恒河猴肝癌模型、恒河猴肝癌细胞株及其用途

摘要

本发明公开了一种制备恒河猴肝癌模型的方法，它是将二乙基亚硝胺施用于灵长类动物，二乙基亚硝胺的施用剂量为：40mg/Kg/次。本发明还提供了一种恒河猴肝癌细胞株及其用途。本发明动物模型可以用于啮齿类动物模型无法完成的肝癌预防因素、抗肝癌新药、肝癌放射治疗、肝癌外科手术治疗、影像学诊断等新技术的评价。

说明书

技术领域

本发明涉及一种恒河猴肝癌模型、恒河猴肝癌细胞株及其用途。

背景技术

肝癌，即肝细胞癌Hepatocellularcarcinoma,HCC，是肝脏常见的恶性肿瘤，每年新诊病例达70万，仅2012年全球肝癌新发病例为78.2万，死亡病例为74.6万，目前因其治疗措施十分有限，肝癌严重威胁着人类健康和生命。目前中国内地肝癌发病已位居消化道恶性肿瘤死亡率之首，发病人数占全球的55％，死亡人数为全球的45％。如何提升肝癌的诊治水平、提高患者的生活质量是肝癌防治研究中急需解决的根本问题。肝癌动物模型，尤其是能更好预测临床疗效的肝癌动物模型是肝癌诊断、治疗新措施、新技术及抗癌新药的研发成功的关键。迄今，有关肿瘤基础研究和抗肿瘤新药疗效评价的体内试验研究都是用啮齿动物模型，包括免疫健全小鼠的可移植性同种动物模型和免疫缺陷或基因工程小鼠人体肿瘤可移植异种动物模型。虽然啮齿动物肿瘤模型为肿瘤基础研究和抗肿瘤新药疗效评价付出了巨大贡献，在相关研究领域广泛应用，但仍然存在许多缺陷，如：荷瘤动物存活时间短，不适用于长时观察；小动物对外科手术、放疗等耐受差，不适用于连续动态观察；所荷肿瘤组织小，不适宜活检动态观察等。Smith等总结了猕猴、其他灵长类动物、狗和大鼠药物代谢和人的相关性，发现恒河猴中有71％经研究的化合物与人类相关性较好，狗的实验结果有19％、而大鼠仅有14％与人类近似。可见，利用啮齿动物模型研究疾病机制及研发药物，所获结果与人类临床疗效相关性很低，致使大多数新药在临床试验中被淘汰。啮齿动物在解剖学、病理生理和药物代谢反应等方面与人类差异较大，其试验结果与临床相关性或疗效可预测性存在很大差距，因此建立新的、更为有效的非人灵长目大动物肝癌动物模型势在必行。

恒河猴在解剖学、病理生理、免疫和药物代谢反应等方面与人类高度相似，其基因序列与人类疾病直系同源基因和药物靶点具有高度相似性。化学致癌剂，如：N-Nitrosodiethylamine(DENA)，2-amino-3-methylimidazoquinoline(IQ),aflatoxinB1,sterimatocysti,HBV等可诱发恒河猴肝癌，其中以DENA对恒河猴致癌性较强，较稳定，HBV+DENA诱发的恒河猴肝细胞癌，其病理学发现与人肝癌相似。研究结果提示，DENA等可用于建立化学诱导恒河猴肝肿瘤模型。但既往研究主要关注化学致癌剂的致癌作用，并未提出通过化学致癌剂诱发恒河猴肝肝细胞癌，建立恒河猴肝癌模型、可移植性猴肝细胞癌细胞株、体内异种异位和原位或同种异位和原位可移植性肝癌模型，以期用于临床前肝癌诊断、治疗新措施、新技术及抗癌新药的研发。

目前世界上尚无可重复性建立的恒河猴肝癌模型和可移植性恒河猴肝细胞癌细胞株。

发明内容

本发明的技术方案是提供了二乙基亚硝胺在制备用于筛选治疗肝癌药物的动物模型中的用途。本发明的另一技术方案是提供了恒河猴肝癌模型的建立。

本发明提供了一种制备肝癌动物模型的方法，它是将二乙基亚硝胺施用于灵长类动物，二乙基亚硝胺的施用方法和剂量为：40mg/Kg/次。

优选地，所述灵长类动物为恒河猴。

优选地，所述的二乙基亚硝胺的施用方法和剂量为：腹腔注射给药，每次40mg/Kg，每周一次，共施用20次。

本发明还提供了该方法制备得到的肝癌动物模型。

本发明还提供了一种恒河猴肝癌细胞株，它中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCCNO：C2015142的恒河猴肝癌细胞株M12353。

本发明恒河猴肝癌细胞株M12353，于2015年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，其地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为：CCTCCNO：C2015142。

其中，前述细胞株是由前述肝癌模型分离纯化制备。

本发明还提供了前述恒河猴肝癌细胞株在制备肝癌动物模型中的用途。

优选地，所述肝癌动物模型是恒河猴肝癌模型。

本发明还提供了前述肝癌动物模型、前述恒河猴肝癌细胞株在筛选治疗肝癌的药物和/或肝癌预防因素、抗肝癌新药、肝癌放射治疗、肝癌外科手术治疗、影像学诊断的研究中的用途。

本发明还提供了一种筛选治疗肝癌的药物的方法，包括如下步骤：

a将候选物施用于前述肝癌动物模型、前述恒河猴肝癌细胞株；

b、用前述肝癌动物模型、前述恒河猴肝癌细胞株评价潜在的治疗肝癌的药物。

本发明方法成功建立的恒河猴肝癌模型，可以用于啮齿类动物模型无法完成的肝癌预防因素、抗肝癌新药、肝癌放射治疗、肝癌外科手术治疗、影像学诊断等实验研究。

另一方面，本发明还成功建立可以长期稳定传代的恒河猴肝癌细胞株M12353，其可在体外长期稳定传代，目前已传代>80，已持续时间>16月，免疫缺陷动物(裸小鼠)异种移植具有成瘤性，每点接种1-2×10⁶细胞，成瘤率为100％,潜伏期为10-14天；可以移植于恒河猴体内成瘤，制备同种恒河猴肝癌模型，用于肝癌预防因素、抗肝癌新药、肝癌放射治疗、肝癌外科手术治疗、影像学诊断等实验研究，应用前景良好。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

附图说明

图1猴M12393多发性肝肿瘤

图2恒河猴肝癌CT照片

图3恒河猴血清白aFP检测结果3A-2—H1-2为内参标准；A3-7—E3-7为不同稀释度的荷肝癌猴血清；F3-7—H3-7为正常猴血清。

图4M12393肝癌组织病理学形态

图5M12385肝癌组织病理学形态

图6恒河猴M12353肝癌大体形态

图7M12353肝癌组织病理学形态

图8M12353肝癌组织裸小鼠皮下接种移植成瘤

图9M12353肝癌组织裸小鼠移植成瘤组织病理学形态

图10M12353肝癌组织块体外培养形态

图11M12353肝癌细胞形态

图12M12353肝癌细胞裸小鼠移植成瘤组织病理学形态

图13猴肝癌细胞M12353生长曲线

图14化疗药物对猴肝癌细胞M12353及人肝癌细胞的生长抑制作用

图15化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)对猴肝癌细胞M12353及人肝癌细胞生长抑制作用的形态观察

具体实施方式

实施例1本发明动物模型的制备

1、材料与方法：

1.1实验材料

出生1周内健康恒河猴，雄性，体重0.5-0.8kg，6只，购自成都格林豪斯生物科技有限公司。

1.2主要试剂

二乙基亚硝胺：购自Sigma公司。

生理盐水购自西南药业股份有限公司)。

1.3主要溶液的配制

二乙基亚硝胺溶液的配制：

取DENA原液(Sigma)25ml,加注射用生理盐水75ml,配制成20％DENA水溶液，避光保存备用。

1.4主要仪器

一次性医用灭菌注射器：购自四川双陆医疗器械有限公司。

1.5造模方法

用进20％DENA水溶液腹腔注射给药，40mg/kg,每周一次，共注射20次；每2周称体重，观察动物一般情况。

2实验结果

2.1DENA诱发恒河猴肝细胞癌CT检查结果

实验组1只恒河猴死亡，其他5只存活。

1只猴于实验第432天(14月)因失血性休克肝脏衰竭，肠套叠死亡(尸解发现)，解剖发现肝脏直径0.5-4.5CM大小多发性肿块(图1)，与人肝癌外形相似。

对其余5只恒河猴进行CT检查，4只发现肝脏占位性病灶，1只不确定。其代表性照片如图(图2)。

2.2荷肝细胞癌恒河猴血清人肝癌相关标志物检测结果

采集5只存活的实验组恒河猴及6例正常恒河猴的血清，用Elisa法进行了如下(表1)肝癌相关标志物检测。

表1猴肝癌模型血清标志物检测

结果：

(1)检测结果见(表2-5，图3)

表2甲胎蛋白(aFP)

表3谷胱甘肽-S-转移酶(GSTP1)

表4异质性胞核核糖核蛋白K(HNRNPK)

表5脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)

由表2-表5以及图3可以看出，本发明方法制备的恒河猴模型，其肝癌的标志物：甲胎蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、异质性胞核核糖核蛋白K、脱-γ＝羧基凝血酶原均大量表达。

2.3恒河猴肝细胞癌病理学检测结果

选取

取两只存活恒河猴，取肝脏上的肝癌组织，用10％中性甲醛固定，常规石娜包埋、切片HE染色，显微镜观察。

结果如图4和图5所示：所有肿瘤组织均为不同分化程度的肝细胞癌，与人肝细胞癌形态相似。

本发明方法制备的恒河猴肝癌动物模型，出现肝脏占位性病灶，高表达肝癌的标志物，同时，肝脏出现癌变，癌细胞与人肝细胞癌形态相似，说明恒河猴肝癌模型建模成功。

实施例2恒河猴肝癌细胞株M12353建立

一、实验方法

1、恒河猴肝细胞癌组织裸小鼠异种移植

取实施例1中存活的、编号为M12353的荷肝癌恒河猴，二氧化碳吸入麻醉处杀荷肝癌恒河猴M12353,取肝肿瘤组织分别用于：(1)用10％中性福尔马林固，用于组织病理学检查；(2)置无血清培养液，用于裸小鼠异种移植；(3)置无血清培养液，用于细胞培养。

2、细胞株的建立

取M12353肝癌组织或裸小鼠移植成瘤组织，去除出血坏死组织，修剪成0.1-0.5mm组织块，将组织块按一定间距置入培养皿内，静置30分钟后加入HM培养液(Hepatocytemedium,Sciencell,5201),根据细胞生长情况每隔1-2天换液或用(Gibco,A11105-01)消化传代,液氮冻存。

二、实验结果

1、恒河猴肝细胞癌组织裸小鼠异种移植

(1)恒河猴M12353肝癌大体形态学观察如图6所示。

(2)恒河猴M12353肝癌组织病理学观察如图7所示。

(3)恒河猴M12353肝癌裸小鼠皮下移植成瘤

取无坏死出血的M12353肝癌组织无菌制作成0.5-1.0mm组织块，或加等量无血清培养液制作成组织悬液，再加等量Matrigel(BD),给裸小鼠皮下接种移植。

结果：

M12353肝癌组织直接裸小鼠皮下接种移植具有成瘤性(图8)。目前已在裸小鼠体内连续传10代，移植成瘤率为90-100％。

M12353肝癌组织裸小鼠移植成瘤组织病理学观察(图9)，肝细胞癌形态与原恒河猴M12353肝癌或人肝细胞癌相似。

2、细胞株的建立

(1)M12353肝癌组织块体外培养至72小时，可见组织块周围细胞长出(图10)。

(2)获得的M12353肝癌细胞株随培养时间延长，传代次数增加细胞活性增强(图11)，多形性铺路石样生长，细胞形态均一，为纯细胞系。

本发明获得的M12353肝癌细胞株，命名为恒河猴肝癌细胞株M12353，于2015年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，其地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为：CCTCCNO：C2015142。

本发明从实施例1制备的恒河猴肝癌动物模型的肝癌组织中，分离得到了恒河猴肝癌细胞株M12353。

实施例3本发明恒河猴肝癌细胞株M12353的成瘤性和生长特性检测

1、体外培养恒河猴肝癌细胞株M12353裸小鼠皮下移植成瘤

收获体外培养至50代本发明保藏号为CCTCCNO：C2015142的恒河猴肝癌细胞株M12353，用无血清培养液及基质胶(1:1)重悬制备细胞悬液，用细胞悬液裸鼠皮下接种移植，1.5-5×10⁶个接种动物，每次2-4个点，重复5次。

结果显示，每次每个点均可以成瘤，成瘤率为100％，成瘤组织病理学形态如图12所示，与肝癌组织的病理特征相同。

实验结果说明本发明保藏号为CCTCCNO：C2015142的恒河猴肝癌细胞株M12353具有成瘤性，也说明本发明的确获得是肝癌细胞株。

2、体外培养M12353恒河猴肝癌细胞生长曲线测定

取对数生长期的猴肝癌细胞M12353消化后按2×10³个/孔接种于96孔板中，放置96孔板于培养箱内培养，每隔24小时取8孔每孔加入10μlMTT，继续培养4h，再加入100μl10％SDS/0.01NHCl，培养箱内过夜，用酶标仪(λ＝570nm)测定OD值，绘制细胞生长曲线。

结果显示，本发明保藏号为CCTCCNO：C2015142的恒河猴肝癌细胞株M12353生长状态良好，倍增时间30±h(图13)。

实施例4本发明恒河猴肝癌细胞株M12353作为细胞模型的药物干预实验

1、实验方法

取对数生长期的本发明保藏号为CCTCCNO：C2015142的恒河猴肝癌细胞株M12353及人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2、Hep3B,消化后按2×10³个/孔接种于96孔板中，每孔100μl培养24h，分别用不同剂量的5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(ADM)、奥沙利铂(L-OHP)分别处理，每个剂量组3个复孔，放置96孔板于培养箱内培养72h后，每孔加入10μlMTT，继续培养4h，再加入100μl10％SDS/0.01NHCL，培养箱内过夜，用酶标仪(λ＝570nm)测定OD值，取其平均值。计算细胞存活率，细胞存活率＝处理组OD值÷对照组OD值×100％，实验重复3次。

2、实验结果：

临床常用肝癌化疗药物氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(ADM)、奥沙利铂(L-OHP)均可抑制本发明保藏号为CCTCCNO：C2015142的恒河猴肝癌细胞株M12353的生长；本发明保藏号为CCTCCNO：C2015142的恒河猴肝癌细胞株M12353对临床常用肝癌化疗药物氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(ADM)、奥沙利铂(L-OHP)的敏感性与人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2、Hep3B相似(图14，15)。

实验结果说明，本发明保藏号为CCTCCNO：C2015142的恒河猴肝癌细胞株M12353可以用于筛选治疗肝癌的药物，也进一步证实了本发明获得恒河猴肝癌细胞株M12353就是肝癌细胞株。

综上，本发明制备的肝癌动物模型建模成功，可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药的评价和干细胞移植治疗技术的评价。同时，本发明还成功建立可以长期稳定传代的恒河猴肝癌细胞株M12353，其可在体外长期稳定传代，目前已传代>80，已持续时间>16月，免疫缺陷动物(裸小鼠)异种移植具有成瘤性，每点接种1-2×10⁶个细胞，成瘤率为100％，潜伏期为10-14天，可以移植于恒河猴体内成瘤，制备同种恒河猴肝癌模型，还可以用于肝癌预防因素、抗肝癌新药、肝癌放射治疗、肝癌外科手术治疗、影像学诊断等实验研究，应用前景良好。