一种拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其flaA基因表达的罗伊氏乳杆菌

摘要

本发明公开了一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus？reuteri)，该菌株能拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其flaA基因的表达，具有较好的耐酸、耐胆盐特性，能在体外抑制空肠弯曲杆菌生长，且对肠道上皮细胞具有较好的粘附能力，该罗伊氏乳杆菌发酵上清在体外与对照组相比使空肠弯曲杆菌flaA基因的表达量下调了11.1倍，能有限抑制空肠弯曲杆菌鞭毛的合成；该罗伊氏乳杆菌发酵上清在细胞模型中与对照组相比使空肠弯曲杆菌flaA基因的表达量下调了1.4倍。所述罗伊氏乳杆菌可用于制备预防及治疗空肠弯曲杆菌引起的疾病，可参与制成发酵乳制品等，有广泛地应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其flaA基因表达的罗伊氏乳杆菌，属于微生物 技术领域。

背景技术

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)是革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界，可通过 动物、食物、水、牛奶等传播，能定植于各种野生动物和家禽、家畜的肠道内，接触禽畜类， 食入未煮熟或受污染的鸡肉、牛肉、未彻底杀菌的牛奶以及污染的水都可以引起人类感染。 近些年来，空肠弯曲杆菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势。在一些发达国家，空肠弯曲杆 菌感染引起的腹泻病例数甚至超过了沙门氏菌和志贺氏菌，成为最常见的腹泻致病菌；在发 展中国家，空肠弯曲杆菌是婴幼儿感染性腹泻最常见的病原菌。人感染空肠弯曲杆菌后，最 常见的会引起肠胃炎、腹泻、发烧以及腹部绞痛；免疫力低下者会进一步引起一系列的并发 症，例如胆囊炎、腹膜炎、脑膜炎、败血症和骨髓炎等；空肠弯曲杆菌引起的最严重的并发 症是格林-巴利综合征，即GBS，它会引起轴突的损伤及不可逆的神经伤害，会导致呼吸肌麻 痹而死亡。

C.jejuni在宿主体内通过鉴别环境因素，调节表达或抑制自身的某些特异性基因来适应寄 主体内高度竞争的肠道环境。只有这样才能存活、生长，最终施行其致病性，并大量繁殖。 C.jejuni侵袭的第一步即黏附与定植，而这与其毒力因子flaA的表达密不可分，且flaA的表 达还与C.jejuni侵入靶细胞有着密切的联系，若C.jejuni毒力因子flaA的表达受到抑制，其致 病性将大大减弱。QuocV.Tu等2008年的研究发现C.jejuni利用MUC2作为环境诱因能抑制 其flaA基因的表达；A.Mundi等2013年研究发现具有抑制C.jejuni活性的Lactobacillus acidophilusStrainLa-5的发酵后的无细胞提取物在体外能抑制flaA基因的表达。但目前没有 关于调控空肠弯曲杆菌flaA基因表达的研究大多在体外水平上且抑制其flaA基因表达倍数很 低，对于细胞模型中乳酸菌对空肠弯曲杆菌flaA基因表达的调控作用尚不清楚，也没有在体 内验证其拮抗空肠弯曲杆菌的功能。

目前临床治疗C.jejuni感染的常用药物为抗生素，但抗生素的使用会带来机体及C.jejuni 对抗生素的耐药性，过度使用还会导致体内药物的残留。

乳酸菌是机体先天性免疫系统的重要成员，是机体维持免疫稳态不可缺少的部分。能维持 肠道健康，从而达到促进生长、防治疾病的目的，其使用价值日益受到重视。目前利用乳酸 菌干预并治疗消化道细菌感染已经成为国内外食品科学与生物医药研究的一个重要领域，研 究表明乳酸菌能在体内外有效干预C.jejuni感染。乳酸菌干预C.jejuni感染的机理主要包括产 生抗菌物质抑制C.jejuni的生长；黏附性高的乳酸菌可以通过空间位阻效应或者产生抑制物 质来抑制C.jejuni对宿主细胞的黏附；乳酸菌对肠道形态的完整性具有显著的保护作用，可 以减轻C.jejuni对肠道上皮细胞的感染症状；乳酸菌还可以向细胞外分泌一些具有免疫调节 活性的物质，如胞外多糖和其它分泌蛋白，这些成分参与免疫调节或直接引起免疫应答，因 而构成了乳酸菌发挥益生功效的物质基础，在细菌定植、免疫激活、预防癌变等方面发挥作 用。

目前，一些公开专利文献涉及空肠弯曲杆菌的拮抗及其用途，例如CN104870472A公开 了一种特异于空肠弯曲杆菌的抗体及其片段；CN102497875A公开了一种用于降低空肠弯曲 杆菌定植的抗原；CN103381220A公开了一种可以治疗鸡空肠弯曲杆菌的药物；但是，目前 涉及乳酸菌拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其毒力基因表达的专利申请文献并不 多，CN102533618A公开了一种具有体外抑制空肠弯曲杆菌能力的植物乳杆菌，但该专利并 没有涉及空肠弯曲杆菌的flaA基因的表达情况及在细胞模型及体内拮抗空肠弯曲杆菌中的功 效。

因此，筛选出一株拮抗空肠弯曲杆菌的乳酸菌，证明它在体外及细胞模型中能有效抑制 空肠弯曲杆菌flaA基因的表达，且在动物模型中具有良好的缓解空肠弯曲杆菌感染的作用， 并研究该乳酸菌实际用途就显得非常必要了。

本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量实验研究,终于完成了本发明。

发明内容

本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，该菌株已于2015年9月24日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11447。

所述罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447具有下述生物学特性：

(1)菌体特征：革兰氏阳性，细长杆状，微弯成链出现，无鞭毛，无芽孢；

(2)菌落特征：菌落乳白色，边缘不整齐，片状，中央凸起，表面湿润光滑；

(3)生长特征：该菌株的最低生长温度为15℃，最高生长温度为40℃，在温度30-37℃ 下生长最佳，最适生长PH为6.5，培养18h后进入稳定期；

(4)具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.0环境下存活良好；

(5)具有胆盐耐受性，在胆盐浓度为0.1％一0.4％的范围内菌株生长良好；

(6)体外抑制空肠弯曲杆菌生长；

(7)对肠道上皮细胞具有较好的粘附能力；

(8)罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447发酵上清在体外能显著抑制空肠弯曲杆菌flaA毒 力因子的表达；

(9)罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447发酵上清在体外能影响空肠弯曲杆菌鞭毛的合成；

(10)罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447发酵上清在细胞模型中能显著抑制空肠弯曲杆菌 flaA毒力因子的表达。

本发明所述的罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447可用于制备抑制空肠弯曲杆菌的药物组 合物或保健功能食品。所述药物组合物是由罗伊氏乳杆菌菌剂CGMCCNo.11447与在药 学上可接受的载体组成的。所述在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使 用的粘合剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂。所述的药物组合物是胶囊剂、 颗粒剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

所述罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447可用于制备发酵食品。所述的发酵食品是使用含 有罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447菌种的发酵剂生产的乳制品、果蔬制品及、豆制品。所 述的乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪；所述的果蔬制品是黄瓜、甜菜、芹菜、胡萝卜或圆 白菜制品；所述的豆制品是酱油、酸豆奶、豆豉或豆酱。

本发明还提供一种制备罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447菌剂的方法，是将含有所述罗 伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447生物菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其它工艺制备所得 到的粉剂，它含有大于10⁶CFU/g的活性罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的发酵剂是采用下述方法制备得到的：

A、培养基的制备：以该培养基总重量计10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5胰蛋白陈、 0.3％酵母浸膏和余量水，调整所制备培养基的pH到6.8。

B、保护剂:100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/ LL-谷氨酸钠的保护剂。

C.罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447菌种按照以所述培养基的质量计2％的接种量接种到 在温度110-120℃下灭菌8-12min后的培养基中，然后在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷 酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬使菌浓达到10¹⁰CFU/ml；接着，让该悬浮液在 温度37℃下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵菌剂。

本发明所述的罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447具有耐酸、耐胆盐特性，对肠道上皮细胞 具有良好的黏附特性，能有效抑制空肠弯曲杆菌的生长，能在体外及细胞模型中有效抑制空 肠弯曲杆菌flaA毒力因子的表达。所述的罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447用于治疗及预防空 肠弯曲杆菌感染，具有非常广泛地应用前景。

生物材料保藏

一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，于2015年09月24日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11447。

附图说明

图1是罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447在HT-29细胞上的粘附状况。

图2是罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447发酵上清在体外对空肠弯曲杆菌flaA毒力因子表达 的影响。

图3是罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447发酵上清在体外对空肠弯曲杆菌鞭毛合成的影响。

图4是罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447发酵上清在细胞模型中对空肠弯曲杆菌flaA毒力因 子表达的影响。

具体实施方式

实施例1从鸡粪中筛选乳酸菌

样品取自于江苏省无锡市滨湖区贡湖大道新鲜的农家鸡粪，保存于30％甘油中。吸取1ml 鸡粪悬液加入到含有9ml灭菌生理盐水的试管中，振荡均匀，梯度稀释后采用涂布平板法， 将这些稀释菌液涂布在添加了酸碱指示剂嗅甲酚紫的MRS培养基(青岛海博生物技术有限公 司产品)平板上，分别在温度37℃下进行普通培养和厌氧培养48h，观察菌落生长情况，挑取 能使培养基中嗅甲酚紫变黄的典型单菌落，并对单菌落进行革兰氏染色，挑取革兰氏阳性菌 作为初步目的菌株，然后转接至MRS平板划线分离纯化，直至得到纯乳酸菌株，作为实验菌 株并在温度-20℃下保存。本发明获得的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，于2015年9 月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11447。

实施例2采用牛津杯法筛选能够抑制空肠弯曲杆菌生长的乳酸菌

乳酸菌发酵上清液的制备：将分离纯化得到的乳酸菌按照以MRS液体培养基体积计2％ 接种于MRS液体培养基中，于37℃下培养18h，按照同样的方式连续培养三代，然后将乳酸 菌菌悬液在8000r/min、4℃条件下离心8min，吸取上清液，使用0.22μm水系滤膜进行过滤 除菌，得到乳酸菌发酵上清液。

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)NCTClll68菌株(购自美国典型培养物保 藏中心ATCC)在两项培养基上(即布氏琼脂(青岛海博生物技术有限公司产品)与脑心浸液肉 汤培养基(Oxoid公司培养基))在温度37℃与以体积计5％O₂、10％CO₂和85％N₂的环境下培 养48h，按照同样的方式传代培养三代后，在2800r/min条件下离心6min，使用磷酸盐缓冲 液(PBS，pH为7.2)洗涤后，调整该菌浓度至10⁸CFU/mL。

吸取C.jejuni(编号NCTC11168)菌悬液(250μL，10⁸CFU/mL)均匀涂布于哥伦比亚血 琼脂平板(Oxoid公司培养基)中，待菌液自然干燥后，放置牛津杯，在牛津杯中加入100μL乳 酸菌发酵上清。于4℃扩散2h后放入三气培养箱中(5％O₂、10％CO₂和85％N₂)，经37℃培 养48h后测量抑菌圈的直径。以pH为3.8的MRS作为阴性对照，0.28mg/ml诺氟沙星广谱 抗生素为阳性对照，检测抑菌圈直径(mm)

表1：抑菌圈直径的测量结果

表1表明乳酸菌CGMCCNO.11447发酵上清液显著抑制了空肠弯曲杆菌的生长。

实施例3罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447对人工肠液及人工胃液的耐受性实验

人工胃液：称取3g胃蛋白酶(1：10000，Sigma，USA)溶解于1L生理盐水(0.5％， w/v)中、调整pH为2.0，将该溶液过0.45/0.22μm无菌双层微孔滤膜，无菌保存备用。

人工肠液：称取1g胰蛋白酶(P-1500，Sigma，USA)和0.3g牛胆盐，溶解于1L生理盐 水(0.5％，w/v)中、调整pH为8.0，将该溶液过0.45/0.22μm无菌双层微孔滤膜，无菌保存 备用。

PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)：磷酸二氢钾0.27g，氯化钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠 2.85g，NaCl8.5g，蒸馏水1L，pH调节至7.2，过0.45/0.22μm无菌双层微孔滤膜，121℃， 20min灭菌，保存于4℃冰箱。

(1)人工模拟胃液耐受性实验

选取乳酸菌数量级为10⁹CFU/mL的PBS溶液进行本实验，离心(5000r/min，10min， 4℃)，加入等体积的模拟人工胃液，设置空白对照组，对照组直接使用10⁹CFU/mL的PBS 菌体溶液，水浴(37℃)中培养两个小时，完成后采用梯度稀释法进行平板菌落计数，中间 需要注意的是平均每隔三十分钟摇晃1次。

(2)人工模拟肠液耐受性实验

选取乳酸菌数量级为10⁹CFU/mL的PBS溶液进行本实验，离心(5000r/min，10min， 4℃)，加入等体积的模拟人工肠液，设置空白对照组，对照组直接使用10⁹CFU/mL的PBS 菌体溶液，水浴(37℃)中培养两个小时，注意每隔三十分钟均摇1次，结束后使用梯度稀 释法进行平板菌落计数。

表2：罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447对人工胃液及人工肠液的耐受性实验

右表2可知，罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447对人工胃液及人工肠液有很好的耐受性。

实施例4罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447对肠道上皮细胞HT-29的粘附能力

使用RPMI1640培养液(Gibco公司)(添加10％胎牛血清和1％青链霉素)培养肠上皮细胞 株HT-29细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。HT-29细胞在培养箱里于 5％C0₂气氛与温度37℃的条件下进行培养，每培养48h就更换培养液1次，连续培养。

将生长融合至70％-80％的HT-29细胞进行消化，调整浓度至2×10⁵个/mL，将无菌盖玻 片放置在6孔细胞培养板中，每孔加入2mL细胞培养悬液，于5％CO2培养箱中37℃培养， 待细胞长至单层时，用PBS清洗三次，每孔加入1mL乳酸菌菌悬液(1×10⁸CFU/mL)，补加 RPMI-1640细胞培养液(不含血清及抗生素)至2mL，孵育2h。孵育结束后，用PBS清洗 三次，以除去未粘附的乳酸菌，然后用甲醇固定20min，PBS清洗三次后进行革兰氏染色， 于100倍油镜下镜检。随机选取20个视野计算每100个细胞所粘附的细菌数，作为粘附指数。 粘附实验结果列于表3，罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447在HT-29细胞上的粘附状况见附图 1。

表3罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447在HT-29细胞上的粘附情况

由表3可知：罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447对肠道上皮细胞HT-29有较强的黏附能力， 而能够粘附在肠道上皮细胞上是其进一步发挥作用的前提，具有较强粘附能力的罗伊氏乳杆 菌CGMCCNO.11447在肠道定植后，可以有效地防止病原微生物接触和粘附肠粘膜细胞，从 而可以预防肠道致病菌引起肠道疾病。

实施例5罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447在体外对空肠弯曲杆菌flaA毒力因子表达的影响

将C.jejuni置于两项培养基(布氏琼脂+9ml脑心浸液肉汤液体培养基)上培养36h，于无 菌条件下加入1ml罗伊氏乳杆菌发酵上清，对照组加入1mlMRS液体培养基，摇匀后置于三 气培养箱中(5％O₂、10％CO₂和85％N₂)培养4h，在4℃下2800r/min离心6min收集菌体， 提取菌体总RNA，用试剂盒(Takara公司)逆转录成cDNA，后进行荧光定量PCR，并选用 rpoD作为内参基因。进行荧光定量PCR，荧光定量PCR所用引物序列如表4所示。

表4：荧光定量PCR的寡核昔酸序列

荧光定量PCR反应条件：(1)95℃，for30s；(2)95℃，5s，60℃，30s，40个 循环；以2^-ΔΔCt法计算罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447发酵上清在体外对空肠弯曲杆菌flaA 毒力因子表达的影响。实验结果见附图2

由附图2可知：罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447发酵上清在体外能有效抑制空肠弯曲杆菌 flaA毒力因子表达，而C.jejuni侵袭的第一步即黏附与定植，这与flaA基因的表达密切相关， flaA基因表达受到抑制，C.jejuni的存活、生长、繁殖及致病性均会受到影响。

实施例6罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447在体外对空肠弯曲杆菌鞭毛合成的影响

将C.jejuni置于两项培养基(布氏琼脂+9ml脑心浸液肉汤液体培养基)上培养36h(对 数期)，于无菌条件下加入1ml罗伊氏乳杆菌发酵上清，对照组加入1mlMRS液体培养基， 摇匀后置于三气培养箱中(5％O₂、10％CO₂和85％N₂)培养4h，在4℃下2800r/min离心6min 收集菌体。

弃上清，加入PBS溶液洗涤去除培养基，在4℃下2800r/min离心6min收集菌体；于2.5％ 戊二醛中固定4h，用PBS溶液洗涤三次；4℃下2800r/min离心6min收集菌体，分别用10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、85％、90％、100％的乙醇梯度脱水，离心条件均为4℃、 2800r/min离心6min；用乙酸异戊酯置换乙醇两次；将样品在-80℃预冻12h后冷冻干燥；扫 描电镜(日本日立，S-4700冷场发射)观察空肠弯曲杆菌鞭毛。

由附图3可知，罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447发酵上清处理C.jejuni后，C.jejuni的鞭 毛数量及长度远小于未处理组，这说明罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447发酵上清对C.jejuni 的鞭毛的合成确有抑制作用。

实施例7罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447在细胞模型中对空肠弯曲杆菌flaA毒力因子表达 的影响

将生长融合至70％-80％的HT-29细胞进行消化，调整浓度至2×10⁵个/mL，将无菌盖玻 片放置在6孔细胞培养板中，每孔加入2mL细胞培养悬液，于5％CO2培养箱中37℃培养， 待细胞长至单层时，用PBS清洗三次，每孔加入0.5mL对数期C.jejuni(2×10⁸CFU/mL)、0.5mL 乳酸菌发酵上清，对照组加入0.5mlMRS液体培养基，补加RPMI-1640细胞培养液(不含血 清及抗生素)至2mL，孵育4h。孵育结束后，倒掉上清，提取RNA。余下步骤同体外实验 相同。实验结果见附图4

由附图4可知：罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447发酵上清在细胞模型中能有效抑制空肠 弯曲杆菌flaA毒力因子表达。

实施例8罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447对感染空肠弯曲杆菌小鼠体重的影响

取2周龄雌性BLAB/c小鼠(SPE级)30只，随机分为三组，每组10只：空白对照组，空 肠弯曲杆菌阴性对照组，罗伊氏乳杆菌和空肠弯曲杆菌干预组。具体分组情况如表5所示， 按表5所示的情况给小鼠灌胃，每天一次，每次灌胃200ul，连续灌胃4周。

表5：小鼠分组情况

称量并计算小鼠体重的变化，试验结果列于表6中。这些结果表明，喂食1.0×10⁹CFU/mL 的罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447能显著缓解由于感染空肠弯曲杆菌引起的腹泻导致的小 鼠体重的减小。

表6：罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447对感染空肠弯曲杆菌小鼠体重的影响

注：*表示空白对照组及罗伊氏乳杆菌干预组与空肠弯曲杆菌组差距显著P<0.05

实施例9利用本发明罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447制造含该菌的发酵牛乳

将原料乳脱脂奶50g溶于300ml水中，95℃热杀菌20min；45g白砂糖溶于300ml水中， 100℃20min；然后冷却至室温，将糖水和煮过的牛奶混匀，加入罗伊氏乳杆菌CGMCC NO.11447菌粉，使其浓度达到10⁶CFU/ml以上，在37℃下放置4h，至于4℃冷藏，于是得 到含本发明罗伊氏乳杆菌活菌的发酵牛乳。

实施例10利用本发明罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447制造含该菌的发酵胡萝卜

选用新鲜的胡萝卜洗净晾干后切条，装入坛中，按照胡萝卜与本发明的罗伊氏乳杆菌 CGMCCNO.11447发酵剂的重量比100:0.05，将罗伊氏乳杆菌CGMCCNO.11447发酵剂加入 胡萝卜中，再按胡萝卜与食盐水重量比1:30加入浓度为5％(重量百分比)的食盐水，并加入适 量的调味料，用竹条压住胡萝卜避免上浮，密封，于温度30℃下发酵10天，得到含罗伊氏 乳杆菌CGMCCNO.11447的腌制胡萝卜制品。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术 的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围 应该以权利要求书所界定的为准。