抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件、检测方法及其应用

摘要

本发明公开了一种抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件，包括一串连续的尿嘧啶(EPU)，并构建重组载体，转入野生型植株中，得到稳定遗传的转基因株系，进而检测其功能元件，EBF1/EBF2基因中EPU序列的过表达或缺失介导着mRNA的翻译抑制或表达，在植物中过表达EPU后可产生于过表达EBF1/EBF2基因编码序列相同的生物学效应，为进一步研究调控植物生长发育奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件、检测方法及其应用。

背景技术

植物激素乙烯信号转导中两个关键的转录因子EIN3/EIL1在蛋白水平上受到由两个F-Box类蛋白EBF1/EBF2所介导的泛素化降解调控。中国专利ZL201110110101.0公开了有乙烯时EBF1/2mRNA的3’UTR能够抑制其自身mRNA的翻译，从而使EBF1/2蛋白合成减少。

EBF1,EBF2基因成熟mRNA的3’UTR分别为643nt和590nt，在这么长的3’UTR中，是什么元件介导mRNA翻译抑制尚不清楚。

发明内容

本发明目的是提供抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件、检测方法及其应用。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：一种抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件，包括一串连续的尿嘧啶(EPU)。

优选地，所述尿嘧啶在RNA茎环结构的环上。

优选地，所述尿嘧啶序列长度为6-10nt，包括核心序列和在核心系列两侧或一侧的其他类型碱基。

优选地，其中核心序列为长度5-8nt的连续尿嘧啶。

一种抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件的检测方法，包括如下步骤：

(1)构建重组载体，EBF1和EBF2的3’UTR按长度分段，分别插入pEGAD载体中GFP的编码区之后；

(2)两组重组载体分别转入野生型拟南芥Col-0中，得到稳定遗传的转基因株系；

(3)对步骤(2)所得转基因株系进行乙烯处理；

(4)检测荧光强度。

抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件在3’UTR过表达植株表现出乙烯不敏感表型中的应用。

抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件在增强内源EBF1/EBF2mRNA翻译过程中的应用。

本发明首次公开了抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件为EPU序列，并构建重组载体，转入野生型植株中，得到稳定遗传的转基因株系，进而检测其功能元件，EBF1/EBF2基因中EPU序列的过表达或缺失介导着mRNA的翻译抑制或表达，在植物中过表达EPU后可产生于过表达EBF1/EBF2基因编码序列相同的生物学效应，为进一步研究调控植物生长发育奠定基础。

附图说明

图1为pEGAD载体；

图2为具有翻译抑制功能的片段共有的序列EPU的示意图；

图3为EBF13’UTR的7个EPU序列位于茎环结构的环上的示意图；

图4为去掉7个EPU之后的EBF13’UTR二级结构的示意图；

图5为EPU介导3’UTR的翻译抑制作用的检测结果；

图6为EBF23’UTR的5个EPU介导EBF2mRNA的翻译抑制作用的检测结果；

图7为EPU缺失后的EBF1/2mRNA的翻译不受抑制的检测结果；

图8为EPU对3’UTR过表达植株产生乙烯不敏感表型的检测结果；

图9为过表达EPU增强内源EBF1/2mRNA的翻译的检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步阐述。

实施例1

本实施例提供一种抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件。通过将EBF1和EBF2的3’UTR按长度分别分为5段，插入到图1所示的pEGAD载体中GFP的编码区的终止密码子后面，将不同的重组载体分别转入野生型拟南芥Col-0中，得到稳定遗传的转基因株系，继而进行乙烯处理，处理后分别观察GFP荧光强度；两组中均有片段可以使GFP荧光变弱，由此说明EBF1和EBF2的3’UTR均表现出对mRNA的翻译抑制作用。进而对这两组片段中具有翻译抑制功能的片段进行序列分析，用MEME网站http://meme-suite.org/tools/meme进行多序列比对，预测这些序列中共有的元件，发现这些有翻译抑制功能的核心序列为长度5-8nt的连续尿嘧啶，进一步确定核心序列长度为7-8nt的连续尿嘧啶，并确定序列为在此核心序列两侧或一侧添加其他类型碱基至长度为6-10nt。将这些有翻译抑制功能的连续尿嘧啶(U)片段，命名为EthyleneResponsiveRNAelementscontainingPoly-Uridylates(EPU)，其序列如图2所示。如图3所示，用RNAfold网站(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)对EPU进行二级结构分析，结果显示这些尿嘧啶都在RNA茎环结构的环上，在EBF1mRNA3’UTR中，共有7个位于环上的EPU。如图4所示，当将EBF1mRNA3’UTR中的7个EPU都去掉之后，整体二级结构并没有明显变化。

实施例2

本实施例提供EPU在介导EBF13’UTR的翻译抑制作用中的应用，将去掉7个EPU之后的EBF13’UTR(图4所示)插入pEGAD载体(图1所示)中，转入野生型拟南芥Col-0中。如图5A所示，检测生长在含有10μM乙烯合成前体ACC的MS板上的各株系中GFP荧光强度，去掉EPU的转基因株系中GFP荧光强度与过表达GFP的荧光强度几乎相同，显著强于中国专利ZL201110110101.0中公开的G1U(35S::GFP-EBF1U/Col-0)过表达的植株中GFP荧光强度。由此说明，EPU是3’UTR介导翻译抑制所必需。如图5B所示，进一步设计包含EPU的茎环结构，两端用完全配对的碱基序列保证EPU位于环上，每个环上有两串EPU，做成3个重复形式即6xEPU，进而过表达在野生型拟南芥Col-0中。如图5C所示，检测各株系中GFP荧光强度，在10μMACC板上，过表达6xEPU的转基因植株中GFP荧光很弱，与G1U(35S::GFP-EBF1U/Col-0)过表达的植株中GFP荧光强度差不多，由此说明EPU是介导EBF13’UTR翻译抑制的充分必要条件。

实施例3

本实施例提供EPU在介导EBF23’UTR的翻译抑制作用中的应用。如图6A所示，与EBF13’UTR类似，在EBF23’UTR中，鉴定到了5个EPU。如图6B所示，将5个EPU都去掉后并不影响EBF2mRNA3’UTR整体二级结构；如图6C所示，去掉5个EPU之后，转基因植株中的GFP荧光强度显著增强。由此说明，去掉EPU后EBF2mRNA的翻译不受抑制，即EPU是介导EBF23’UTR翻译抑制的充分必要条件。

上述实验结果表明，EBF1和EBF2的mRNA3’UTR上的EPU作为一个顺式作用元件能抑制由mRNA到蛋白的翻译过程。

实施例4

本实施例提供抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件在3’UTR过表达植株表现出乙烯不敏感表型中的应用。经典的乙烯反应就是人们所熟知的三重反应，具体表现为当对植株施加乙烯时黄化苗呈现出下胚轴变短、变粗，根变短，顶端弯钩加剧。本实施例构建了内源启动子启动的带GFP标签的编码区加全长3’UTR(pEBF1::G1F)重组载体和编码区去掉7个EPU的3’UTR(pEBF1::G1F△7U)重组载体，分别转入拟南芥ebf1突变体中。观察在含有10μMACC(一种乙烯生物合成的前体)的培养基上生长3天的黄化苗的表型，如图7A所示，pEF1::G1F/ebf1恢复了ebf1突变体的乙烯超敏感表型，而pEBF1::G1F△7U/ebf1则几乎完全乙烯不敏感。本实施例中转基因植株由内源启动子启动且转入ebf1突变体中，相当于将内源EBF1基因3’UTR上的7个EPU去掉，此时没有EPU的3’UTR不再抑制EBF1mRNA的翻译过程，EBF1蛋白合成增多，降解EIN3蛋白，导致乙烯不敏感表型。同时，检测这些转基因植物中EBF1基因的表达，如图7B所示，可以看出这些转基因植物中EBF1的表达量与野生型拟南芥Col-0基本一致。如图7C所示，通过westernblot实验对内源EIN3抗体检测，结果表明即使加了ACC，pEBF1::G1F△7U1/ebf1中也几乎检测不到内源EIN3蛋白，这与其乙烯不敏感表型一致。由此可知，EBF13’UTR上的EPU缺失则EBF1mRNA的翻译不再受抑制，转基因植株表现出乙烯不敏感表型；带有EPU则EBF1mRNA的翻译受抑制，转基因植株表现出正常的乙烯反应。

如图8A和8B所示，当EBF13’UTR中的7个EPU去掉，EBF23’UTR的5个EPU都去掉之后，过表达植株则不再有乙烯不敏感表型；如图8C所示，过表达重复形式的EPU，则有与全长3’UTR过表达相似的乙烯不敏感表型。上述实验结果说明，EPU是3’UTR过表达植株表现出乙烯不敏感表型的充分必要条件。

实施例5

本实施例提供抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件在增强内源EBF1/EBF2mRNA翻译过程中的应用。如图9A和9B所示，polysomeprofiling实验中，在6xEPU过表达的植株中，与polysome结合的EBF1/2mRNA(即处于翻译状态的EBF1/2mRNA)显著增加，即过表达EPU增强了内源EBF1/2mRNA的翻译。而EIN3及看家基因β-ATP的翻译则不受过表达的6xEPU影响，说明过表达的EPU特异调控EBF1/2mRNA的翻译过程。本实施例中polysomeprofili实验操作使用ARTseq^TMRibosomeProfilingKit并依据其说明书进行，只是不进行酶切建库而直接进入超速离心和吸光度测定；之后的RNA提取使用QIAGENRNeasyPlantMiniKit，反转录使用PrimeScript1^stStandcDNASynthesisKit。

以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。