抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用。本发明所述抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CGMCC？No.11087。本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗GATA3蛋白单克隆抗体，且与GATA3蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了GATA3蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内GATA3蛋白表达水平，可应用于检测前列腺、膀胱、乳腺、皮肤、肾脏、大血管上皮以及淋巴细胞等相关肿瘤组织中GATA3的表达水平。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用。

背景技术

GATA3结合蛋白通常简称GATA3，是GATA家族中的多功能转录因子，与乳腺上皮、尿道上皮、表皮、皮肤附属器以及T细胞亚群的发育和功能密切相关，是乳腺和尿道移行细胞肿瘤敏感但不特异的标记物。GATA3阳性的上皮性肿瘤还包括基底细胞癌、皮肤鳞癌、皮肤附属器肿瘤、绒癌、内胚窦瘤、肾嫌色细胞癌、恶性间皮瘤、涎腺和胰腺导管腺癌，除此以外的大多数癌阳性表达<10％。由于GATA3很少表达于神经外胚层和间叶性肿瘤，除外嗜铬细胞瘤/副神经节瘤，因此有助于与神经内分泌肿瘤的鉴别诊断。

目前临床上主要通过免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤组织中GATA3蛋白的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合GATA3蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对GATA3蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与GATA3蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNo.11087。

本发明所述抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：

(1)重组表达载体的构建：根据GATA3ORF核苷酸序列(GATA3ORF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，1332bp；GATA3氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)；

设计引物PCR扩增GATA3ORF第465bp位到第1329bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pET23a-N-His(购于Origene公司)，构建GATA3的重组表达质粒pET-His-rGATA3；

(2)GATA3重组蛋白的表达与纯化：将GATA3重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解离心获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的GATA3重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的GATA3重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗GATA3特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得抗GATA3单克隆抗体。分别通过WesternBlot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

同时，采用OriGene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明，本发明所述单克隆抗体仅和GATA3蛋白特异性结合，而与近10000种其他蛋白无交叉反应。

经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗GATA3单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为OTI5C11，亚型鉴定为IgG2b，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11087。

同时，本发明还提供一种抗GATA3蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNo.11087的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗GATA3蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如用杂交瘤细胞株诱导小鼠腹水。

本发明所述保藏编号为CGMCCNo.11087的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体为IgG2b型，效价较高。将所述单克隆抗体于成人肾癌、膀胱癌组织中可见到特异性细胞核染色。结果与GATA3在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体可用于免疫组织化学检测GATA3蛋白的水平。

因此，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNo.11087的杂交瘤细胞在制备抗GATA3蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗GATA3蛋白单克隆抗体在制备检测GATA3蛋白的免疫检测产品中的应用。

作为优选，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。

本发明还提供一种检测GATA3蛋白的免疫组化检测试剂盒，包括保藏编号为CGMCCNo.11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体。所述免疫检测试剂盒可检测组织细胞中GATA3蛋白的表达状况。

此外，本发明还提供保藏编号为CGMCCNo.11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。

本发明所述肿瘤细胞具体是指肿瘤细胞的增殖与GATA3的表达密切相关的所有肿瘤。作为优选，所述肿瘤细胞包括以下组织细胞的肿瘤：

乳腺、前列腺、膀胱、皮肤、肾脏、大血管上皮、淋巴细胞。

本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗GATA3蛋白单克隆抗体，且与GATA3蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了GATA3蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内GATA3蛋白表达水平，可应用于检测前列腺、膀胱、肾脏、乳腺、皮肤、大血管上皮以及淋巴细胞等相关肿瘤组织中GATA3的表达水平。

生物保藏信息说明

OTI5C11，分类命名为GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11087。

附图说明

图1所示为实施例1中克隆位点图；

图2所示为实施例2重组GATA3蛋白Westernblot检测结果图，以anti-His检测重组GATA3蛋白在E.Coli细胞中的表达，其中泳道1为转染空载体的E.Coli细胞裂解液为抗原的检测结果、泳道2为转染pET-His-rGATA3质粒的E.Coli细胞裂解液抗原的检测结果；

图3所示为实施例2重组GATA3蛋白SDS-PAGE结果图，用镍亲和层析柱纯化重组GATA3蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；

图4所示为实施例3以杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的单克隆抗体识别293T细胞过表达的GATA3全长蛋白以及肿瘤细胞系MCF7内源GATA3蛋白的Westernblot检测结果图；

图5所示为实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人前列腺组织免疫组化结果图(一抗为杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体)，图中箭头所指为特异性细胞核染色；

图6所示为实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肾癌组织免疫组化结果图(一抗为杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体)，图中箭头所指为特异性细胞核染色；

图7所示为实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人膀胱癌组织免疫组化结果图(一抗为杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体)，图中箭头所指为特异性细胞核染色；

图8所示实施例5origene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体，1:100；二抗为DyLight649-conjugatedAffiniPureFragmentGoat-anti-MouseIgG，1:400)。

具体实施方式：

本发明公开了抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面就本发明提供的抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用做进一步说明。

实施例1：GATA3重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司购得的质粒RC201618(含GATA3ORF1332bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆ORF第465bp至1329bp到表达载体pET23a-N-His，建立GATA3重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2：GATA3重组蛋白的表达与纯化

1、转化E.coli细胞：将100ul感受态细胞置于冰上融化后加入质粒DNA轻混匀，冰浴30min后42℃热激90s，然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入500ul新鲜无抗LB培养基，于37℃摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

2、裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37℃、200rpm培养至OD值达到0.4～0.6时加入IPTG(终浓度1mM)诱导培养7h。离心收集菌体，然后用裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎20min后于4℃下12000rpm离心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-His抗体做WB鉴定，见图2。

3、镍柱亲和层析柱纯化：用缓冲液平衡镍柱，将上清用0.45μm滤膜过滤后上样并收集流出，用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白，最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，分别收集后进行SDS-PAGE鉴定，将符合要求的洗脱蛋白合并并加入10％甘油，纯化后的重组GATA3蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图3。

由图2结果可见，转染pET-N-His-rGATA3质粒的E.coli细胞裂解液中WB检测后在26kD处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明细胞中重组GATA3蛋白特异表达。

由图3结果可见，纯化的蛋白在PAGE胶26kD处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明已获得了纯度较好的GATA3重组蛋白。

实施例3：抗GATA3单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的GATA3蛋白片段用于对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的GATA3抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用GATA3纯化重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为OTI5C11。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1mL注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株OTI5C11产生的单抗亚型为IgG2b，采用proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、WB检测特异性、分装、冻存在-20℃。其中WB检测特异性结果见图4。

由图4结果可见，OTI5C11分泌产生的单抗可特异地识别293T细胞过表达的全长GATA3以及MCF7细胞中内源的GATA3蛋白，表明所述单克隆抗体能特异地Westernblot检测完整的GATA3蛋白。

实施例4：OTI5C11分泌的单克隆抗体为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、取福尔马林固定的成人前列腺、肾癌、膀胱癌等组织块进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(1mMEDTA,10mMTrisbuffer(pH8.5))高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入抗GATA3单抗(OTI5C11分泌产生)，稀释比：1:200，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加Polink-试剂盒2(CatlogNo.D37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Polink-2试剂盒(CatlogNo.D37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。

8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图5-7。

(2)、实验结果：

由图5-7结果可见，在成人前列腺、肾癌、膀胱癌组织中可见到特异性细胞核染色，图中箭头所指。结果与GATA3在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明本发明所述杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的单克隆抗体可用于免疫组织化学检测GATA3蛋白的水平。

实施例5：OTI5C11分泌产生的单克隆抗体的特异性蛋白芯片检测

OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGeneCatPA100001)芯片进行OTI5C11抗体鉴定实验的实验方法：

1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50mL离心管中加入40mL5％脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗OTI5C11，稀释比列为1:100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mLPBST(0.1％Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗DyLight649-conjugatedAffiniPureFragmentGoat-anti-MouseIgG，稀释比例为1:400。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accessionnumber)，蛋白ID，蛋白大小等信息。

结果如图8所示，单抗OTI5C11在OriGene蛋白芯片上能特异地识别GATA3蛋白，而与其他近10000种蛋白无交叉反应，表明单抗OTI5C11的特异性较好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。