一种选择性分离苯丙氨酸生物转化液中肉桂酸及循环利用转化液的方法

摘要

本发明公开了一种选择性分离苯丙氨酸生物转化液中肉桂酸及循环利用转化液的方法，苯丙氨酸生物转化液经固液分离分别得到清液I与细胞菌体；将清液I用酸调节pH值至4.5，在室温下搅拌处理至白色沉淀析出；上述混合体系经固液分离得到清液II与沉淀，沉淀经洗涤、冷冻干燥得到肉桂酸样品；清液II用碱调节pH值至生物转化所需pH，再与前述细胞菌体混合，继续进行生物转化制备肉桂酸。采用本发明方法，可以降低底物抑制作用并使转化液和细胞可循环利用的方法，产率最高可达95％，产品纯度可达98％以上。该方法不仅过程简易，可大大降低提取成本，还可实现得静息细胞和转化液多次循环利用。

说明书

技术领域

本发明属于生物分离技术领域，涉及一种在生物转化制备肉桂酸过程中将产物分离 并将转化液重复利用的方法。

背景技术

肉桂酸，又名β-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸。是从肉桂皮或安息香分离出的有机酸。 植物中由苯丙氨酸脱氨降解产生的苯丙烯酸。

肉桂酸的主要用途：a、在香精香料中的应用：肉桂酸本身就是一种香料，具有很 好的保香作用，通常作为配香原料，可使主香料的香气更加清香挥发，可作为苹果香精、 樱桃香精、水果香精、花香香精调和使用；可作为芳香混合物用于香皂、香波、洗衣粉、 日用化妆品中；b、在医药中的作用：肉桂酸可用于合成氯苯氨丁酸和肉桂苯哌嗪，前 者为脊椎骨髅松弛剂和镇定剂，后者用于脑血栓，脑动脉硬化，冠状动脉硬化等病；还 可用于合成治疗冠心病的重要药物乳酸可心定和心痛平；c、在食品添加剂的应用：可 用饮料、冷饮、糖果、酒类等食品。利用肉桂酸的防霉防腐杀菌可应用于粮食、蔬菜、 水果中的保鲜、防腐。肉桂酸还可用在葡萄酒中，使其色泽光鲜。d、在日化中的作用： 酪氨酸酶是黑色素合成关键酶，它启动了由酪氨酸转化为黑色素生物聚合体的级链反应。 肉桂酸有抑制形成黑色酪氨酸酶的作用，对紫外线有一定的隔绝作用，能使褐斑变浅， 甚至消失，是高级防晒霜中必不可少的成份之一。

肉桂酸生产方法：肉桂酸可以通过化学工艺合成和生物法制备，工业化制备肉桂酸 主要为化学法：(1)Perkin合成法、(2)苯甲醛-丙酮法、(3)苯甲醛-醋酸法、(4)苯乙 烯-一氧化碳法、(5)苯乙烯-二氧化碳法、(6)苯乙烯-四氯化碳法、(7)肉桂醛氧化法等。 主流工艺Perkin即以苯甲醛和醋酐为原料，在弱碱的作用下醛作为受体，乙酸酐的α-H 被夺去后以负离子的形式作为给予体，进行亲核加成，最后生成肉桂酸。化学合成方法 需要大量有机溶剂，污染环境，不利于工业化，并且这些方法或流程长，温度高，能耗 大，收率低；或副产物多，分离纯化难，污染严重，合成出的肉桂酸可能达不到安全可 食用级别，而生物法制备的肉桂酸完全可以解决这些问题。生物法制备肉桂酸以生物制 备的L-苯丙氨酸为底物，利用苯丙氨酸解氨酶催化L-苯丙氨酸非氧化脱氨基生成肉桂 酸和氨。利用生物催化法合成肉桂酸可以在体外实现的肉桂酸的全生物合成，得到的肉 桂酸由于其产品天然、无毒、过程可控，成为当下肉桂酸高端产品开发应用的迫切需求， 具有极大的市场空间和社会效益。目前生物法制备研究还不是很多，其中一个因素就是 肉桂酸对苯丙氨酸解氨酶具有明显的抑制作用，生物转化率较低导致反应结束转化液中 含有较高浓度的苯丙氨酸和较低浓度的肉桂酸，寻求一种从苯丙氨酸溶液中快速有效分 离肉桂酸的方法不仅有利于解除反应中的产物抑制现象，对于生物制备肉桂酸的工业化 实现同样具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以从全细胞催化制备肉桂酸的转化液中通过快速简 便的方法把底物和产物分离，并可将转化液和细胞重复利用的方法。

本发明技术方案的理论基础：

全细胞生物催化制备肉桂酸的基本方法是利用含有苯丙氨酸解氨酶活性的菌体在 碱性条件下以L-苯丙氨酸为底物，通过非氧化脱氨生成肉桂酸，并释放出氨。

其生物转化液中主要富含有苯丙氨酸、肉桂酸和少量氨。因此，肉桂酸的快速分离 过程主要也就是肉桂酸与苯丙氨酸的分离过程。

苯丙氨酸和肉桂酸在碱性反应条件下具有较好的溶解性，但由于肉桂酸属于弱酸难 溶性物质，在弱酸性条件下会选择性析出，通过调节pH和简单的固液分离解除肉桂酸 产物抑制，一方面直接获得純品肉桂酸，另一方面转化液中残余的苯丙氨酸由于解除了 产物抑制了继续被生物转化，从而提高了底物利用率和反应转化率。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种选择性分离苯丙氨酸生物转化液中肉桂酸及循环利用转化液的方法，它包括以 下步骤：

(1)苯丙氨酸生物转化液经固液分离分别得到清液I与细胞菌体；

(2)将步骤(1)得到的清液I用酸调节pH值至4.5，在室温下搅拌处理至白色沉淀析 出；

(3)步骤(2)得到的混合体系经固液分离得到清液II与沉淀，沉淀经洗涤、冷冻干燥 得到肉桂酸样品；

(4)步骤(3)得到的清液II用碱调节pH值至生物转化所需pH，再与步骤(1)得到的 细胞菌体混合，继续进行生物转化制备肉桂酸。

步骤(1)中，所述的苯丙氨酸生物转化液含有5～40g/L底物苯丙氨酸、10～20g/L产 物肉桂酸以及苯丙氨酸解氨酶活性的细胞菌体，苯丙氨酸生物转化液pH为9.0，所述的 含有苯丙氨酸解氨酶活性的细胞菌体为含有植物来源苯丙氨酸解氨酶的重组大肠杆菌 或重组酵母细胞[ZangY.,JiangT.,CongY.,ZhengZJ.,OuyangJ*.Molecular CharacterizationofaRecombinantZeamaysPhenylalanineAmmonia-Lyase(ZmPAL2)and ItsApplicationintrans-CinnamicAcidProductionfromL-Phenylalanine.ApplBiochem Biotechnol.,2015,176:924–937.]。

步骤(2)或(3)中，所述的固液分离方式为过滤或离心。

步骤(2)中，所述的酸为盐酸或硫酸。

步骤(2)中，搅拌转速100～200rpm。

步骤(3)中，所述的洗涤为使用蒸馏水洗涤2～3次。

步骤(4)中，所述的碱为氢氧化钠或氢氧化钾。

步骤(4)中，生物转化所需pH为9.0。

步骤(4)中，清液II用碱调节pH值至生物转化所需pH，再与细胞菌体混合，添加 或不添加苯丙氨酸，利用原有细胞菌体循环进行多次催化制备肉桂酸。

有益效果：本发明方法解决了现有的生物制备肉桂酸中产物抑制严重，肉桂酸产量 低和产品纯度不高的问题。本发明采用转化液适度酸化选择性沉淀分离肉桂酸方法得到 的肉桂酸产品，降低底物抑制作用并使转化液和细胞可循环利用的方法，产率最高可达 95％，产品纯度可达98％以上。该方法不仅过程简易，可大大降低提取成本，还可实现 得静息细胞和转化液多次循环利用。

附图说明

图1为肉桂酸标准样品和实验样品红外色谱图。

具体实施方式

下面结合实验室具体的实验数据进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。

实施例1：

1、称取0.6g苯丙氨酸，放入50ml锥形瓶中，加入30ml的Tris缓冲液，盐酸调 整pH至9.0，并分别加入0.26g含苯丙氨酸解氨酶的重组大肠杆菌【参考文献：ZangY., JiangT.,CongY.,ZhengZJ.,OuyangJ*.MolecularCharacterizationofaRecombinantZea maysPhenylalanineAmmonia-Lyase(ZmPAL2)andItsApplicationintrans-CinnamicAcid ProductionfromL-Phenylalanine.ApplBiochemBiotechnol.,2015,176:924–937.以下相 同】，终浓OD在20，摇匀，在温度55℃反应2h，转速为200rpm。

2、得到L-苯丙氨酸含量为5.69g/L，肉桂酸含量为14.94g/L的全细胞转化液，8000 rpm离心5min进行固液分离，上清液标记为清液I，固相菌体标记为菌泥II并移出反 应体系，用于二次反应。

3、清液I在常温下加入分析纯盐酸(36％)调pH至4.5，震荡搅拌5min，转速为 150rpm。

4、将出现白色沉淀的溶液8000rpm离心5min进行固液分离，上清液标记为清液 II用于二次反应，固相标记为肉桂酸粗品II；

5、清液II用50％NaOH溶液调pH至9.0，与菌泥II充分混合，重复步骤1中的催 化反应和后续步骤3次。

6、将4次反应获得的肉桂酸粗品II合并用约60ml体积的蒸馏水洗涤、干燥后得 到成品肉桂酸0.51g，纯度98％以上(HPLC分析)，产率为94％。

实施例2：

1、称取1.2g苯丙氨酸，放入50ml锥形瓶中，加入30ml的Tris缓冲液，盐酸调 整pH至9.0，并分别加入0.26g含苯丙氨酸解氨酶的重组大肠杆菌，终浓OD在20， 摇匀，在温度55℃反应2h，转速为200rpm。

2、得到L-苯丙氨酸含量为23.50g/L，肉桂酸含量为13.19g/L的全细胞转化液，8000 rpm离心5min进行固液分离，上清液标记为清液I，固相菌体标记为菌泥II，移出反应 体系，用于二次反应。

3、清液I在常温下加入分析纯盐酸(36％)调pH至4.5，震荡搅拌5min，转速为 150rpm。

4、将出现白色沉淀的溶液I8000rpm离心5min进行固液分离，上清液标记为清液 II用于二次反应，固相标记为肉桂酸粗品II；

5、清液II用50％NaoH溶液调pH至9.0，与菌泥II充分混合，重复步骤1中的催 化反应和后续步骤3次。

6、将4次反应获得的肉桂酸粗品II合并用约60ml体积的蒸馏水洗涤、干燥后得 到成品肉桂酸1.03g，纯度98％以上(HPLC分析)，产率为95％。

对比例1：

1、称取0.6g苯丙氨酸，放入50ml锥形瓶中，加入30ml的Tris缓冲液，盐酸调 整pH至9.0，并分别加入0.26g含苯丙氨酸解氨酶的重组大肠杆菌，终浓OD在20， 摇匀，在温度55℃反应8h，转速为200rpm。

2、得到L-苯丙氨酸含量为8.45g/L，得到肉桂酸含量为12.69g/L的全细胞转化液， 8000rpm离心5min进行固液分离，上清液标记为清液I，固相菌体移出反应体系。

3、清液I在常温下加入分析纯盐酸(36％)调pH至4.5，震荡搅拌5min，转速为 150rpm。

4、将出现白色沉淀的溶液8000rpm离心5min进行固液分离，固相标记为肉桂酸 粗品。

5、将获得的肉桂酸粗品用约60ml体积的蒸馏水洗涤、干燥后得到成品肉桂酸0.33 g，纯度98％以上(HPLC分析)，产率为61％。

对比例2：

1、称取1.2g苯丙氨酸，放入50ml锥形瓶中，加入30ml的Tris缓冲液，盐酸调 整pH至9.0，并分别加入0.26g含苯丙氨酸解氨酶的重组大肠杆菌，终浓OD在20， 摇匀，在温度55℃反应8h，转速为200rpm。

2、得到L-苯丙氨酸含量为22.45g/L，肉桂酸含量为17.41g/L的全细胞转化液，8000 rpm离心5min进行固液分离，上清液标记为清液I，固相菌体移出反应体系。

3、清液I在常温下加入分析纯盐酸(36％)调pH至4.5，震荡搅拌5min，转速为 150rpm。

4、将出现白色沉淀的溶液8000rpm离心5min进行固液分离，固相标记为肉桂酸 粗品。

5、将肉桂酸粗品用约60ml体积的蒸馏水洗涤、干燥后得到成品肉桂酸0.52g，纯 98％以上(HPLC分析)产率为48％。

实施例5：肉桂酸成品的红外色谱图

对实施例2得到绝干的样品进行红外色谱分析，结果见图1所示。