过氧化NAD(P)H或FADH形成NAD(P)或FAD产生能量ATP来维持细胞代谢，单纯 依靠动力供氧难以满足其对氧气的需求问题。本发明利用来源于透明颤菌、已经被广泛应用 证明能提高工业微生物发酵过程中氧气利用效率、降低能耗的血红蛋白基因vgh，根据枯草 芽孢杆菌的密码子偏好性对其进行密码子优化，并用木糖启动子进行可控表达，来解决中温 α-淀粉酶发酵过程中的供氧问题，以提高中温α-淀粉酶的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一段密码子优化后的透明颤菌血红蛋白突变基因序列，使其在重组 枯草芽孢杆菌中可控表达，以提高重组枯草芽孢杆菌产中温α-淀粉酶的水平。该重组菌能在 木糖诱导下，实现可控表达密码子优化后的透明颤菌血红蛋白突变基因，因而提高了重组枯 草芽孢杆菌菌体对氧的利用率，减少过多不必要的VHb表达造成物料损耗，提高中温α-淀粉 酶的产量。

本发明提供一种透明颤菌血红蛋白(VHb)突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所 示，该突变体编码基因(vgh)的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明的技术方案概述如下：

将来自于透明颤菌的血红蛋白基因vgh，按照枯草芽孢杆菌的密码子偏好性进行重新设 计及部分基因位点的定点突变后，获得透明颤菌血红蛋白突变基因(vgh)，在大肠杆菌-枯 草芽孢杆菌穿梭质粒PBE3的基础上，加入来源于质粒pAX01中的木糖启动子序列和转录终 止信号序列，再加入上述vgh基因序列后，构建重组表达质粒PBE-Pxyl-vgb，将此重组表达 质粒PBE-Pxyl-vgb电转入枯草芽孢杆菌中，获得了重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis /PBE-Pxyl-vgb)。

原始VHb氨基酸序列SEQIDNO：3中16个位置的氨基酸经突变后形成VHb突变体序 列SEQIDNO：4。采用“原始氨基酸(或碱基)位置替换的氨基酸(或碱基)”来表示VHb 突变体中突变的氨基酸(或碱基)，如Glu143Gln，表示位置143的氨基酸由原始VHb的 Glu替换成Gln，位置的编号对应于SEQIDNO：3中氨基酸序列编号(或原始vgh基因序列 SEQIDNO：1中碱基编号)，具体如下表所示：

所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，步骤概述如下：

(1)密码子优化后的vgh突变基因的获得：

根据GenBank中公布的透明颤菌血红蛋白基因vgh核苷酸序列，使用软件CodonW软件 包分析基因结构，选择某些位点进行定点突变及密码子优化后，再通过分析CAI、CBI、Nc 值来初步确定基因序列。通过RNAstructure分析mRNA自由能，结合枯草芽孢杆菌偏爱密码 子，最终选择自由能较低的修改方案，在序列两端加上BamH1和Sal1的酶切位点后，全合 成此基因序列并连接在pMD18-T克隆载体上构成重组质粒pMD18-T-vgh；

(2)构建枯草芽孢杆菌重组表达载体PBE-Pxyl-vgb：

先将来源于质粒pAX01的木糖启动子Pxyl序列以及转录终止信号序列通过重叠延伸 PCR获得融合序列，再把此融合序列连接到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体PBE3中，构建了 PBE-Pxyl表达载体。用BamH1和Sal1双酶切重组质粒pMD18-T-vgh，胶回收vgh片段，连 接到上述含有木糖醇启动子的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒PBE-Pxyl中，得到重组表达质粒 PBE-Pxyl-vgb；

(3)重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis/PBE-Pxyl-vgb)的获得：

提取质粒PBE-Pxyl-vgb，用电转化的方法转化枯草芽孢杆菌宿主菌株，涂布含15μg/mL 卡那霉素的固体种子平板，30h后长出转化子，即获得重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis /PBE-Pxyl-vgb)。

本发明还提供一种能够可控表达所述VHb突变体的重组枯草芽孢杆菌，该菌株于2015年5 月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.10787，分类 命名：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产中温α-淀粉酶的方法：

摇瓶种子培养基：葡萄糖1％(115℃单独灭菌20min)，酵母膏1％，玉米淀粉2％，氯 化钠1％，磷酸二氢钾3％，其余是水；pH6.8.0-7.1,121℃灭菌20min，装液量25/250ml三角 瓶；

上罐发酵培养基：玉米粉9％，豆饼粉3％，玉米浆1％，硫酸铵2％，磷酸二氢钾8％，硫酸 镁0.3％，氯化钙1％，其余是水；pH6.8.0-7.1,121℃灭菌20min，装液量2.8L/5L；

种子培养条件：于固体培养基平板中挑选枯草芽孢杆菌单菌落接种于种子培养基中， 180r/min，37℃培养25h；

5L发酵罐培养条件：装液量2.8L，接种量8％，37℃培养，转速550r/min，通气量3L/min， 用氨水连续流加控制pH为7.0-7.2，培养60h，发酵期间，在达到稳定期后，每当发酵液的溶 氧低于30％时，加入23g木糖，两次添加的时间间隔为4h。

所述的重组枯草芽孢杆菌，实现了经密码子优化后的血红蛋白突变基因vgh的可控表达。

所述的重组枯草芽孢杆菌，能可控表达经密码子优化后的透明颤菌血红蛋白突变基因， 因而提高了重组枯草芽孢杆菌菌体对氧的利用率，减少过多不必要的VHb表达造成物料损 耗，提高发酵生产中温α-淀粉酶的产量。

有益效果：

本发明将来源于透明颤菌的血红蛋白基因经密码子优化及定点突变后，成功构建了重组 表达质粒PBE-Pxyl-vgb，电转入枯草芽孢杆菌中，对重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis /PBE-Pxyl-vgb)的发酵优化及血红蛋白的可控表达进行了研究分析。

结果表明，发酵液中重组枯草芽孢杆菌的最高菌体浓度由原先的约5.2×10¹¹个/mL提高到 了5.7×10¹³个/mL，菌体浓度提高了约100倍数；发酵终止时，发酵液中中温α-淀粉酶的酶活， 由原先的910u/mL提高到了3670u/mL,酶活提高了300％以上。

附图说明

图1是透明颤菌血红蛋白基因vgh密码子优化的合成方案示意图；

图2是密码子优化后的血红蛋白基因重组表达载体PBE-Pxyl-vgb构建方法示意图；

图3是密码子优化后的血红蛋白基因重组表达载体PBE-Pxyl-vgb化转大肠杆菌DH5α后， 转化子的菌落PCR筛选鉴定图；

图4是密码子优化后的血红蛋白基因重组表达载体PBE-Pxyl-vgb电转枯草芽孢杆菌后， 转化子的菌落PCR筛选鉴定图；

图5是用木糖诱导时，Bacillussubtilis和Bacillussubtilis/PBE-Pxyl-vgbCO差光光谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本 领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围， 本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实 质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发 明的保护范围。

本发明所使用的大肠杆菌宿主菌DH5α购自宝生物公司；枯草芽孢杆菌载体pAX01购自 美国俄亥俄州立大学芽孢杆菌遗传保存中心(BGSC)；大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体PBE3 由天津科技大学提供。

实施例1

对透明颤菌血红蛋白基因序列进行密码子优化及定点突变后序列的获得。

根据GenBank中的透明颤菌血红蛋白基因序列(如SEQIDNO：1所示)和枯草芽孢杆 菌密码子偏爱性，使用软件CodonW软件包分析基因结构和定点突变试剂盒，选择某些位点 进行定点突变及密码子优化后，再通过分析CAI、CBI、Nc值来初步确定基因序列。通过 RNAstructure分析mRNA自由能，结合枯草芽孢杆菌偏爱密码子，最终选择自由能较低的修 改方案，在序列两端加上BamH1和Sal1的酶切位点后，设计出具有枯草芽孢杆菌偏爱密码 子的透明颤菌血红蛋白突变基因序列(如SEQIDNO：2所示)，然后将此基因序列送上海生 工合成，并由BamH1和Sal1的酶切位点连接在pMD18-T克隆载体上构成重组质粒 pMD18-T-vgh，密码子优化的前后对比见图1。

实施例2

含有密码子优化及定点突变后的透明颤菌血红蛋白基因表达载体PBE-Pxyl–vgh的构建 及重组菌株(Bacillussubtilis/PBE-Pxyl-vgb)的获得。

构建过程如图2所示，用引物Y1(含EcoR1酶切位点)和Y2，将质粒pAX01上的木糖 启动子Pxyl片段扩增出来，引物序列如下：

Y1：CCGGAATTCAACCATTTGCTGTTGCTTGA(SEQIDNO：5)，

Y2：CGCCAATGCTTGTCACGAATATAAGATA(SEQIDNO：6)；

PCR反应体系及程序如下：

用引物Y3和Y4(含HindIII酶切位点)，将质粒pAX01上的转录终止信号序列扩增出来， 引物序列如下：

Y3：CTTATATTCGTGACAAGCATTGGCGATCGGCTGTTTGG(SEQIDNO：7)，

Y4：CCCAAGCTTTCCCCTACTGCGTGTCGTA(SEQIDNO：8)；

PCR反应体系及程序如下：

然后用引物Y1和Y4，通过融合PCR的方法，将上述用Y1和Y2的PCR产物及Y3和 Y4的PCR产物连接在一起，PCR体系及程序如下：

将本PCR产物连接于pMD18-T载体上，构成重组质粒pMD18-T-Pxyl，并送上海生工测 序验证，连接体系如下：

pMD18-T2μL，

Y1+Y4的PCR产物3μL，

SolutionⅠ5μL；

将重组质粒pMD18-T-Pxyl和质粒PBE3都用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，双酶切体系如下：

酶切条件：温度30℃，时间8小时。

之后用上海赛百盛基因技术有限公司生产的胶回收试剂盒分别切胶回收线性化的Pxyl片 段和PBE3线性片段。再将上述两个线性片段用购自宝生物的T4DNA连接酶产品连接，构 建重组质粒PBE-Pxyl，连接体系如下：

连接条件：温度16℃，时间12小时。

将连接产物电转大肠杆菌感受态细胞DH5α，用SOC培养基复苏1小时后，涂布氨苄平 板筛选转化子，并送上海生工用通用引物测序验证是否正确，验证正确的转化子中含有重组 质粒PBE-Pxyl。

挑选验证正确的转化子，经活化培养后用试剂盒提取重组质粒PBE-Pxyl。将重组质粒 PBE-Pxyl和pMD18-T-vgh都用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，酶切体系如下：

酶切条件：温度30℃，时间8小时。

之后用胶回收试剂盒分别切胶回收线性vgh片段和PBE-Pxyl线性片段，再将上述两个线 性片段用T4DNA连接酶产品连接，构建重组质粒PBE-Pxyl-vgh，连接体系如下：

连接条件：温度16℃，时间12小时。

将连接产物电转大肠杆菌感受态细胞DH5α。用SOC培养基复苏1小时后，涂布氨苄平 板筛选转化子，并送上海生工用通用引物测序验证是否正确，验证正确的转化子中含有重组 质粒PBE-Pxyl-vgh，其中菌落PCR所用引物序列如下：

F1：5′-ATGTTAGACCAGCAGACCATTAAC-3′(SEQIDNO：9)，

F2：5′-TTACTCAACCGCTTGAGCG-3′(SEQIDNO：10)。

挑选部分转化子菌落及DH5α菌落(对照)，用去离子水制成菌悬液并以此为模板，进行 菌落PCR，PCR反应体系及程序如下所示：

菌落PCR验证如图3所示，电泳图中产物的位置与实际大小441bp相符，且对照未PCR出 条带与预期相符。

将验证正确的重组质粒PBE-Pxyl-vgh电转入枯草芽孢杆菌，并涂布终浓度为15ug/mL的 卡那平板，用菌落PCR的方法筛选转化子，并送上海生工测序做进一步的验证。其中电泳检 测结果如图4所示，电泳图中产物的位置与实际大小441bp相符，且对照未PCR出条带与预 期相符。电泳图中的产物的位置与实际大小441bp相符，且对照未PCR出条带与预期相符。

实施例3

一氧化碳差光光谱法检测血红蛋白表达。

将原始菌和重组芽孢杆菌过夜培养后，以体积百分比1％接种于60ml发酵培养基中，于 37℃振荡培养12h(其中在7h时加入3％的木糖诱导密码子优化后的透明颤菌的表达)，取 15mL菌液，8000r/min，10min离心收集菌体后，以50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液洗涤三次 后，重悬于10mL磷酸钾缓冲液中。菌悬液在冰浴条件下，以25s作用时间、50s间隔时间进 行超声波振荡以破碎细胞。破碎细胞的菌悬液每毫升加入20mg连二亚硫酸钠，然后分为等 体积2份，一份通入一氧化碳气体5min作为样品，另一份通入空气作为对照样品。首先在分 光光度计中扫描对照样品400-500nm的光吸收值，然后扫描样品400-500nm的光吸收值，相 应波长处两样品光吸收的差值即为差光吸收值，以差光吸收值为纵坐标，对应的波长为横坐 标，所得曲线即为样品的一氧化碳差光光谱图。与通入空气的对照样品相比，通入CO气体 以后，重组菌能够在420nm左右的波长下产生光吸收，这与典型的透明颤菌血红蛋白特征吸 收曲线相符，而原始菌没有特征吸收峰，如图5所示。结果表明重组菌中密码子优化后的透 明颤菌血红蛋白基因具有表达活性。

实施例4

5L发酵罐对比实验。

5L发酵罐中装液量2.8L，将原始菌和重组菌株经过活化，进行种子培养后，按照接种量 8％进行接种，37℃培养，转速550r/min，通气量3L/min，用氨水连续流加控制pH为7.0-7.2， 培养60h，发酵期间，在达到稳定期后，每当发酵液的溶氧低于30％时，加入23g木糖，两次 添加的时间间隔为4h。发酵实验进行15次重复实验，取平均值进行比较。

种子培养基：葡萄糖1％(115℃单独灭菌20min)，酵母膏1％，玉米淀粉2％，氯化钠 1％，磷酸二氢钾3％，其余是水；pH6.8.0-7.1,121℃灭菌20min，装液量25/250ml三角瓶；

发酵培养基：玉米粉9％，豆饼粉3％，玉米浆1％，硫酸铵2％，磷酸二氢钾8％，硫酸镁0.3％， 氯化钙1％，其余是水；pH6.8.0-7.1,121℃灭菌20min，装液量2.8L/5L。

实施例5

中温α-淀粉酶的酶活及最终产量的测定。

(1)酶活单位定义：1g固体酶粉(或者1mL液体酶)，于60℃、pH＝6.0条件下，1h 液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。

(2)原理：α-淀粉酶制剂能将淀粉分子链中的α-1,4-葡萄糖苷键随机切断成长短不一的 短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮紫色的特性反应逐渐消失，呈现棕红色， 其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可通过反应后的吸光度计算酶活力。

(3)试剂和溶液

原碘液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮存于 棕色瓶中。

稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加20.0g碘化钾用水溶解并定容至500mL，贮存于棕色瓶 中。

可溶性淀粉溶液(20g/L)：称取2.000g(精确至0.001g)可溶性淀粉(以绝干计)于烧 杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的 烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100mL。溶液现配现用。(注：可溶 性淀粉可采用湖州展望化学药业有限公司生产的酶制剂专用可溶性淀粉。)

磷酸缓冲液(pH＝6.0)：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容至 1000mL。用pH计校正后使用。

盐酸溶液[c(HCl)＝0.1mol/L]：按GB/T601配制。

(4)仪器和设备

恒温水浴锅：控温精度±0.1℃。

分光光度计。

自动移液器。

试管：25mm*200mm。

秒表。

(5)分析步骤

待测酶液的制备：精确吸取酶液1.00mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾 入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中， 用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。(注：待测中温α-淀粉酶酶液 活力控制酶液浓度在3.4u/mL-4.5mL范围内。)

测定：吸取20.0mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液5.00mL，摇匀后，置于 60℃±0.2℃恒温水浴中预热8min；加入1.00mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确 反应5min；立即用自动移液器吸取1.00mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸和5.0mL稀碘 液的试管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.0mL稀碘液为空白，于660nm波长下，用10mm 比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度表A.1(GB8275-2009中表A.1)，求得测试酶液 的浓度。

计算：

中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算：

X＝c*n，

式中：X－样品的酶活力，u/mL活u/g；

c－测试酶样浓度，u/mL活u/g；

n－样品的稀释倍数。

所得结果表示至整数。

(6)5L罐产量的测定结果

测定15个批次发酵实验的最终酶活单位，在最终发酵体积一致的情况下，其中原始菌的 发酵液平均酶活单位为513u/mL，重组菌的发酵液平均酶活单位为2068u/mL，重组菌株中温α- 淀粉酶的产量较原始菌株提高了303％。