法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-05-17
授权
授权
2016-02-17
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/15 申请日:20151014
实质审查的生效
2016-01-20
公开
公开
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域,特别涉及一种研究口炎清制剂或其他中药方 剂配伍配伍关系,筛选最佳组方的方法。
背景技术
中医治病注重辨证论治,方剂配伍则注重君臣佐使,通过多味中药的相互配 合来实现对机体失衡状态的修正。然而,由于东西方文化的差异,对于中药复杂 体系来说,传统的“君臣佐使”理论,尚未被西方医学界接受。国内外通过药效实 验科学解释中药组方配伍规律,尚处于发轫阶段。用量化的指标来研究“君臣佐 使”理论,是实现方剂学发展的必然趋势。贺丰等选取张仲景《伤寒论》明方麻 黄汤(由麻黄、桂枝、杏仁、甘草四味药材组成),以伪麻黄碱(PE)为指标, 研究了不同配伍的麻黄汤给药后人体内PE的血药浓度动态变化过程,结果表明 臣药桂枝、佐药杏仁、使药甘草对PE药代学参数具有显著影响,且三者间存在 一定的交互作用,从而明确了麻黄汤方剂中臣佐使药在方中的地位和作用。该组 方规律研究方法存在一些不足之处:(1)麻黄汤中方中麻黄的君药地位缺乏研究 数据支持,仍然凭借经验确定;(2)只研究了麻黄中的单一效应成分,不能完全 代表其余三味药材与麻黄药材间的相互作用;(3)无法具体阐述各味药材对处方 整体药效贡献的主次关系,以及各味药材各自药效间的相互作用,科学筛选确证 最佳组方配伍关系。
口炎清颗粒由山银花、玄参、麦冬、天冬、甘草5味药材组成,可滋阴清热、 解毒消肿,临床用于治疗阴虚火旺的口腔炎症疾病,收录在《国家基本药物目录》 (2012年版),是6个治疗咽喉、口腔病的国家基本用药之一。目前,基于药效实 验研究口炎清颗粒的组方规律,国内外尚无相关报道。本发明首次采用在体动物 药效与原料药材含量相关联的方法,明确了口炎清颗粒中各味药材的药效贡献及 其主次关系,揭示了其君臣佐使的组方规律,筛选并确证了其原有组方配伍为最 佳,为临床用药提供参考。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足,提供了一种研究复方中药组方 配伍规律用于筛选确证最佳中药配伍的方法,包括以下步骤:
(1)按复方中药组方,以各组分的质量百分含量为变量因素,采用均匀设 计方法构建具有各组分不同投料比例的差异样品;
(2)通过药效学研究获得各差异样品的药效数据;
(3)运用数理统计方法分析各差异样品各组分含量与药效间的关联性,明 确各组分对药效贡献及其主次关系,从而确定其组方配伍规律,筛选最优的配伍 关系。
该方法可于筛选和确证口炎清制剂抗炎药效组方配伍关系的研究,具体包 括以下步骤:
(1)在口炎清制剂的组方配比的约束下,以各组分质量百分含量为因素, 采用均匀设计方法构建具有各组分不同投料比例,符合统计要求的若干差异样品;
(2)构建与口炎清制剂药效对应的体外炎症模型,进行差异样品药效学实 验,检测其对促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β的影响,获得相关药效数据;
(3)利用灰色关联分析方法计算差异样品组分含量与药效间的关联性,明 确各组分对药效作用及其主次关系,筛选最优的配伍关系。
所述的差异样品的制备方法为:按照《中华人民共和国药典》2010年版口 炎清颗粒标准生产工艺制备成浸膏待用。
所述的体外炎症模型构建方法为:用香烟提取物刺激人口腔黏膜角化细胞, 构建急性口腔炎症模型。
所述香烟提取物的制备方法为:抽取适量充分燃烧的香烟烟雾,使其完全 溶于无血清RPMI-1640培养基,用0.22μm滤膜过除菌,制备100%香烟烟雾提 取物;所述构建急性口腔炎症模型的具体方法为:将人口腔黏膜角化细胞培养于 含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中,在37℃、5%CO2培养箱中孵育; 用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液,接种到孔板;培养24h,待细 胞长至80%密度时,以含对照标准品或供试品的无胎牛血清培养基替换原培养 基,预处理30分钟后用6%的香烟提取物刺激人口腔表皮样癌细胞造模,继续孵 育24小时,终止培养,用孔内上清液进行检测所述炎症因子的水平。
所述的检测促炎症因子的方法为Elisa试剂盒检测法。
由于山银花组分与TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β4个药效指标间的关联度显 著大于其余组分,应以山银花发为君药;由于组分玄参、天冬和麦冬与IL-6和 IL-1β指标关联密切,与调节多种炎症细胞的增殖、分化及迁移,以及促进白细 胞迁移和黏附分子表达、引起炎症介质的释放相关;甘草与TNF-α指标关联密 切,与诱导IL-1、IL-6等细胞因子及炎性介质的产生、促进炎细胞向病变组织移 行相关,确认组分玄参、天冬、麦冬和甘草通过相互补充,起到增强山银花药效 的作用。
本发明基于口炎清颗粒原料药材与抗炎药效相关联,科学解读其组方中各味 药材的作用及地位,阐明了其组方配伍规律,确证了其组方比例为最佳。本发明 的方法可用于筛选中药最佳配伍,对指导其临床用药,提升其科学内涵具有重要 意义。本技术的实施应用可为其他复方中药制剂的组方规律研究提供范例。
附图说明
图1为口炎清颗粒各组分抗炎活性药效作用及其主次关系的示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明。
一、口炎清颗粒差异样品的构建及其药效学研究
1、实验材料
1.1实验药品与试剂
口炎清差异样品浸膏11批(批号:20140815)及口炎清浸膏(批号:20140515), 均由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供;牛黄解毒片(北京同仁堂科技发展 股份有限公司制药厂,批号:13121398);地塞米松(中国药品生物制品检定所, 批号:100129-201105);香烟(椰树牌,广东中烟工业有限公司);MTT(Sigma, M2128-1G);TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1βElisa试剂盒(武汉优尔生公司);RPMI-1640 培养基(Hyclone)。
1.2实验仪器
净化工作台:苏州净化安泰技术有限公司HT-840型;光学显微镜:Motic AE21;CO2培养箱:FORMASeris303792-6714型;超低温冰箱:海尔BCD-568W; 十万分之一电子天平:SartoriusBP211D;电热恒温水浴锅:上海一恒科学仪器 有限公司130406887型;多孔超微量核酸蛋白分析仪:Botek;冷冻离心机: Eppendorf5430R。
2、实验方法
2.1差异样品的构建
(1)差异样品的构建
根据口炎清颗粒的处方组成比例,山银花:玄参:麦冬:天冬:甘草为 26:21:21:21:11,进行配方约束下五因素十一水平的均匀设计,,每一水平表示相 应药材占5味药材总量的百分比,其中山银花变化为16-36%,玄参0-42%,麦 冬0-42%,天冬0-42%,甘草0-22%,见表1-1。
表1-1口炎清颗粒差异样品构建方案
(2)差异样品的制备
基于差异样品构建方案表,委托广州白云山和记黄埔中药有限公司按照现有 的口炎清颗粒标准生产工艺制备差异样品,各组浸膏的每味药材重量见表1-2。
表1-2口炎清颗粒差异样品浸膏的5味药材重量
2.2差异样品药效学实验
(1)细胞培养
HOK细胞(人口腔黏膜角化细胞),购自广州吉妮欧生物科技有限公司。培养 于RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清,青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL, pH7.2),在37℃、5%CO2培养箱中。
消化细胞,MTT测定时用完全培养基调整细胞密度为5×104个/mL,并铺96 孔板,每孔100μL;ELISA测定时用完全培养基调整细胞密度为4×105个/mL, 并铺24孔板,每孔0.5mL。细胞培养24h后,待密度至80%可给药。
(2)香烟烟雾提取物的制备及各药物的配制
1)香烟烟雾提取物制备
将2支燃烧的椰树牌香烟烟雾用装有10mL的RPMI-1640培养基(无血清) 的50mL注射器连续抽吸6次,每次50mL,共300mL;摇动使其充分溶解, 经0.22μm微孔膜过滤后,得到100%浓度的CSE溶液,用RPMI-1640培养基 (无血清)稀释到需要的浓度后加入细胞,使CSE终浓度为5%,30min内用于实 验。
2)药物的配制
各药物用RPMI-1640培养基(无血清)配制,口炎清1-11号差异样品终浓度 为55.6μg/mL;地塞米松(Dex)终浓度为1μM;牛黄解毒片(NP)终浓度为10μg/mL, 经0.22μm微孔膜过滤后使用。
(3)考察口炎清差异样品的细胞毒性
细胞铺板如前所述,24h贴壁后除去培养基,加入200μL口炎清差异样品 溶液,空白对照组加入等量的RPMI-1640培养基(无血清),置于含5%CO2、37℃ 培养箱中培养24h后,按MTT方法进行测试。
(4)差异样品药效学实验
实验分成15组:空白对照组,模型组(5%CSE),阳性对照Dex组(1μM), 阳性对照NP组(10μg/mL),和口炎清差异样品1-11组(55.6μg/mL)。
细胞铺板如前所述,24h贴壁后换成RPMI-1640培养基(无血清),继续培养 一晚上;然后分别加入Dex、NP、口炎清差异样品,空白对照组和模型组给予 等量的无血清培养基,于5%CO2、37℃培养箱培养,预保护1h;接着各组(除 空白对照组外)加入终浓度为5%的CSE,空白对照组给予等量的无血清培养基, 继续孵育24h;最后取细胞上清液,并釆用ELISA法检测TNF-α、IL-8、IL-6、 IL-1β含量。
(5)数据分析方法
采用SPSS19.0软件,运用单因素方差分析(ANOVA)和T检验方法进行分析, 结果均以表示,P值小于0.05或0.01被认为有统计学差异。
3、实验结果
3.1考察口炎清差异样品的细胞毒性
研究结果(表1-5):55.6μg/mL的口炎清1-11号差异样品对细胞的存活率均 没有显著影响(P>0.05),即对细胞均无毒性。
表1-5细胞存活率
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
3.2细胞急性炎症的改善
(1)促炎因子TNF-α的含量
实验结果(表1-6):模型组TNF-α含量显著升高(P<0.01),给药处理后,NP、 Dex、差异样品1、4、5、6和11,均对TNF-α升高有显著抑制作用(P<0.01,P<0.05)。
表1-6差异样品对促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β的改善
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。
(2)促炎因子IL-8的含量
实验结果(表1-6):模型组IL-8含量显著升高(P<0.01),给药处理后,NP、 Dex、差异样品5和6,均对IL8升高有显著抑制作用(P<0.01,P<0.05)。
(3)促炎因子IL-6的含量
实验结果(表1-6):模型组IL-6含量显著升高(P<0.01),给药处理后,Dex、 差异样品1、2、4、5、6、8、9、10和11,均对IL6升高有显著抑制作用(P<0.01, P<0.05)。
(4)促炎因子IL-1β的含量
实验结果(表1-6):模型组IL-1β含量显著升高(P<0.01),给药处理后,NP、 Dex、差异样品3、4、5、6、8、9、10和11,均对IL1-β升高有显著抑制作用(P<0.01)。
4、小结
口炎清颗粒差异样品间化学成分差异明显,且通过考察TNF-α、IL-8、IL-6 和IL-1β4个药效学指标获得的差异样品间生物活性差异明显。
二、口炎清颗粒的组方配伍规律研究
1、方法
采用灰色关联分析对口炎清颗粒的组方配伍规律进行研究。首先对负向药效 指标参数进行正向化处理(取倒数);再对正向化的药效指标和差异样品中各药材 含量进行无量纲化处理(均值化)。见表2-1、2-2、2-3。
表2-1口炎清差异样品药效结果正向化处理
表2-2口炎清差异样品药效结果正向化后的均值化处理
表2-3口炎清颗粒差异样品浸膏的5味药材重量的均值化处理
2、结果
2.1差异样品药效分析
本实验中,各组细胞(空白对照组除外)均接受造模处理,所以为了分析Dex、 NP及口炎清1-11号差异样品的药物处理影响,将模型组的4个药效参数定义为 参考数列,给药组(Dex、NP及差异样品1-11组)定义为比较数列;并利用灰关 联分析方法计算两个数列间的相似度,相似度越低则药效越强,反之药效越差。 见表2-4、2-5。
表2-4灰关联分析中的参考数列与比较数列
注:a为参考数列,b为比较数列
表2-5给药组的灰关联分析结果
续表
由表2-5可知,各组药效作用由强到弱依次为S6>NP>S4>S11>Dex>S8>S1> S5>S10>S9>S7>S3>S2。
Dex和牛黄解毒片(NP)均具有抗炎作用,Dex可有效减少TNF-α、IL-1β、IL-6、 IL-8等促炎因子的释放,抑制炎症反应;NP可有效抑制二甲苯致小鼠耳肿胀等, 并可减少发热大鼠模型血清的IL-1β含量。Dex和NP的药效作用居前,与预期 结果基本吻合。
根据差异样品构建方案表(表1-1)可知,药效最强的6号样品与口炎清颗粒 的原配伍比例最为接近,且药效优于两个阳性药Dex和NP;1、4、5、8、11号 差异样品与原配伍比例较接近或其中一味药材较少,药效居中;2、3、7、9、10 号差异样品中其中两味药材含量较低,药效最差。因此,可推测口炎清中各味药 材均对药效有贡献,缺一不可,而且配伍比例越接近原配伍比例,药效越强,体 现了口炎清颗粒配伍比例的合理性。
2.2组方配伍规律探索
各差异样品中的山银花、玄参、麦冬、天冬、甘草5味药材含量具有差异, 从而导致药效的差异,故利用灰色关联分析方法计算11批差异样品中各味药材 的含量差异与每个药效指标的药效结果的关联度,而关联度越大,表明该药材对 药效贡献越大,见表2-6。
表2-6差异样品各味药材与药效指标的灰关联分析结果
TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β是参与炎症反应的重要介质,可促进炎性反应进 程,具体表现为:TNF-α可诱导IL-1、IL-6等细胞因子以及多种炎性介质的产生, 促进炎细胞向病变组织移行;IL-8有强烈的趋化作用,可激活和趋化中性粒细胞, 以及趋化淋巴细胞和嗜碱性粒细胞等;IL-6调节多种炎症细胞的增殖、分化及迁 移;IL-1β可促进白细胞迁移和黏附分子表达,引起炎症介质的释放等。从表2-6 可知,山银花与TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β4个药效指标间的关联度远远大于其 余4味药材,为发挥抗炎药效的主要贡献者,印证了其在配伍中的君药地位;玄 参、天冬、麦冬3味药材与IL-6和IL-1β指标关联密切,与调节多种炎症细胞的 增殖、分化及迁移,以及促进白细胞迁移和黏附分子表达、引起炎症介质的释放 相关;甘草与TNF-α指标关联密切,与诱导IL-1、IL-6等细胞因子及炎性介质 的产生、促进炎细胞向病变组织移行相关;玄参、天冬、麦冬、甘草4味药材通 过相互补充,作为处方中的臣药及佐使药,起到增强山银花抗炎药效的作用,如 图1所示。
综上所述,口炎清中君臣佐使5味药材相互辅佐,通过多靶点共同发挥良好 的抗炎药效。本发明基于口炎清颗粒原料药材与抗炎药效相关联,科学解读其组 方中各味药材的作用及地位,阐明了其组方配伍规律,为其他中药复方的组方规 律研究提供了范例。
由此,我们可以筛选样品6的配伍关系为最佳组方,也与原方一致。
机译: 单词关系数据库的构建方法和装置,使用单词关系数据库的单词/文档处理方法和装置,说明表达适当性验证方法,用于这些的程序,存储介质存储它们,单词相似性计算方法,单词组方法,单词组方法词概念层次方法
机译: 最优解关系显示装置和最优解关系显示方法
机译: 最优解关系显示装置,最优解关系显示方法和记录介质的程序