癌变信息提供方法及癌变信息提供装置

摘要

本发明提供一种提供细胞癌变的相关信息的癌变信息提供方法，包括：数据获取步骤，让含有采自上皮组织的细胞的测定试样流入流动室，用光照射流经该流动室的所述测定试样，获取包括表示所述测定试样中所含有的各细胞所产生的散射光的散射光信号以及表示荧光的荧光信号在内的测定数据；数据提取步骤，计算出从各细胞获取的散射光信号的脉冲宽度和荧光信号的脉冲宽度的比，提取计算出的比在第一阈值以上的细胞的测定数据，并将其作为上皮组织中位于基底膜一侧而非表层的细胞的至少一部分——即分析对象细胞的测定数据；信息输出步骤，对所提取的测定数据进行分析并输出细胞癌变的相关信息。本发明还提供一种提供细胞癌变相关信息的癌变信息提供装置。

说明书

本申请是申请号为201280036084.3、申请日为2012年07月04日、名称为“癌变信息提供方法及癌变信息提供装置”的由同一申请人提交的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种分析细胞并提供该细胞的癌变相关信息的癌变信息提供方法及癌变信息提供装置。

背景技术

人们已经知道有一种分析装置能够自动分析受检者的细胞并提供该细胞的癌变相关信息（比如参照专利文献1~2）。专利文献1公开了一种装置，该装置让含有采自受检者的细胞的测定试样流过流动室，用光照射流经该流动室的测定试样，以此获得各个细胞的散射光信号，通过分析各散射光信号的波形来提取特征参数，用该特征参数从复数个细胞中辨别出癌细胞及异形细胞（atypicalcell）。

专利文献2公开了一种病理诊断辅助装置，该装置拍摄流经流动室的细胞，根据所获得的图像数据推断细胞核及细胞质的分布，并根据所推断的细胞核及细胞质的分布面积比例（N/C比），推断病理组织标本中癌部位的分布。

先行技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2006/103920号

专利文献2：特开（日本专利公开）2004-286666号。

发明内容

发明要解决的课题

比如，在宫颈的组织学诊断中，从正常状态发展到癌症的过程有几个阶段，从正常状态起依次为“正常（Normal）”、“CIN1”、“CIN2”、“CIN3”及“癌症（Cancer）”。其中，“CIN1”、“CIN2”和“CIN3”阶段都属于被称作“宫颈上皮内瘤病变（CIN）”的阶段。

“CIN1”是指由基底层向表层的1/3处有非典型（atypical）副基底细胞（parabasalcell）增殖的状态，这是一种很可能自然消退的状态。因此，在“CIN1”阶段通常认为尚无需治疗。“CIN2”是指由基底层向表层的2/3处有非典型（atypical）副基底细胞增殖的状态，“CIN2”阶段是人们认为需要治疗的状态。“CIN3”是指在基底层与表层之间几乎随处都有非典型（atypical）副基底细胞增殖的状态，“CIN3”阶段被人们判断为需要治疗。要尽早开始癌症治疗的话，最好在癌症演变至“癌症（Cancer）”之前的“CIN2”~“CIN3”的癌症初期阶段检测出患者患有癌症的可能性，并且最好能区分出患者是处于被判断为无需治疗的“CIN1”以前的阶段还是处于被判断为需要治疗的“CIN2”以后的阶段。

无论是在判断为无需治疗的“CIN1”阶段还是在判断为需要治疗的“CIN2”阶段，都会有正常细胞与癌细胞或异形细胞（atypicalcell）混合存在。因此，从“CIN1”阶段的受检者宫颈采集细胞制备测定试样也好，从“CIN2”阶段的受检者宫颈采集细胞制备测定试样也好，测定试样中都会既有正常细胞又有癌细胞或异形细胞（atypicalcell），仅通过检测异形细胞（atypicalcell）这一途径很难在癌症初期阶段精确检测出患者患有癌症的可能性。

在专利文献1和2所记述的分析装置中，即使对从癌症初期阶段受检者宫颈采集、制备的测定试样进行分析，由于癌细胞或异形细胞（atypicalcell）在用于分析的细胞数中所占比例很小，因此很难在癌症初期阶段精确检测出患者患有癌症的可能性。

本发明有鉴于此，其目的在于提供一种能够在癌症初期阶段精确检测出患者患有癌症的可能性的癌变信息提供方法及癌变信息提供装置。

解决问题的手段

（1）本发明的癌变信息提供方法是一种提供细胞癌变的相关信息的癌变信息提供方法，其特征在于包括以下步骤：数据获取步骤，即，就含有采自上皮组织的细胞的测定试样中所含有的各细胞获取包括与细胞核大小相关的第一数据及与细胞质大小相关的第二数据在内的测定数据；数据提取步骤，即，根据就各细胞获取的第一数据和第二数据，从测定试样中的复数个细胞的测定数据中提取分析对象细胞的测定数据，其中分析对象细胞是指在上皮组织中位于基底膜一侧而非表层的细胞的至少一部分；信息输出步骤，即，对所提取的测定数据进行分析并输出细胞癌变的相关信息。

宫颈和口腔等部位的细胞的存在状态是复数种细胞分别由表层一侧向基底膜一侧呈层状排列。比如，在宫颈上皮细胞中，由基底膜一侧向表层一侧依次存在着由基底细胞形成的层（基底层）、由副基底细胞形成的层（副基底层）、由中层细胞形成的层（中层）、以及由表层细胞形成的层（表层），基底膜附近的基底细胞分化为副基底细胞，副基底细胞分化为中层细胞，中层细胞分化为表层细胞。在宫颈上皮细胞中，与癌变相关的细胞是基底细胞，在发展至癌症的过程中，基底细胞非典型增生，成为异形细胞（atypicalcell）。异形细胞（atypicalcell）获得增殖能力，并由基底层一侧起占据表层一侧。此外，非典型（atypical）化的基底细胞会分化，因此，在癌变的过程中会出现非典型（atypical）化的副基底细胞、中层细胞。在向癌症发展的初期阶段，非典型（atypical）化的细胞多存在于基底一侧，表层一侧则很少，表层一侧多为正常表层细胞。本案发明人正是着眼于此而完成了本发明。

关于本发明的癌变信息提供方法，在数据提取步骤中从测定试样中的细胞中提取可能癌变的分析对象细胞的测定数据，其中的分析对象细胞即位于基底一侧而非表层的细胞中的至少一部分。换言之，将DNA含量无异常的位于表层的细胞排除在外。然后，对提取了测定数据的细胞进行分析，输出细胞癌变的相关信息。因此，能够增大癌变细胞或处于癌变过程中的细胞在用于分析的细胞中所占的比例，能够提高上述癌变细胞或处于癌变过程中的细胞的检测灵敏度。

（2）根据（1）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：第一数据为表示细胞核大小的数值，第二数据为表示细胞质大小的数值，在数据提取步骤中就测定试样中所含有的各细胞算出第一数据和第二数据之比，根据求出的比值提取分析对象细胞的测定数据。

（3）根据（2）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：在数据提取步骤中提取求出的比值在第一阈值以上的细胞的测定数据作为分析对象细胞的测定数据。

（4）根据（2）或（3）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：在数据提取步骤中根据求出的比值和第二数据提取分析对象细胞的测定数据。

（5）根据（4）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：在数据提取步骤中提取第二数据在第二阈值以下的细胞的测定数据作为分析对象细胞的测定数据。

（6）根据（1）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：数据获取步骤包括信号获取步骤，信号获取步骤是指获取表示光照测定试样所产生的散射光强度的散射光信号和表示荧光强度的荧光信号的步骤；第一数据是以信号获取步骤中获取的荧光信号波形为基础的、关于细胞核大小的数据，第二数据是以信号获取步骤中获取的散射光信号的波形为基础的、关于细胞质大小的数据。

（7）根据（1）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：在信息输出步骤中，就数据提取步骤中提取的作为分析对象的细胞计算出反映DNA含量的值，并根据计算出的值决定细胞癌变的相关信息。

（8）根据（7）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：在信息输出步骤中，根据反映DNA含量的值，将作为分析对象提取的各个细胞分类为显示正常DNA含量的第一组和显示大于正常DNA含量范围的DNA含量的第二组，计算出第一组的细胞数目和第二组的细胞数目之比，根据计算出的比值决定细胞癌变的相关信息。

（9）根据（1）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：将作为分析对象提取的细胞的数目与第三阈值进行比较，如果该细胞的数目小于第三阈值，则禁止输出细胞癌变的相关信息，或者是在输出癌变相关信息时附加上表示细胞数目很少的信息。

（10）根据（1）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：该方法在数据获取步骤之前还包括分散测定试样中的凝集细胞的分散步骤。

（11）根据（1）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：将单个上皮细胞的数目与第四阈值进行比较，如果该单个上皮细胞的数目小于第四阈值，则禁止输出细胞癌变的相关信息，或者是在输出癌变相关信息时附加上表示细胞数目很少的信息。

（12）根据（1）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：细胞为宫颈的细胞，且位于表层的细胞为表层细胞。

（13）根据（1）所述的癌变信息提供方法，还可以如下设计：在信息输出步骤中，输出是否需要复检的相关信息作为细胞癌变的相关信息。

（14）本发明的癌变信息提供装置是一种提供细胞癌变的相关信息的癌变信息提供装置，其特征在于：该装置包括数据获取部件和控制部件，其中数据获取部件就含有采自上皮组织的细胞的测定试样中所含有的各细胞获取包括关于细胞核大小的第一数据和关于细胞质大小的第二数据在内的测定数据；控制部件根据就各细胞获取的第一数据和第二数据，从测定试样中的复数个细胞的测定数据中提取分析对象细胞的测定数据并分析所提取的测定数据，输出细胞癌变的相关信息，其中分析对象细胞是指在上皮组织中位于基底膜一侧而非表层的细胞的至少一部分。

（15）根据（14）所述的癌变信息提供装置，还可以如下设计：该装置还具有供测定试样流过的流动室、以及用光照射流经该流动室的测定试样并获取测定试样中所含有的细胞的光学信息的光学信息获取部件；数据获取部件根据光学信息获取第一数据和第二数据。

（16）根据（15）所述的癌变信息提供装置，还可以如下设计：该装置还具有对流经流动室的测定试样中所含有的细胞进行拍摄的拍摄部件；第一数据是拍摄部件拍摄到的细胞核的面积，第二数据是拍摄部件拍摄到的细胞质的面积。

发明的效果

通过本发明的癌变信息提供方法和装置能够在癌症初期阶段精确地检测出患者患有癌症的可能性。

附图说明

图1为本发明一实施方式的癌变信息提供装置的斜视说明图；

图2为图1所示癌变信息提供装置的结构框图；

图3为构成图1所示癌变信息提供装置中的数据处理装置的个人计算机（personalcomputer）的框图；

图4为图1所示癌变信息提供装置中的流式细胞仪的结构框图；

图5为说明癌变信息提供方法的流程的一例的流程图；

图6为测定数据的说明图；

图7为散点图的一例的示图；

图8为信号波形与特征参数的关系说明图；

图9为数据处理装置的显示部件的显示例示图；

图10为宫颈上皮细胞的示意图；

图11为宫颈各种上皮细胞的细胞大小与N/C比的关系图；

图12为提取的细胞的DNA含量的直方图；

图13是将细胞周期与DNA含量直方图联系起来进行说明的示图；

图14为在细胞周期中各阶段与DNA含量的关系的说明图；

图15为数据处理装置的显示部件的显示例示图；

图16为数据处理装置的显示部件的显示例示图；

图17是就所有单个细胞绘制的直方图的一例的示图；

图18是就所有单个细胞绘制的直方图的其他例子的示图；

图19为在步骤S9绘制的直方图的一例；

图20为在步骤S9绘制的直方图的其他例子。

具体实施方式

下面参照附图详细说明本发明的癌变信息提供装置及癌变信息提供方法的实施方式。

[癌变信息提供装置的整体结构]在图1和图2所示癌变信息提供装置1中，让含有采自患者（受检者）的细胞的测定试样流经流动室，检测、分析用激光照射流经此流动室的测定试样时从测定试样获得的光（前向散射光、侧向荧光等），由此判断细胞中是否含有癌变细胞或处在癌变过程中的细胞（以下也将其统称为“癌变细胞”），并输出其结果。具体而言，癌变信息提供装置1用于通过采自患者的宫颈上皮细胞筛查宫颈癌。癌变信息提供装置1具有进行试样测定等的测定装置2、以及与此测定装置2连接并分析和显示（输出）测定结果等的数据处理装置4。如图1所示，癌变信息提供装置1还包括用于放置复数个盛放混合液的试管（无图示）的样本放置部件50，其中所述混合液是以甲醇为主要成份的保存液和采自患者的生物试样的混合液。

如图2所示，癌变信息提供装置1的测定装置2具有：从测定试样检测出细胞及其细胞核的大小等信息的光学信息获取部件—也就是由流式细胞仪构成的光学检测部件3、信号处理线路5、测定控制部件16、包括电机、致动器（actuator）和阀（Valve）等的驱动部件17、各种传感器18、以及拍摄细胞图像的拍摄部件26。信号处理线路5具有：对前置放大器（无图示）放大后的流式细胞仪3的输出内容进行放大处理和滤波处理等的模拟信号处理线路、将模拟信号处理线路的输出内容转换为数字信号的A/D转换器、以及对数字信号进行一定波形处理的数字信号处理线路。测定控制部件16在处理传感器18的信号的同时控制驱动部件17的作业，以此进行测定试样的吸移和测定。在筛查宫颈癌时，测定试样可以使用对采自患者宫颈的细胞（上皮细胞）进行离心、稀释、搅拌和PI染色等处理而制备的测定试样。所制备的测定试样装在试管中并放置到所述样本放置部件50中的一定位置处，进而被运送到测定装置2的移液管（无图示）下方位置，然后被该移液管吸移，与鞘液一起供应至流动室。以此在流动室形成试样流。PI染色（DNA染色）是用含有红色色素的荧光染色液碘化丙啶（PI）进行的。PI染色是有选择地对细胞核进行染色，因此能够检测出来自细胞核的红色荧光。

[测定控制部件的结构]测定控制部件16具有微处理器20、存储部件21、I/O控制器22、传感器信号处理部件23、驱动部件控制驱动器24和外部通信控制器25等。存储部件21由ROM（ReadOnlyMemory，只读存储器）、RAM（RandomAccessMemory，随机存取存储器）等构成，ROM中存储着用于控制驱动部件17的控制程序和执行该控制程序所需要的数据。微处理器20能够将控制程序下载到RAM中或直接从ROM执行控制程序。

传感器18的信号通过传感器信号处理部件23和I/O控制器22传送到微处理器20。微处理器20通过执行控制程序就能与传感器18的信号相应地通过I/O控制器22和驱动部件控制驱动器24控制驱动部件17。通过外部通信控制器25与数据处理装置4等外部装置传输微处理器20处理后的数据和微处理器20进行处理所需要的数据。

[数据处理装置的结构]如图3所示，数据处理装置4由个人计算机（personalcomputer）等构成，主要由主机27、显示部件28和输入部件29构成。主机27主要由CPU（CentralProcessingUnit，中央处理器）27a、ROM27b、RAM27c、硬盘27d、读取装置27e、I/O接口27f、图像输出接口27g构成。上述各部分均通过总线27h进行了可通信连接。

CPU27a执行存储在ROM27b中的计算机程序和下载到RAM27c中的计算机程序等。CPU27a充当着获取后述关于细胞核大小的数据和关于细胞质大小的数据等的数据获取部件，还充当着对所提取的细胞进行分析并输出癌变相关信息的控制部件。

ROM27b由掩膜ROM、PROM、EPROM、EEPROM等构成，其用于存储由CPU27a执行的计算机程序及其所需要的数据等。RAM27c由SRAM或DRAM等构成。RAM27c用于读取存储在ROM27b和硬盘27d中的计算机程序。在执行这些计算机程序时，RAM27c还作为CPU27a的工作空间使用。

硬盘27d中安装有操作系统和应用程序等供CPU27a执行的各种计算机程序和执行上述计算机程序时所需要的数据。比如，硬盘27d中安装有美国微软公司生产销售的Windows（注册商标）等提供图形用户界面的操作系统。用于制作后述波形数据、计算N/C比等的计算机程序及执行该计算机程序所需要的数据安装在硬盘27d中。

硬盘27d中还安装有操作程序，该操作程序用于向癌变信息提供装置1的测定控制部件16传送测定指令（作业命令）、接受并处理测定装置2测得的测定结果、显示处理后的分析结果等。此操作程序在上述操作系统上运行。

读取装置27e由软盘驱动器、CD—ROM驱动器或DVD—ROM驱动器等构成，能够读取移动式存储介质中存储的计算机程序或数据。I/O接口27f由例如USB、IEEE1394、RS－232C等串行接口、SCSI、IDE、IEEE1284等并行接口、以及由D/A转换器和A/D转换器等组成的模拟接口等构成。I/O接口27f连接着由键盘和鼠标构成的输入部件29，用户能够通过操作输入部件29向个人计算机（personalcomputer）输入数据。I/O接口27f与测定装置2连接，能够与该测定装置2传输数据等。

图像输出接口27g连接着由LCD或CRT等构成的显示部件28，并且将与从CPU27a接收的图像数据相应的影像信号和与波形数据相应的波形信号输出到显示部件28。显示部件28按照输入的影像信号和波形信号显示图像（界面）。

[流式细胞仪和拍摄部件的结构]图4为构成光学信息获取部件的光学检测部件3、以及拍摄部件26的结构图。光学检测部件3由流式细胞仪构成，且光学检测部件3具有由半导体激光器组成的光源53。由此光源53射出的激光经过透镜系统52后聚集于流经流动室51的测定试样。在此激光照射下测定试样中的细胞所产生的前向散射光经过物镜54和过滤器57被光电二极管（受光部件）55检测出来。透镜系统52由包括准直透镜、柱面透镜和聚光透镜等在内的透镜群构成。

细胞产生的侧向荧光和侧向散射光通过配置在流动室51侧面的物镜56射入分色镜61。此分色镜61反射的侧向荧光和侧向散射光射入分色镜62。

从分色镜62透射而出的侧向荧光经过过滤器63后被光电倍增管59检测出来。分色镜62反射的侧向散射光经过过滤器64后被光电倍增管58检测出来。

光电二极管55、光电倍增管58和光电倍增管59将检测出的光转换为电信号并分别输出前向散射光信号（FSC）、侧向散射光信号（SSC）和侧向荧光信号（SFC）。这些信号在被无图示的前置放大器放大后输送到上述信号处理线路5（参照图2）。

如图2所示，在信号处理线路5经过了滤波处理和A/D转换处理等信号处理后所获得的前向散射光数据、侧向散射光数据和侧向荧光数据由微处理器20通过外部通信控制器25传送至所述数据处理装置4并存入硬盘27d。数据处理装置4根据前向散射光数据、侧向散射光数据和侧向荧光数据计算出细胞质和细胞核的宽度及N/C比等。

关于光源53，也可以使用气体激光器来代替半导体激光器，但从低成本、小型化且低耗电的观点来看，以采用半导体激光器为宜。采用半导体激光不仅能够降低产品成本，还能够实现装置的小型化和省电化。在本实施方式中使用的是有利于将光线收束为较窄的光束的、波长较短的蓝色半导体激光器。蓝色半导体激光器对PI等的荧光励起波长也有效。另外，光源53也可以使用半导体激光器中低成本、寿命长且厂商供应稳定的红色半导体激光器。

在本实施方式中，除流式细胞仪3以外还设有拍摄部件26。此拍摄部件26如图4所示，具有由脉冲激光器构成的光源66和CCD照相机65。脉冲激光器66发出的激光经过透镜系统60后射入流动室51，再通过物镜56和分色镜61，并在照相机65成像。脉冲激光器66能够在一定时间发光并使照相机65能够进行拍摄。

如图2所示，照相机65拍摄到的细胞图像由微处理器20通过外部通信控制器25输送到数据处理装置4。细胞的图像在数据处理装置4中与该细胞的所述前向散射光数据、侧向散射光数据和侧向荧光数据相对应地存入硬盘27d。

[癌变信息提供方法]下面参照图5，说明本实施方式中通过癌变信息提供装置1所使用的癌变信息提供方法的流程的一例。

用癌变信息提供装置1进行分析时，首先由用户对采自患者宫颈的细胞（上皮细胞）进行去除凝集细胞、PI染色等前处理，制备测定试样。然后，装有经过前处理的测定试样和以甲醇为主要成分的保存液的试管被用户放置到样本放置部件50，开始用癌变信息提供装置1进行分析。

尽管单个细胞的DNA含量正常，但复数个细胞凝集起来会导致测定DNA含量显示为异常值，由此会造成分析精度下降，去除凝集细胞正是为了防止这一情况。这种去除凝集细胞的作业可以通过将分散操作和过滤操作组合而成的处理以及对生物试样施加超声波振动的处理来实现，其中所述分散操作是用电机旋转配置在稀释后的生物试样中的转轴来分散该生物试样中的细胞，所述过滤操作是让分散后的生物试样通过过滤器并由此除去凝集细胞。关于后一处理（超声波振动处理），超声波振动在生物试样中引起空洞现象（cavitation，小气泡的产生与气泡的破裂），此时所伴随的冲击（压力变动）能够分散凝集细胞。

图5为本实施方式的癌变信息提供装置1的测定装置2的微处理器20与数据处理装置4的CPU27a所实施的、从用户向数据处理装置4的CPU27a下达测定开始指示后开始到提供癌变信息为止的处理的流程图。在接通数据处理装置4的电源并对存储在该数据处理装置4中的计算机程序进行完初始化等作业后，用户才下达测定开始指示。用户向CPU27a下达测定开始指示后，CPU27a将测定开始指示传送到测定装置2的微处理器20。然后，在微处理器20接收到测定开始指示后，在测定装置2中，移液管吸移装在试管内的测定试样，并将其供应至图4所示流动室51，形成试样流（步骤S1）。

然后，激光照射流经流动室51的测定试样中的细胞，来自该细胞的前向散射光由光电二极管55检测出来，侧向散射光由光电倍增管58检测出来，侧向荧光则由光电倍增管59检测出来。

然后，流式细胞仪3输出的前向散射光信号、侧向散射光信号和侧向荧光信号输送到信号处理线路5，在信号处理线路5经过一定处理，由此获得反映前向散射光强度的前向散射光数据、反映侧向散射光强度的侧向散射光数据、反映侧向荧光强度的侧向荧光数据、以及后述特征参数（步骤S2）。

图6为在步骤S2获得的测定数据的说明图。图6显示了含有细胞核的细胞的示意图以及从该细胞获得的前向散射光信号的波形和侧向荧光信号的波形。在图6中，图表的纵坐标表示各种光的强度。前向散射光强度的波形的宽度表示的是反映细胞质宽度的数值（与细胞质大小相关的第二数据），侧向荧光强度的波形的宽度表示的是反映细胞核宽度的数值（与细胞核大小相关的第一数据）。侧向荧光强度波形和一定的基线所包围的图6中阴影区域的面积表示的是细胞的DNA含量。在CPU27a计算出各细胞的第一数据与第二数据之比N/C比，即计算出细胞核大小与细胞大小之比（=侧向荧光信号波形的宽度与前向散射光信号波形的宽度之比）。

步骤S2之后，微处理器20将包括在步骤S2获得的前向散射光数据、侧向散射光数据、侧向荧光数据和特征参数在内的测定数据通过外部通信控制器25传送至数据处理装置4（步骤S3），然后结束处理。

然后，CPU27a判断是否从微处理器20收到了测定数据（步骤S4）。在步骤S4，如果CPU27a判断未从微处理器20收到测定数据（步骤S4为否），则反复进行步骤S4的处理直到收到测定数据为止。另一方面，在步骤S4，如果CPU27a判断从微处理器20收到了测定数据（步骤S4为是），则将处理推进到步骤S5。

在步骤S5，CPU27a绘制如图7所示的散点图。绘制的散点图能够显示在数据处理装置4的显示部件28上。此散点图的纵坐标为细胞大小，横坐标为所述N/C比。当用癌变信息提供装置1分析采自正常人的宫颈上皮细胞时，在步骤S5绘制的散点图如图7所示，呈右边下垂的新月形分布。

在步骤S5绘制出散点图后，在步骤S6，CPU27a判断获取了测定数据的细胞中是否存在5000个（第四阈值）以上的单个上皮细胞。在本实施方式中，此判断用专利文献1所述以下方法进行。

即，可以使用下述数值：从前向散射光的波形信号获得的用差分积分值除以峰值所得到的特征参数B、或者是标准化（normalized）二阶矩，即特征参数M。例如以20nsec为取样周期在X0、X1、X2、……Xn由无图示的A/D转换器对波形信号取样，将最大电压10V与基线（BaseLine）电压0.05V之间的测量电压以8比特（bit）分辨率电子化，转换成数字信号。

特征参数B用以下公式（1）表示。

[数1]

在此，所谓差分积分值表示相邻的取样数据的差的绝对值的累计相加值，Peak，即峰值，是指波形的最大值（参照图8），用以下式（2）表示。

[数2]

特征参数M由以下式（3）表示。

[数3]

其中，P是Xp为峰值时的下标字母，Width，即宽度，是指如图8所示大于基线——即BaseLine的部分的宽度，用以下式（4）表示。

[数4]

其中，P是Xp为峰值时的下标字母。用于判断细胞是否为单个细胞的阈值是通过实验等针对各个参数设定的。在本实施方式中，例如使用特征参数B，将该特征参数B达到2.2以上的细胞判断为凝集细胞，不到2.2的则被判断为单个细胞。在使用特征参数M的情况下，可以将该特征参数M在2100以上的细胞定为凝集细胞，不到2100的定为单个细胞。

所述“5000个”这一数字（阈值）作为判断细胞诊断检查恰当与否的指标是一个普遍使用的数字。在本实施方式中也将此数字“5000个”用作保证分析精度的阈值。

在步骤S6，当判断单个细胞的数目不足5000个时，CPU27a不进行后述步骤S7的分析对象细胞提取作业，直接进入步骤S13。在步骤S13，CPU27a将无法对步骤S1中制备的测定试样进行判断的信息如图9所示地显示在显示部件28（步骤S13）。

在步骤S6，当判断单个细胞的数目在5000个以上时，CPU27a用细胞大小和N/C比这两个参数提取分析对象细胞的测定数据（步骤S7）。

[分析对象细胞的测定数据的提取（步骤S7）]被本发明的癌变信息提供方法及装置采用做主要分析对象的宫颈和口腔粘膜的上皮组织中，复数种细胞分别从基底膜开始依次呈层状存在。在本说明书中，以基底膜为下层时位于上层的一侧被称为表层。在宫颈和口腔粘膜中，与外界相邻的一侧相当于表层一侧。

如图10所示，在宫颈处，由基底膜一侧起依次形成了由基底细胞形成的层（基底层）、由副基底细胞形成的层（副基底层）、由中层细胞形成的层（中层）、以及由表层细胞形成的层（表层）。基底膜附近的基底细胞分化为副基底细胞，副基底细胞分化为中层细胞，中层细胞分化为表层细胞。在口腔粘膜处，由基底膜一侧起依次形成有基底细胞层、棘细胞层、颗粒细胞层及角质层。以上内容的归纳见以下表1。

[表1]

如上所述，在上皮组织的复数种细胞中，与癌变相关的细胞在宫颈上皮组织中为基底细胞，在口腔粘膜上皮组织中为基底细胞。在发展至癌症的过程中，基底细胞非典型（atypical）增殖，成为异形细胞（atypicalcell）。异形细胞（atypicalcell）获得增殖能力，由基底层一侧起开始占据表层一侧。为此，在向癌症发展的初期阶段，宫颈上皮组织中的基底层、副基底层及中层的细胞中存在大量癌变细胞，而口腔粘膜的上皮组织中位于基底细胞层和棘细胞层的细胞中存在大量癌变细胞。相反，在向癌症发展的初期阶段，宫颈上皮组织的表层和口腔粘膜上皮组织的角质层等上皮组织的表层一侧的层中的细胞则极少有癌变细胞。

已知在上述上皮组织中，由表层一侧的层向基底膜一侧的层，细胞大小逐渐变小，但细胞核的大小却逐渐变大。因此，表示细胞核大小与细胞大小之比的N/C比也由表层一侧的层向基底膜一侧的层逐渐变大。因此，在本实施方式中，用细胞大小与N/C比提取分析对象细胞的测定数据。具体而言，在步骤S7，提取细胞大小在10μm以上50μm以下、N/C比在0.2以上1以下的细胞的测定数据。

判断细胞是否应作为分析对象提取的判断标准，即细胞大小（第二阈值）和N/C比（第一阈值）可以根据充当分析对象的上皮组织的种类通过观察和分析样本组织来设定。比如，在以宫颈上皮组织为分析对象的宫颈癌筛查中，可以将N/C比在0.2以上且细胞宽度（细胞大小）在50μm以下作为判断标准。构成宫颈上皮组织的各个细胞的形态和大小以及细胞核的大小归纳于下表2。以横坐标为N/C比，以纵坐标为细胞大小的坐标中标绘各细胞，所得结果如图11所示。

[表2]

从图11和表2得知，对于宫颈上皮组织，提取N/C比在0.2以上且细胞宽度在50μm以下的细胞，由此就能够基本上把癌变细胞极少的表层中的表层细胞排除在分析对象之外，仅以癌变细胞明显多于表层的层内的中层细胞、副基底细胞和基底细胞为分析对象。在图11中，为了便于理解，表层细胞在细胞总数中所占比例很小，但实际上采自受检者的宫颈上皮组织中的表层细胞数目比其他细胞多。因此，如果以采集的所有细胞作为分析对象的话，即使该细胞中含有癌变细胞，其存在也会被稀释，因此不会判断为需要复检（阳性）。即，如果以采集的所有细胞为分析对象的话，很难提高检测灵敏度。

而将癌变细胞极少的表层中的表层细胞实际上从采集的细胞中排除在分析对象之外，能够增大癌变细胞在所有细胞中所占比例，从而能够提高该癌变细胞的检测灵敏度。

关于本发明的癌变信息提供方法，在用于提取分析对象细胞的测定数据的细胞提取步骤中，提取包括某种程度上较为靠近基底膜的层中的细胞在内的、N/C比在某种程度上较大的细胞。细胞大小和N/C比会有多多少少的分散不一，因此，在上述提取方法中，仅将所有表层细胞排除在分析对象之外的做法在现实中是不可能的，有一部分表层细胞会被作为分析对象提取出来。相反，也会有一部分中层细胞、副基底细胞和基底细胞被排除在分析对象外。但是，通过适当地选定充当提取判断标准的细胞大小和N/C比，就能够将几乎所有癌变可能性极低的表层细胞排除在分析对象之外。

在本发明中，比如在宫颈处从基底细胞、副基底细胞、中层细胞和表层细胞所组成的细胞团块中提取基底细胞、副基底细胞和中层细胞。在口腔粘膜处从基底细胞、棘细胞、颗粒细胞和角质所组成的细胞团块中提取基底细胞和棘细胞。

返回图5的流程图，在步骤S7，CPU27a提取N/C比在0.2以上且细胞宽度在50μm以下的细胞的测定数据。在接下来的步骤S8，CPU27a判断N/C比在0.2以上且细胞宽度在50μm以下的细胞的数目是否在1000个（第三阈值）以上。如果CPU27a判断N/C比在0.2以上且细胞宽度在50μm以下的细胞的数目在1000个以上（步骤S8为是），则将处理推进到步骤S9，在该步骤S9绘制后述直方图（DNA含量直方图）。另一方面，在步骤S8，如果CPU27a判断N/C比在0.2以上且细胞宽度在50μm以下的细胞数目不足1000个（步骤S8为否），则不进行后述步骤S11和步骤S12的作业，进入步骤S13。在步骤S13，CPU27a如图9所示地在显示部件28显示表示步骤S1中制备的测定试样无法进行判断的信息（步骤S13）。1000个这一数值（第三阈值）是在考虑到分析精度和可靠性的基础上经各种实验和验证选定的数值，其在本发明中无特别限定。

图12为在步骤S9绘制的直方图的一例。图12是针对步骤S7中提取的N/C比在0.2以上且细胞宽度在50μm以下的细胞绘制的图，纵坐标表示细胞数目，横坐标表示细胞的DNA含量。表示正常DNA含量的范围（以下也称为2C）是通过很多个阴性样本的数据计算出来的。在本实施方式中，将表示正常DNA含量的范围设定为a以上b以下。将异常DNA含量的范围（以下也称为S期以上）设定为大于正常DNA含量的范围，将其设定为大于b且在c以下的范围。正常DNA含量的范围和异常DNA含量的范围在本发明中无特别限定，其数值是在考虑到分析精度和可靠性的基础上通过各种实验和验证等选定的。

如图13所示，细胞会按照一定周期（细胞周期）经过DNA复制、染色体分配、细胞核分裂、细胞质分裂等现象分裂成两个细胞，然后又返回起点。细胞周期根据其阶段可以分为以下四期，在此四期之外再加上细胞增殖休止的休止期（G0期），细胞总是处于五期中的某一阶段。G1期：进入S期之前的准备和检查期，S期：DNA合成期，G2期：进入M期之前的准备和检查期，M期：分裂期。

当细胞按照细胞周期增殖时，细胞内的细胞核的染色体也会增加，因此，测定细胞的DNA含量就能推断该细胞处于细胞周期的哪个状态。正常细胞如图14所示，在G1期的DNA含量是一定的，在接下来的S期，DNA含量逐渐增加，进入其后的G2期后便成为一定值，此值在M期继续保持。就正常细胞绘制DNA含量直方图，则会得到图13所示直方图。具有最高峰的山丘对应着DNA含量最少的G0期或G1期的细胞，具有第二高峰的山丘对应着DNA含量最多的G2期或M期细胞，其中间则对应着S期的细胞。

在正常细胞的情况下，处于S期、G2期或M期中的某一状态的细胞数目与处于G0期或G1期的细胞数目之比基本显示为一定范围内的数值。然而，当细胞癌变或处于癌变过程中时，该细胞的染色体数目异常增多，因此，DNA含量也增多。癌变细胞比正常细胞增殖能力强，故DNA含量多的细胞数目增多。

因此，以正常的G0期或G1期的细胞数目为基准，将DNA含量多于该正常细胞DNA含量的细胞数目与正常细胞数目之比作为判断标准，就能推断出分析对象细胞是否为癌变细胞。具体而言，在图12所示DNA含量直方图中，最左侧的山丘对应着DNA含量少的G0期或G1期的正常细胞，其右侧的三个山丘对应着DNA含量多于G0期或G1期正常细胞DNA含量的细胞。上述右侧的三个山丘被认为是相当于图13所示S期的细胞（中间的两个山丘）或G2/M期的细胞（最右侧山丘），但如果分析对象细胞含有癌变细胞，这种癌变细胞也包含在上述两个山丘中。而且癌变细胞的数目越多上述三个山丘就越大。在图12中，为了便于理解例示了三个山丘，但实际上针对采自受检者的宫颈上皮组织制作DNA含量直方图时，能否形成山丘取决于受检者的状态。

因此，用包含阳性样本和阴性样本的复数个临床样本进行实验和验证，由此就能选定用作判断标准的比例。在本实施方式中，从获得90%以上的灵敏度的观点出发，判断标准是DNA含量多于正常的G0期或G1期细胞（正常DNA含量范围内的细胞）的细胞（异常DNA含量范围内的细胞）的数目与该正常细胞的数目之比是否在16%（第五阈值）以上。即，将判断样本需要复检（阳性）还是不需要复检（阴性）的临界值设为16%。16%这一临界值在本发明中无特别限定，可以在考虑临床检查的灵敏度与特异度的平衡后适当设定。

在步骤S10，如果判断DNA含量多于正常DNA含量范围内的细胞（第一组）的细胞（第二组）的数目与该正常细胞数目之比在16%以上（在步骤S10为是），则在步骤S11判断分析中使用的测定试样需要复检（阳性），其结果如图15所示，显示在数据处理装置4的显示部件28上。另一方面，如果在步骤S10判断上述比未达到16%（在步骤S10为否），则在步骤S12判断分析所使用的测定试样无需复检（阴性），其结果如图16所示显示在数据处理装置4的显示部件28上。

在一种不进行本发明一实施方式的癌变信息提供装置1中提取分析对象细胞的测定数据的作业（步骤S7）及步骤S8的作业，而是直接就全部单个上皮细胞绘制DNA含量直方图的装置中，对采自CIN3（组织学诊断判断为癌变初期阶段的状态）受检者宫颈上皮组织的细胞进行分析后绘制出图17所示直方图。

在一种不进行本发明一实施方式的癌变信息提供装置1中提取分析对象细胞的测定数据的作业（步骤S7）及步骤S8的作业，而是直接就全部单个上皮细胞绘制DNA含量直方图的装置中，对采自NILM（细胞诊断为正常的状态）受检者宫颈上皮组织的细胞进行分析后获得如图18所示直方图。

在本发明一实施方式的癌变信息提供装置1中，对采自CIN3（组织学诊断判断为癌变初期阶段的状态）受检者宫颈上皮组织的细胞进行分析时，在步骤S9绘制出图19所示的直方图。在本发明一实施方式的癌变信息提供装置1中，分析采自NILM（细胞诊断判断为正常的状态）受检者宫颈上皮组织的细胞时，在步骤S9绘制出图20所示直方图。

根据图17的直方图计算出DNA含量多于正常DNA含量范围（2C）内的细胞的DNA含量（S期以上）的细胞数目与该正常细胞数目之比，为3.2%。根据图18的直方图计算出DNA含量多于正常DNA含量范围（2C）内的细胞的DNA含量（S期以上）的细胞数目与该正常细胞的数目之比，为1.1%。由此得知，不进行分析对象细胞的测定数据提取作业（步骤S7）和步骤S8的作业，直接针对所有单个上皮细胞绘制DNA含量直方图，在CIN3受检者和NILM受检者中，DNA含量多于正常DNA含量范围（2C）内细胞的DNA含量（S期以上）的细胞数目与该正常细胞的数目之比很难出现大的差距。

相比之下，根据图19的直方图，计算出DNA含量多于正常DNA含量范围（2C）内的细胞的DNA含量（S期以上）的细胞数目与该正常细胞的数目之比，为57.9%。根据图20的直方图，计算出DNA含量多于正常DNA含量范围（2C）内的细胞的DNA含量（S期以上）的细胞数目与该正常细胞的数目之比，为7.4%。由此得知，进行分析对象细胞的测定数据提取作业（步骤S7）和步骤S8之后再绘制DNA含量直方图的话，在CIN3受检者和NILM受检者中，DNA含量多于正常DNA含量范围（2C）内的细胞的DNA含量（S期以上）的细胞数目与该正常细胞的数目之比很容易出现大的差距。如本发明所述地将判断样本需要复检（阳性）还是不需要复检（阴性）的临界值设为16%的话，CIN3的受检者被判断为需要复检（阳性），NILM的受检者被判断为不需要复检（阴性），与组织学诊断或细胞诊断的判断结果一致。

[其他变形例]此次公开的实施方式在所有方面均为例示，绝无限制性。本发明的范围不受上述实施方式的说明所限，仅由权利要求的范围所示，而且包括与权利要求具有同样意义或同等范围的内容下的所有变形。

比如，在上述实施方式中，获取前向散射光强度的波形宽度作为反映细胞大小的数据，但也可以采用前向散射光强度的波形的峰值或前向散射光强度的波形与一定基线所划定的区域的面积。在上述实施方式中，获取侧向荧光强度的波形宽度作为反映细胞核大小的数据，但也可以采用侧向荧光强度的波形峰值或侧向荧光强度的波形与一定的基线所划定的区域的面积。

在上述实施方式中，若步骤S6判断为否，则输出无法进行判断的信息，不进行步骤S11和步骤S12的处理，但本发明不限于此。本发明也可以如下设置：即使步骤S6判断为否，也照样进行步骤S7以后的处理，在步骤S11或步骤S12所输出的判断结果中附加上表示细胞数目很少的信息，然后进行输出。在上述实施方式中，若步骤S8判断为否，则输出无法进行判断的信息，不进行步骤S11和步骤S12的处理，但本发明不限于此。本发明也可以如下设置：即使步骤S8判断为否，也照样进行步骤S9以后的处理，在步骤S11或步骤S12所输出的判断结果中附加上表示细胞数很少的信息，然后进行输出。

在上述实施方式中，利用从流式细胞仪获得的光学信息来获取相当于细胞核宽度·细胞DNA含量、细胞质宽度的数据，但也可以通过分析拍摄部件拍摄的细胞图像来获取相当于细胞核宽度·细胞DNA含量、细胞质宽度的数据。

在上述实施方式中，用图12所示直方图，以DNA含量多于正常的G0期或G1期细胞的DNA含量的细胞数目与该正常细胞的数目之比作为判断标准，分析提取的细胞，但也可以不用直方图进行分析，取而代之，用图7所示散点图进行细胞分析。具体而言，也可以如下设置：根据图7所示散点图的中层细胞、副基底细胞和基底细胞出现的区域（在图7中为四边形内用三角形划定的区域）与癌变细胞出现的区域（在上述四边形中除去三角形区域以外的区域）中所包括的细胞之比判断测定试样需要复检（阳性）或是不需要复检（阴性）。上述四边形内的区域是利用细胞大小及N/C比的各参数所提取的细胞出现的区域，在上述三角形区域中三角形斜边与横坐标的交点R可以如下设定：用包括阳性样本和阴性样本的复数个临床样本进行实验和验证来设定。上述四边形内除去三角形区域以外的区域是DNA含量异常多的细胞出现的区域，如果属于此区域的细胞的比在一定值以上，则可以判断该测定试样需要复检（阳性）。

在上述实施方式中，采用细胞核宽度/细胞质宽度作为N/C比，但也可以采用细胞核面积/细胞质面积作为N/C比。

在上述实施方式中，在提取分析对象细胞的提取步骤中，提取中层细胞、副基底细胞和基底细胞，但本发明不限于此，只要含有一部分比表层细胞更靠近基底一侧的细胞即可。具体来说，比如可以提取副基底细胞和基底细胞，也可以提取中层细胞和副基底细胞，可以只提取中层细胞，也可以只提取副基底细胞，还可以只提取基底细胞。提取的细胞中，除了中层细胞等细胞以外也可以含有一部分表层细胞。

在上述实施方式中，将N/C比与细胞质宽度两者作为用于进行提取的参数，但也可以只将N/C比作为用于进行提取的参数。此时，癌变细胞的检测灵敏度虽然稍有下降，但由于从用于进行提取的参数中去除了细胞质宽度，因此能够提高分析速度。如图7所示，以N/C比为横坐标，以细胞质宽度为纵坐标，则测定试样中的细胞呈右侧下垂的新月形分布，故适当地选定作为临界值的N/C比，就能提取与以N/C比和细胞质宽度两者作为参数时所提取的细胞数目几乎相同数目的细胞。

在上述实施方式中，以宫颈的上皮细胞作为分析对象，也可以以口腔等其他部位的细胞作为分析对象。

符号说明

1、癌变信息提供装置2、测定装置3、流式细胞仪（光学检测部件）4、数据处理装置5、信号处理线路16、测定控制部件17、驱动部件18、传感器20、微处理器25、外部通信控制器26、拍摄部件27、主机27a、CPU28、显示部件29、输入部件51、流动室。