一株高产拮抗烟草青枯病活性物质的内生解淀粉芽孢杆菌

摘要

本发明涉及微生物农药技术领域，公开了一种高产拮抗烟草青枯病活性物质的内生解淀粉芽孢杆菌BG2，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC？NO：M？2015173，本发明还公开了该菌株的盆栽应用、所产抗菌物质鉴定及其高产发酵工艺优化。该菌株在烟草植株组织及其根围土壤中具有良好的定殖能力，能产生拮抗烟草青枯病原菌的活性物质，能够抑制多种病原真菌，可廉价的扩大生产制备和有效应用。对抗病活性物质进行分离纯化鉴定分析，发现其活性组分主要为脂肽surfactin同系物和蛋白质。本发明还提供了该抑菌活性物质的高产发酵工艺，其特征为豆粕10-100g/L，葡萄糖5-50g/L，K2HPO4？1-10？g/L，CaCl20.05-1.00g/L，MgSO4？0.05-1.00g/L，pH？7.2-7.4，培养温度25-40℃，接种量1-5%，装液量10-100ml/250ml，种龄6-18h，发酵24-60h。

说明书

技术领域

本发明涉及利用微生物农药技术领域，特别是涉及应用一种抗烟草青枯病的烟草内生解淀粉芽孢（Bacillusamyloliquefaciens）BG2的盆栽应用、抗菌物质高产发酵工艺优化及其抗菌物质的理化性质研究和鉴定。

背景技术

烟草（Nicotianatabacum）具有很高的经济价值，可以说是我国最重要的经济作物之一，烟草青枯病（TobaccoBactrialWilt），是烟草的主要病害之一，被称为“烟癌”，是由青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的一种系统性导管毁灭性病害，是在世界范围内都普遍发生的严重土传病害，主要分布于热带、亚热带及广阔的温带地区。长久以来，对茄科植物青枯病的防治手段主要为化学药剂防治和栽培措施防治，然而烟草青枯病害由于其复杂的病原菌亚种、极端的杀伤力、持久的存活能力、广泛的地理分布及宿主范围而难以有效防治；生物防治能有效地抑制病虫害的发生，且对环境无污染，这使得其迅速地引起了众多研究者的关注。

植物内生细菌定义为在其生活史的一定阶段或全部阶段能够存活并定殖于植物内，对寄主植物不产生危害的一类细菌，内生细菌防治病害的机制主要有分泌抗菌物质、内生细菌与病原菌竞争生态位和营养物质、诱导系统抗性（ISR）以及促生长等几个方面，其中，芽孢杆菌属被认为是生产生物活性分子的微生物工厂。刘伟等（2014）报道了一株能够产生抗菌物质的甲基营养型芽孢杆菌LW-4菌株，其对盆栽烟草青枯病的防治效果达到了70.37%，其抗菌物质能够通过25%饱和度的硫酸铵盐析完全沉淀；张秀玉等（2010）报道了一株枯草芽孢杆菌SH7菌株，其能够产生一种具有淀粉酶活力的胞外抗菌蛋白，能够拮抗烟草青枯病原菌；Zhu等（2012）报道了一株BacillusamyloliquefaciensXZ-173菌株，通过固体发酵促使其高产脂肽类物质，该脂肽类物质能够拮抗水稻纹枯病及茄科青枯病；Chen等（2014）报道了一株对茄子青枯病有拮抗作用的BacillusamyloliquefaciensS20菌株，其防效能够达到70.7%，经鉴定其主要抗菌物质为iturinA。

对于烟草青枯病的生物防治研究很多，但是极少报道植物内生菌的具体抗菌物质及其对烟草青枯病的防治效果，植物内生菌在植物生物防治外源病原菌方面具有更大优势，其所产抗菌物质的研究在植物土传病害的生物防治中起着至关重要的意义。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种能够产生青枯病菌拮抗活性物质、并能在烟草根际及植株中良好定殖、抑菌谱较广泛的烟草内生菌。

本发明的第二目的是提供一种烟草青枯病拮抗内生菌所产的抗菌活性物质，其理化性质及其高产培养工艺。

为了实现以上目的，本发明采取了以下技术措施：

一种拮抗烟草青枯病的烟草内生芽孢杆菌菌株，分离自白肋烟烟茎，采用平板对峙法，获得一株具有显著拮抗青枯病菌效果的菌株，命名为BG2，经微生物生理生化特性及16SrDNA系统分析鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），该菌株于2015年3月27日保藏于位于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCNO：M2015173。

研究烟草内生芽孢杆菌BG2的盆栽应用效果，发酵工艺为豆粕10-100g/L，葡萄糖5-100g/L，KH₂PO₄0.5-10g/L，MgSO₄0.1-10g/L，MnSO₄0.02-1g/L；培养条件pH6.8-7.4，温度25℃-45℃，装液量10-100ml/250ml，转速150r/min-250r/min，种龄6-16h，接种量0.1%-10%，发酵36h-72h，发酵后发酵液稀释100倍作为液体菌剂施用。

对烟草内生芽孢杆菌BG2所产抗菌物质进行热稳定性、酸碱稳定性及紫外耐受性的检测，发现其在70℃以下活性基本不变，在pH2-10条件下仍能保持大部分的活性，在短时间内对近距离接触的紫外有一定的耐受性；将BG2所产抗菌物质初步分离纯化后经LC-MS分析鉴定其主要抗青枯病原菌活性物质为surfactin家族同系物，另外还检测到其中含有蛋白类抑菌活性物质等。

一种能够促使芽孢杆菌BG2产生抗菌活性物质的培养基MK（酵母浸粉30g/L，葡萄糖20g/L，K₂HPO₄1.5g/L，MgSO₄1.5g/L，pH7.4），通过单因素和正交分析优化培养基配方和培养条件，获得一种高产抗菌活性物质的培养工艺，其特征为：豆粕10-100g/L，葡萄糖5-50g/L，K₂HPO₄1-10g/L，CaCl₂0.05-1.50g/L，MgSO₄0.05-1.50g/L，条件pH6.8-7.4，装液量10-100ml/250ml，种龄6-16h，接种量0.1%-10%，发酵温度25℃-45℃，转速150r/min-250r/min，发酵36h-72h，

将BG2液体菌剂浇灌烟草植株根系，20天后将烟草青枯病原菌RS9-2发酵液浇灌烟草植株根系，烟草根围土壤BG2菌株以高于4×10⁷CFU/g土壤的生物量保持稳定，在烟草根、茎、叶中也均有存在，且青枯病原菌的生物量呈现持续下降的趋势，小范围盆栽结果显示病害防效达到了65%。

与现有烟草青枯病生物防治基础技术相比，本发明的优点在于：本发明从健康白肋烟烟茎中筛选获得了一株对烟草青枯病原菌具有明显抑制效果的内生解淀粉芽孢杆菌，该菌株在烟草植株及其根围土壤中有很好的定殖能力，对青枯病原菌有明显的抑制效果，能够抑制多种病原真菌，且可以廉价扩大生产和有效应用；本发明提供了一种烟草内生芽孢杆菌产生的能够拮抗青枯病原菌的物质及其高产培养工艺。

附图说明

图1为烟草青枯病拮抗内生菌BG2的系统发育分析；

图2为BG2菌株在烟草植株中定殖情况及其与RS9-2在烟草根围土壤中互作的情况；

图3为BG2菌株所产抗菌物质理化性质；

图4为抗菌物质的LC-MS-MS鉴定；

图5为不同培养基成分对BG2产抗菌物质的影响；

图6为不同培养条件对BG2产抗菌物质的影响。

具体实施方式

实施例1：拮抗菌株筛选与鉴定

取大田健康白肋烟植株烟茎，表面消毒后切块，于生理盐水中富集后于80℃水浴，稀释涂布挑取单菌落，以烟草青枯病原菌为指示菌，进行平板对峙实验，筛选出一株具有显著拮抗效果的生防菌BG2菌株，该菌株菌体杆状，产芽孢，在LB平板上菌落圆形扁平，表面粗糙，白色不透明，边缘参差不齐，有扩张，不黏着，易挑取。通过对BG2菌株的16SrDNA序列分析，在GenBank核苷酸序列数据库中进行Blast比对搜索，选择与BG2同源性较高的序列进行系统发育学分析，结果如图1所示。依据以上结果可认定BG2菌株为芽孢杆菌属，与解淀粉芽孢杆菌同一种群。

实施例2：抗菌谱测定、盆栽定殖与防效检测

取实验室保藏的14株病原真菌，采用圆盘打孔法，各取一菌块置于培养皿中央，于30℃培养，待其菌落长到直径约3-5cm，在距其约1cm处打孔，加入20μL过滤除菌的BG2菌株发酵上清液，于30℃培养，待真菌扩散至平皿边缘记录抑菌情况，结果如表1所示，由表1可以看出菌株BG2对多种病原真菌有很好的抑制效果。

将K326品种的烟草育苗后移栽至供试盆栽中，将烟草内生菌株BG2接入发酵培养基，25-40℃、150-250r/min发酵24-60h，将烟草青枯病原菌RS9-2菌株接入NA液体培养基，25-35℃、150-250r/min发酵12-24h；以菌株BG2发酵液稀释100倍作为液体菌剂，取100mL浇灌烟草植株根系，20天后以烟草青枯病原菌9-2发酵液稀释液浇灌烟草植株根系，保证拮抗菌总菌数为1×10⁹CFU/株烟苗，病原菌总菌数为1×10⁷CFU/株烟苗。接种后每隔一定时间取土样检测拮抗菌和病原菌在土壤中的存活情况，取烟草植株样品检测，采用平板稀释涂布计数。结果如图2所示。由图2a看出，菌株BG2能够在烟草根围土壤中稳定存活，且最终其生物量能够稳定在4.55×10⁷CFU/g土壤，在拮抗菌BG2存在情况下，烟草青枯病原菌RS9-2在烟草植株根围土壤中抑制呈现明显的下降趋势；由图2b看出，接种20天后，菌株BG2能够在烟草植株根、茎、叶中均能检测到定殖，且能保证生物量高于1.30×10⁵CFU/g植物组织。

将供试烟草盆栽分别进行处理，以菌株BG2发酵液稀释100倍作为液体菌剂，取100mL浇灌烟草植株根系（T），以浇灌100mL无菌水的植株盆栽作为空白对照（CK），每个处理4个重复，每个重复5盆。肥水管理按常规方法进行，在室温生长60天后统计各处理的烟草青枯病发病率，按以下公式计算发病率和防效：

发病率=发病株数/调查株数×100%

防效（%）=空白对照的发病率—拮抗菌处理的发病率

防治效果统计如表2所示。

表1菌株BG2的抑菌谱

植物病原菌抑菌效果植物病原菌抑菌效果花生叶霉++油菜白斑+++棉花立枯+甜瓜枯萎++棉花枯萎++灰葡萄孢霉++三叶草核盘+芦笋枯萎+水稻纹枯+烟草赤星病菌++西瓜枯萎+++小麦叶霉++苹果纶纹+++西瓜枯萎++小麦赤霉+立枯丝核++

注：“+”阳性反应，“+”的数量表示抑菌强度。

表2生防效果统计

实验组发病株数调查株数发病率防效CK162080.00%T32015.00%65.00%

实施例3：抗菌活性物质鉴定

抗菌物质对温度、pH值、紫外的稳定性：将菌株BG2所产抗菌物质于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、100℃、115℃和121℃下处理30min；将菌株BG2所产抗菌物质pH分别调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，过夜处理；将菌株BG2所产抗菌物质于30W紫外灯下，距离15cm处分别照射1h、2h、3h、4h、5h、6h，分别测定滤液对烟草青枯病原菌的拮抗活性。结果如图3所示，由图3a可以看出菌株BG2所产抗菌物质在30℃-60℃能保持90%以上的抗菌活性；由图3b可以看出菌株BG2所产抗菌物质在pH3-pH8条件下能够保持85%以上的抗菌活性；由图3c可以看出菌株BG2所产抗菌物质在近距离紫外照射6h后仍能保持60%以上抗菌活性。

抗菌物质的鉴定：将菌株BG2发酵离心上清调至pH4.0，于4℃过夜，然后于10000r/min离心10min，收集沉淀和上清，沉淀用甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，滤液作为抗菌物质粗提品用于LC-MS检测，HPLC进样量为1-10μL，检测波长为200-280nm，流速为0.1-1.0mL/min；质谱条件为毛细管电压65V，解离电压150-200V，正离子模式检测，利用ESI-MS测定抗菌物质的相对分子质量。结果如图4所示，根据质谱分析，我们推断母离子峰m/z1058.6738是脂肪酸链为15个碳原子的surfactin产生的，其氨基酸顺序为β-OH-C₁₅-Gln-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu；其余母离子峰分别为脂肪酸链为13和14个碳原子的surfactin同系物产生的。

将菌株BG2发酵离心上清进行硫铵沉淀后用PBS缓冲液溶解，溶解液经过透析脱盐，脱盐后样品经0.22μm滤膜过滤除杂，滤液作为抗菌蛋白粗提品用于FPLC检测，进样量为1-5mL，检测波长250-290nm，流速为1.0-10.0mL/min，流动相为A：10-100mM乙酸钠和0.1-1.0MNaCl，pH7.0-9.0，B：10-100mMTris-HCl，pH4.0-5.0；检测发现该抗菌物质还还有未知抑菌活性蛋白类物质。

实施例4：BG2菌株发酵培养

种子培养基LB（g/L）：蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl10.0，pH7.4。

种子培养：无菌条件下，挑取4℃保存BG2菌株斜面，接种于无菌LB液体培养基中，于25-40℃、180-250r/min培养8-16h。

液体发酵培养基：酵母浸粉30g/L，葡萄糖20g/L，K₂HPO₄1.5g/L，MgSO₄1.5g/L，pH7.2-7.4。

将BG2种子液按2%接种量接种到液体发酵培养基中，于240r/min、30℃保温发酵培养24h，得到发酵初产品；将发酵初产品于10000r/min离心5min去除菌体和杂质，离心所得上清液通过过滤膜除菌，得到发酵产品；以烟草青枯病原菌RS9-2为指示菌，对发酵产品进行平板对峙抑菌试验，以抑菌圈直径为抗菌物质含量的指标，结果见图5。

实施例5：BG2菌株发酵培养基氮源优化

根据实施例4，本实施例所用液体发酵培养基将实施例4中液体发酵培养基中的酵母浸粉替换为30g/L的玉米浆、豆粕、蛋白胨、牛肉膏（图5a）。

实施例6：BG2菌株发酵培养基碳源优化

根据实施例4，本实施例所用液体发酵培养基将实施例4中液体发酵培养基中的葡萄糖替换为20g/L的玉米淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖（图5b）。

实施例7：BG2菌株发酵培养基无机盐优化

根据实施例4，本实施例所用液体发酵培养基将实施例4中液体发酵培养基中的无机盐替换为不同浓度的磷酸氢二钾（图5c）、硫酸镁（图5d）、氯化钙（图5e）。

实施例8：BG2菌株发酵培养基正交优化

根据实施例5-7，本实施例所用液体发酵培养基参照表3进行正交试验。

表3培养基主要因素正交表

实施例9：BG2菌株发酵培养条件优化

根据实施例8，本实施例所用液体培养基为豆粕10-100g/L，葡萄糖5-50g/L，K₂HPO₄1-10g/L，CaCl₂0.05-1.50g/L，MgSO₄0.05-1.50g/L，条件pH6.8-7.4；培养条件设置不同发酵时间（12-60h）、接种量（2%-5%）、种龄（8-16h）、装液量（20mL-50mL/250mL），根据实施例4对各发酵产品进行检测，结果见图6，a-d分别为发酵时间、接种量、种龄和装液量。

初始培养基成分和培养条件下菌株BG2产生的抑菌活性物质的能力为50μL发酵上清对含有1×10⁸CFU/mL青枯病原菌的平板对峙的抑制面积为275.05mm²，菌株BG2的生物量为5.8×10⁸CFU/mL，芽孢数为2×10⁸CFU/mL。

在最优培养基成分和培养条件下菌株BG2产生的抑菌活性物质的能力相比出发培养基提高了78.60%，50μL发酵上清对含有1×10⁸CFU/mL青枯病原菌的平板对峙的抑制面积为349.93mm²，同时菌株BG2的生物量达238×10⁸CFU/mL，较出发培养基提高了41倍，芽孢数达29×10⁸CFU/mL，较出发培养基提高了15倍；该培养基配方适用于多种生防菌产抗菌物质的培养。

<110>武汉骏安生物科技有限公司

<120>一株高产拮抗烟草青枯病活性物质的内生解淀粉芽孢杆菌BG2

<130>2015

<160>1

<170>PatentInversion3.3

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<211>1434

<212>DNA

<213>解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）

<400>1

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