以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂

摘要

本发明的目的是提供能够预防因骨桥蛋白产生亢进而引起的疾病的骨桥蛋白产生抑制剂。本发明的骨桥蛋白产生抑制剂以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分。盘基网柄菌吡喃酮衍生物优选的是由化学式1或化学式2表示的化合物，二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物优选的是化学式3或化学式4表示的化合物。

说明书

技术领域

本发明涉及能够预防或改善因骨桥蛋白(osteopontin；OPN)产生亢进而引起的疾病 (例如，癌转移)的、以盘基网柄菌吡喃酮(Dictyopyrone)衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃 酮(Dihydrodictyopyrone)衍生物为有效成分的OPN产生抑制剂。

背景技术

OPN是被鉴定为构成钙沉积的骨组织的基质(matrix)的主要非骨胶原性蛋白质且分 子量为41kDa的分泌型酸性磷酸化糖蛋白质。已确认其在乳汁、尿、肾小管、破骨细胞、 成骨细胞、巨噬细胞、活化T细胞以及较多的肿瘤组织中表达广泛。OPN被认为在骨基质 中发挥连接破骨细胞和羟磷灰石的架桥的作用(非专利文献1)，但是除此以外还报告称具 有参与细胞粘着、细胞迁移、一氧化氮产生的抑制、肿瘤或免疫系统的多种功能。

OPN表达与肿瘤的发展相关，并且表示与癌转移的相关性。在肺癌、肝癌、乳癌或 前列腺癌的患者的血浆中检测出OPN(非专利文献2)，报告称与正常部位相比癌部位的 OPNmRNA上升(非专利文献3)，并且报告称神经胶质瘤中的OPN表达也具有与恶性度相 关的倾向(非专利文献4)。OPN表达与肿瘤的相关在动物模型中也被确认(非专利文献 5)。根据这样的与OPN相关的最近的见解认为抑制促进肿瘤细胞的转移以及侵袭的OPN的 产生是防止癌转移的抗癌剂的一种新靶点(非专利文献6)。

现有技术文献：

非专利文献：

非专利文献1：MiyauchiA,AlvarezJ,GreenfieldEM,TetiA,GranoM,ColucciS,Zambonin- ZalloneA,RossFP,TeitelbaumSL,ChereshD,HruskaKA.(1991)Recognitionofosteopontinand relatedpeptidesbyanalphavbeta3integrinstimulatesimmediatecellsignalsinosteoclasts.JBiol Chem266,20369-20374.

非专利文献2：SengerDR,PerruzziCA,GraceyCF,PapadopoulosA,TenenDG.(1988)Secreted phosphoproteinsassociatedwithneoplastictransformation:closehomologywithplasmaproteins cleavedduringbloodcoagulation.CancerRes48,5770–5774.

非专利文献3：BrownLF,PapadopoμLos-SeigiouA,BrygidaB,ManseauEJ,TognazziK, PerruzziCA,DvorakHF,SengerDR.(1994)Osteopontinexpressioninhumancarcinoma.AmJ Pathol.145,610–623.

非专利文献4：SaitohY,KuratsuJI,TakeshimaH,YamamotoS,UshioY(1995)Expressionof osteopontininhumanglioma.LabInvest72,55-63.

非专利文献5：SuzukM,MoseE,GalloyC,andTarinT(2007)OsteopontinGeneExpression DeterminesSpontaneousMetastaticPerformanceofOrthotopicHumanBreastCancerXenografts. AmJPathol171,682–692.

非专利文献6：WeberGF(2001)Review:Themetastasisgeneosteopontin:acandidatetargetfor cancertherapy.BiochimBiophysActa1552,61-85.

非专利文献7：KikuchiH,SasakiK,SekiyaJ,MaedaM,AmagaiA,KuboharaYandOshimaY (2004)DihydrodictyopyroneAandC:newmembersofdictyopyronefamilyisolatedfrom DictyosteliumcellularslimemoldsBioorgMedChem12,3203-3214.

非专利文献8：MatsuuraM,SuzukiT,SuzukiM,TanakaR,ItoEandSaitoT(2011)Statin- mediatedreductionofosteopontinexpressioninducesapoptosisandcellgrowtharrestinovarian clearcellcarcinoma.OncolRep25,41-47.

非专利文献9：HaruhisaKikuchi,KojiNakamura,YuzuruKubohara,NaomiGokan,Kohei Hosaka,YasuoMaedadandYoshiteruOshima,TetrahedronLetters48(2007)5905-5909.。

发明内容

发明要解决的问题：

如上所述，通过抑制OPN的产生，以此可以防止癌转移。作为具有OPN产生抑制作用的药 物，已知有作为PPAR-γ(PeroxysomeProliferator-ActivatedReceptor-γ；过氧化物酶体增 殖物激活受体γ)激动剂的胰岛素抵抗性改善药(曲格列酮、匹格列酮、罗格列酮)、非甾 体抗炎药(例如，吲哚美辛或布洛芬)以及作为HMG-CoA还原酶抑制剂的他汀类高胆固醇 血症治疗药(例如，瑞舒伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他 汀、西立伐他汀、匹伐他汀以及美伐他汀)。

另一方面，细胞性粘菌是广泛分布于土壤表层中的一种原生生物，在生态循环中同 时具备动物性与植物性、单细胞与多细胞这样的较大不同的性质，并且包括如细胞运动、细 胞质分裂或分化等的构成多细胞生物的产生系统的主要过程。与天然化学中以往经常利用的 生物种大为不同，因此期待产生各种新型化合物。

本发明的目的是提供能够预防因OPN产生亢进而引起的疾病(例如癌转移)的OPN 产生抑制剂。

解决问题的手段：

本发明人等为了发现抑制OPN的基因表达的化合物，而使用在OPN启动子的控制下表达报 告基因的荧光素酶的细胞株，并且将如盘基网柄菌(D.discoideum)那样的细胞性粘菌的二 次代谢产物作为对象进行了筛选。

其结果是，本发明人等在盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生 物中发现了抑制荧光素酶表达的化合物。

本发明人等又发现了这样的抑制在OPN启动子控制下的荧光素酶活性的化合物会降 低人小细胞肺癌细胞株A549或人肝癌细胞株HepG2所产生的OPN量。本发明人等进一步 通过细胞划痕实验(Wound-Healingassay)发现盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄 菌吡喃酮衍生物抑制OPN的生理功能的细胞迁移能力，并且通过基质胶侵袭实验发现盘基 网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物抑制细胞的转移以及侵袭能力，从而 完成本发明。

具体而言，本发明涉及以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为 有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂。

报告称在盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物中存在具有抑 制人白血病细胞K562细胞的增殖的活性的化合物(非专利文献7)，但是OPN产生抑制剂 作用至今未被报道。

作为盘基网柄菌吡喃酮衍生物，优选的是化学式1或化学式2表示的化合物。

[化学式1]

[化学式2]

作为二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物，优选的是化学式3或化学式4表示的化合物。

[化学式3]

[化学式4]

发明效果：

本发明的以盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的OPN 产生抑制剂是具有不同于胰岛素抵抗性改善药或他汀类高胆固醇血症治疗药的作用机理的 OPN产生抑制剂。

附图说明

图1示出通过添加化合物3(化学式3示出的化合物)而产生的A549细胞的OPN产 生抑制效果的图表；

图2示出通过添加化合物3(化学式3示出的化合物)而产生的HepG2细胞的OPN产生抑 制效果的图表；

图3示出通过添加化合物3(化学式3示出的化合物)而产生的A549细胞的创伤恢复抑制 效果的图表；

图4示出通过添加化合物3(化学式3示出的化合物)而产生的A549细胞的基质侵袭抑制 效果的图表；

图5示出相对于由SVS(simvastatin；辛伐他汀)所产生的OPN产生量抑制效果的、通过添 加MVA(mevalonicacid；甲羟戊酸)而产生的恢复效果的图表；

图6示出相对于由化合物3所产生的OPN产生量抑制效果的、通过添加MVA而产生的影 响的图表。

具体实施方式

关于本发明的实施形态，适当参照附图进行说明。本发明不限于以下记载。

＜A：OPN启动子控制下的荧光素酶表达抑制效果的确认方法＞

在pGL-3basic载体(Promega)的多克隆位点中组入人OPN启动子序列(从－765至23) 而形成的报告载体pOPN1-luc在转染至动物细胞中时表达荧光素酶。将该pOPN1-luc与表达 嘌呤霉素耐性基因(puromycin-N-acetyl-transferasegene)的pPUR(Clontech)一起转染至 人非小细胞肺癌细胞株A549，并且选择了能够在嘌呤霉素添加培养基中增殖且表达荧光素 酶的细胞。将选择的细胞命名为A549/OPNluc细胞，并且使用于后述的OPN启动子控制下 的荧光素酶表达抑制效果的观察中。

将被试化合物添加到A549/OPNluc细胞的培养液中，并且观察了对细胞内的荧光素 酶表达量的影响。在这里，考虑到在被试化合物具有细胞毒性或细胞增殖抑制效果的情况 下，因依赖于被试化合物的浓度的活细胞数量的减少而总荧光素酶表达量下降，无法正确地 评价被试化合物在OPN启动子控制下的荧光素酶表达抑制效果。因此，首先实施作为通过 显色测定对细胞增殖能力或细胞生存能力进行定量的方法的WST(water-solubletetrazolium salt；水溶性四氮唑盐)实验，并且求出被试化合物对于细胞增殖的IC50(50％细胞增殖抑 制浓度)。之后，实施荧光素酶活性测定，求出被试化合物对于OPN启动子控制下的荧光素 酶表达的EC50(50％荧光素酶表达抑制浓度)。

A1)WST实验

使A549/OPNluc细胞在添加了10％胎牛血清(FCS)以及1％青霉素-链霉素(P/S)的 DMEM培养基中达到3×10⁴cells/mL并悬浮于其中，并且将它向96孔板的各孔内分别注入 100μL。由于将试验重复实施三次(triplicate)，因此作为对照组以及各浓度的被试化合物 添加用孔，每个分别准备了三个孔。在分注后，将96孔板在二氧化碳培养器(37℃， 5％CO₂条件下)中培养24±4小时。

将被试化合物通过二甲基亚砜(dimethylsulfoxide；DMSO)形成50mmol/L溶液， 并且保存在－80℃。为了WST实验，准备了将该被试化合物溶液通过DMSO稀释为两倍稀 释系列(通常是0.31mmol/L～20mmol/L的范围)而浓度分别以两倍变化的被试化合物溶 液。

在加入了细胞悬浮液的各孔内分别注入0.5μL仅DMSO(对照)或者稀释的被试化 合物(待测样品)的溶液(稀释200倍)。通过涡旋混合器(vortexmixer)混合后，将96孔 板在二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中培养48±4小时。之后，将预混WST-1试 剂(PremixWST-1Reagent)(TAKARABIO)分别在各孔内添加10μL。在使用涡旋混合器 混合后，将96孔板在37℃，5％CO₂条件下进行培养(Incubation)，并且使用酶标仪(Bio- Rad；Benchmark或ThermoScientific；VarioskanFlash)测定60分钟后或120分钟后的吸光 值(450nm)。

将对照的孔以及各浓度的待测样品孔的吸光值分别输入至Excel文件中，求出各浓度 的待测样品孔的吸光值相对于对照的平均吸光值的百分数。根据求出的值通过最小二乘法求 出近似曲线式，计算IC50。

A2)荧光素酶实验

在加入了细胞悬浮液的各孔中分别添加仅DMSO(对照)或者稀释的被试化合物(待测样 品)的溶液0.5μL而稀释200倍，在通过涡旋混合器混合后，进行与上述WST实验相同的 操作直至二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中培养48±4小时的工序为止。

将荧光素酶检测系统(luciferaseassaysystems)(Promega：Cat#E1500)中含有的荧 光素酶实验底物(luciferaseassaysubstrate；以下标为LAS)用荧光素酶实验缓冲液 (LuciferaseAssayBuffer；LAB)溶解，配制出荧光素酶试剂。将5×细胞培养裂解试剂 (CellCultureLysisReagent；以下标为CCLR)用水稀释5倍，配制出1×CCLR。

在培养48±4小时后，完全去除各孔的培养基，并且分别注入50μL1×CCLR。在室 温中静置30分钟后，将各孔内的1×CCLR作为测定用试样。在化学发光测定用管内加入荧 光素酶试剂100μL，在其中添加测定用试剂20μL并进行混合，使用调谐器设计发光检测 仪20/20(TunerDesignLuminometer20/20)(Promega)测定了化学发光(相对发光强度： RLU)。

将对照的RLU以及各浓度的待测样品的RLU分别输入至Excel文件中，求出各浓度 的待测样品的RLU相对于对照的RLU的平均值的百分数，并且根据该值通过最小二乘法求 出近似曲线式，计算出EC50。

表1示出对于作为被试化合物的化学式1～化学式16所示的盘基网柄菌吡喃酮衍生 物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物通过WST实验以及荧光素酶实验计算出的IC50以及 EC50。

[化学式5]

[化学式6]

[化学式7]

[化学式8]

[化学式9]

[化学式10]

[化学式11]

[化学式12]

[化学式13]

[化学式14]

[化学式15]

[化学式16]

在这里，化学式1、2、5～8所示的化合物是按照非专利文献7中公开的制造方法制 造而成。化学式3、12、13、15～16所示的化合物是按照非专利文献9中公开的制造方法制 造而成。

[化学式4所示的化合物的制造方法]

将如非专利文献7的记载进行合成的5mg的(S)-3-十二酰基-5,6-二氢-4,6-二甲基-1H-吡啶-2- 酮((S)-3-dodecanoyl-5,6-dihydro-4,6-dimethyl-1H-pyridin-2-one)溶解于1ml的甲醇中。添加 1mg的钯碳(Pd5％)，并且在氢气氛下在室温搅拌2小时。将反应液过滤而去除钯碳，将其 滤液减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析，并且根据由己烷-乙酸乙酯(4:1)洗脱的组分得到 化学式4表示的化合物4mg。

将得到的化合物通过基于EIMS(electronimpactmassspectra；电子轰击质谱)法的 质量分析以及NMR(nuclearmagneticresonancespectroscopy；核磁共振波谱法)进行解析。 EIMS以及NMR的结果如下。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)d5.76(1H,br.s),3.52-3.64(1H,m), 3.05(1H,d,J＝11.2Hz),2.81(1H,dt,J＝17.8,7.5Hz),2.52(1H,dt,J＝17.8,7.4Hz),2.28-2.41 (1H,m),1.87(1H,dt,J＝13.0,2.3Hz),1.52-1.68(3H,m),1.23-1.36(16H,s),1.17(3H,d,J＝6.4 Hz),0.94(3H,d,J＝6.5Hz),0.88(3H,t,J＝6.4Hz)；EIMSm/z(rel.int)309[M]⁺(11),294(5), 182(10),169(13),127(100),112(55)。

[化合物9所示的化合物的制造方法]

将297mg的辛二酸单甲酯(subericacidmonomethylester)溶解于8mL的二氯甲烷中，并且 加入250mg的丙二酸环异丙酯(Meldrum’acid，米氏酸)、453mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基)碳二亚胺盐酸盐、以及19mg的4-二甲氨基吡啶后，在室温搅拌4小时。在反应液中 加入0.5M盐酸30mL，使用30mL的乙酸乙酯萃取三次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一 起，用60mL的水以及60mL的饱和食盐水分别洗涤后，使用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸 馏溶剂。将其残渣溶解于5mL的甲苯中，并且添加246mg的(2S,4S)-2,4-戊二醇，在120℃ 下搅拌2小时。在恢复至室温后，将反应液进行减压蒸馏，并且将残渣进行硅胶柱层析，由 被己烷-乙酸乙酯(3:1)洗脱的组分得到200mg的1-(1S,3S)-3-羟基-1-甲基丁基-10-甲基-3- 氧代癸二酸酯(1-(1S,3S)-3-hydroxy-1-methylbutyl10-methyl3-oxodecanedioate)。

将196mg的1-(1S,3S)-3-羟基-1-甲基丁基-10-甲基-3-氧代癸二酸酯溶解于8mL的二氯 甲烷中，并且依次添加109mg的N-甲基马林-N-氧化物(N-methylmorpholineN-oxide)、 311mg的粉末状的分子筛4A、以及11mg的过钌酸四内胺(tetrapropylammonium perruthenate)，在室温中搅拌5小时。过滤反应液，将其滤液进行减压蒸馏。将残渣进行硅 胶柱层析，由被己烷-乙酸乙酯(4:1)洗脱的组分得到133mg的1-(S)-1-甲基-3-氧代丁基- 10-甲基-3-氧代癸二酸酯(1-(S)-1-methyl-3-oxobutyl10-methyl3-oxodecanedioate)。

将126mg的1-(S)-1-甲基-3-氧代丁基-10-甲基-3-氧代癸二酸酯溶解于2mL的乙醇 中，添加41mg的乙醇钠，在室温搅拌10小时。将反应液注入至20mL的0.5M盐酸中，使 用20mL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一起，用40mL的水以及 40mL的饱和食盐水分别洗涤后，使用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏溶剂。将残渣进行硅 胶柱层析，由被己烷-乙酸乙酯(4:1)洗脱的组分得到88mg的甲基-(S)-8-(4,6-二甲基-2-氧 代-5,6-二氢-2H-吡喃-3-基)-8-氧代辛酸酯(methyl(S)-8-(4,6-dimethyl-2-oxo-5,6-dihydro-2H- pyran-3-yl)-8-Oxooctanoate)(化学式9表示的化合物)。

将得到的化合物通过基于EIMS(电子轰击质谱)法的质量分析以及NMR进行解 析。EIMS以及NMR的结果如下。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)d4.50-4.60(1H,m),3.67(3H, s),2.74(1H,dt,J＝17.3,7.4Hz),2.73(1H,dt,J＝17.3,7.4Hz),2.45(1H,ddq,J＝17.9,11.6,0.9 Hz),2.31(1H,dd,J＝17.9,3.8Hz),2.30(2H,t,J＝7.4Hz),2.01(3H,d,J＝0.9Hz),1.58-1.68 (4H,m),1.44(3H,d,J＝6.4Hz),1.30-1.38(4H,m)；EIMSm/z(rel.int)296[M]⁺(6),281(10), 265(11),246(14),181(20),168(83),153(100),109(30)。

[化合物10所示的化合物的制造方法]

按照非专利文献7的记载所合成的300mg的(S)-2-[1-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]- 异吲哚-1,3-二酮((S)-2-[1-Methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-isoindole-1,3-dione)溶解 于6mL的甲醇中，添加水合肼1038mg，加热回流6小时。恢复至室温后，在反应液中添加 1M氢氧化钠水溶液30mL，用30mL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在 一起，用60mL的水以及60mL的饱和食盐水分别洗涤后，使用无水硫酸钠进行干燥，减压 蒸馏溶剂。将其残渣溶解于6mL的甲苯中，并且添加565mg的5-丁酰-2,2-二甲基-1,3-二恶 烷-4,6-二酮(5-butanoyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4,6-dione)，加热回流15小时。恢复至室 温，将反应液进行减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析，由使用己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的 组分得到140mg的(S)-N-[l-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-3-氧代己酰胺((S)-N-[l- methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxohexanamide)。

将115mg的(S)-N-[l-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-3-氧代己酰胺溶解于80％ 醋酸水溶液4mL中，在室温下搅拌7小时。将反应液减压蒸馏，将残渣进行硅胶柱层析， 由使用己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到59mg的(S)-N-(1-甲基-3-氧代丁基)-3-氧代癸酰 胺((S)-N-(1-methyl-3-oxobutyl)-3-oxodecanamide)。

将11mg的(S)-N-(1-甲基-3-氧代丁基)-3-氧代癸酰胺溶解于1mL的乙醇中，添加5mg 的乙醇钠，在室温搅拌8小时。将反应液注入至10mL的0.5M盐酸中，使用10mL的乙酸 乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一起，用20mL的水以及20mL的饱和食盐水 分别洗涤后，使用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏溶剂。将残渣进行硅胶柱层析，由被己烷 -乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到4mg的(S)-3-丁酰-5,6-二氢-4,6-二甲基-1H-吡啶-2-酮((S)- 3-butanoyl-5,6-dihydro-4,6-dimethyl-1H-pyridin-2-one)(化学式10表示的化合物)。

将产物通过基于EIMS(电子轰击质谱)法的质量分析以及NMR进行解析。EIMS 以及NMR的结果如下。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)d5.45(1H,br.s),3.66-3.78(1H,m),2.71 (2H,t,J＝7.4Hz),2.31(1H,dd,J＝17.6,7.6Hz),2.23(1H,dd,J＝17.6,7.2Hz),1.93(3H,s),1.64 (2H,quint,J＝7.4Hz),1.24,(3H,d,J＝6.4Hz),0.94(3H,t,J＝7.4Hz)；EIMSm/z(rel.int)195 [M]⁺(19),180(100),152(54),109(22)。

[化合物11所示的化合物的制造方法]

将按照非专利文献7的记载合成的300mg的(S)-2-[1-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]- 异吲哚-1,3-二酮((S)-2-[1-Methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-isoindole-1,3-dione)溶解 于6mL的甲醇中，并且添加水合肼1038mg，加热回流6小时。恢复到室温后，在反应液中 添加1M氢氧化钠水溶液30mL，用30mL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部 合在一起，用60mL的水以及60mL的饱和食盐水分别洗涤后，使用无水硫酸钠进行干燥， 将减压蒸馏溶剂。将该残渣溶解于6mL的甲苯中，并且添加564mg的2,2-二甲基-5-辛酰基- 1,3-二恶烷-4,6-二酮(2,2-dimethyl-5-octanoyl-1,3-dioxane-4,6-dione)，加热回流15小时。恢 复至室温后，将反应液进行减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析，由被己烷-乙酸乙酯(2:1) 洗脱的组分得到51mg的(S)-N-[l-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-3-氧代癸酰胺((S)- N-[l-methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxodecanamide)。

将47mg的(S)-N-[l-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-3-氧代癸酰胺溶解于80％醋 酸水溶液3mL中，在室温下搅拌7小时。将反应液减压蒸馏，将残渣进行硅胶柱层析，由 被己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到38mg的(S)-N-(1-甲基-3-氧代丁基)-3-氧代癸酰胺 ((S)-N-(1-methyl-3-oxobutyl)-3-oxodecanamide)。

将23mg的(S)-N-(1-甲基-3-氧代丁基)-3-氧代癸酰胺溶解于2mL的N,N-二甲基甲酰胺 中，添加3mg的氢化钠(60％，分散在矿物油中)，在室温搅拌10小时。将反应液注入至 10mL的0.5M盐酸中，使用10mL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一 起，用20mL的水以及20mL的饱和食盐水分别洗涤后，使用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸 馏溶剂。将残渣进行硅胶柱层析，由被己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到9mg的(S)-5,6- 二氢-4,6-二甲基-3-辛酰基-1H-吡啶-2-酮((S)-5,6-dihydro-4,6-dimethyl-3-octanoyl-1H-pyridin- 2-one)(化学式11表示的化合物)。

将产物通过基于EIMS(电子轰击质谱)法的质量分析以及NMR进行解析。EIMS 以及NMR的结果如下。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)d5.52(1H,br.s),3.65-3.78(1H,m),2.72 (2H,t,J＝7.6Hz),2.31(1H,dd,J＝17.2,5.6Hz),2.23(1H,dd,J＝17.2,7.2Hz),1.92(3H,s),1.60 (2H,quint,J＝7.6Hz),1.23-1.35(8H,m),1.24(3H,d,J＝6.8Hz),0.87(3H,t,J＝7.0Hz)； EIMSm/z(rel.int)251[M]⁺(33),236(57),180(100),167(69),152(76),109(23)。

[化合物14所示的化合物的制造方法]

将按照非专利文献7的记载合成的10mg的3-十二酰基-5,6-二氢-4,6,6-三甲基-2H-吡喃-2-酮 (3-dodecanoyl-5,6-dihydro-4,6,6-trimethyl-2H-pyran-2-one)溶解于1mL的乙酸乙酯中，添 加1mg的20％氢氧化钯-碳，在氢气气氛下，在室温中搅拌20小时。过滤反应液而去除钯 碳，将其滤液进行减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析，由被己烷-乙酸乙酯(19:1)洗脱的组 分得到9mg的化学式14所示的化合物。

将产物通过基于EIMS(电子轰击质谱)法的质量分析以及NMR进行解析。EIMS 以及NMR的结果如下。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)d3.13(1H,d,J＝10.8Hz),2.87(1H,dt,J＝ 14.8,7.2Hz),2.59-2.67(1H,m),2.55(1H,dt,J＝14.8,6.8Hz),1.84(1H,dd,J＝13.4,4.0Hz), 1.57-1.66(2H,m),1.51(1H,t,J＝13.4Hz),1.43(3H,s),1.42(3H,s),1.25-1.31(16H,m),0.95(3H, d,J＝6.4Hz),0.88(3H,t,J＝6.6Hz)；EIMSm/z(rel.int)324[M]⁺(3),309(6),84(100)。

[表1]

关于化学式1、化学式2以及化学式8所示的盘基网柄菌吡喃酮衍生物、和化学式 3、化学式4、化学式15以及化学式16所示的二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物，EC50浓度为 IC50浓度的1/2以下。尤其是，对于化学式1～4所示的化合物(化合物1～化合物4)， EC50浓度小于30μM，在低浓度下将OPN启动子控制下的荧光素酶(OPNLuc)表达抑制 50％。

＜B：化合物3对于人非小细胞肺癌细胞株A549以及人肝癌细胞株HepG2的OPN 产生的抑制效果＞

如上所述证实了在盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物中，存在以抑 制50％细胞增殖的浓度(IC50)的1/2以下的浓度将OPN启动子控制下的荧光素酶表达抑 制50％的化合物。因此，对于EC50浓度最低且IC50浓度示出EC50浓度的两倍以上的化学 式3所示的化合物(化合物3)进行了是否能够实际抑制由癌细胞株产生的OPN量的确认 试验。

将化合物3加入至人非小细胞肺癌细胞株A549以及人肝癌细胞株HepG2的培养液 中，将培养两天后的培养上清中的OPN量使用人骨桥蛋白免疫检测试剂盒(Human OsteopontinImmunoassayKit)(R&Dsystems)进行测定，通过与化合物3无添加组(对照 组)的OPN量进行比较，以此进行确认试验。

化合物3还具有细胞增殖抑制效果，因此为了正确评价OPN产生量抑制效果，而在 去除培养上清后孔内剩余的细胞中添加在荧光素酶实验中使用的1×CCLR液而配制出细胞 裂解液，并且将其蛋白量使用BCA蛋白定量试剂盒(BCAproteinassaykit)(Thermo Scientific)进行测定。对于化合物3的添加对OPN产生量的影响，通过每1mg蛋白量的 OPN量进行比较。

B1)试样配制方法

首先，使A549细胞或HepG2细胞在分别添加了10％FCS、1％P/S的DMEM培养基中悬浮 并达到4×10⁴cells/mL，并且向24孔板的各孔内分别注入500μL。由于将试验重复实施三 次，因此将对照以及各浓度的被试化合物添加组分别准备三孔。将24孔板在二氧化碳培养 器(37℃，5％CO₂条件下)内培养24±4小时。

将作为被试化合物的化合物3使用DMSO制成50mmol/L溶液，并且保存在－ 80℃。将该化合物3溶液使用DMSO进行稀释，分别配制成3.75mmol/L、7.5mmol/L以及 15mmol/L的浓度。在培养A549细胞的各孔内，将化合物3的7.5mmol/L溶液或15mmol/L 溶液分别添加2μL。在对照孔内仅分别添加2μLDMSO。

在培养HepG2细胞的各孔内分别添加化合物3的3.75mmol/L溶液或7.5mmol/L溶液 2μL。在对照孔内仅分别添加2μLDMSO。

将24孔板前后左右摇动，将孔内的溶液混合后，在二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中培养48±4小时。之后，将培养上清全部转移至1.5mL管内，在留下细胞的孔内 添加500μLD-PBS(-)。

将24孔板轻轻地摇动后，去除D-PBS(-)，并且向各孔内分别注入200μL的将在荧 光素酶实验中使用的5×CCLR用水稀释5倍而配制出的1×CCLR。之后，将24孔板放置 于摇摆式振荡器(rockingshaker)中摇摆15分钟。

从摇摆15分钟后的24孔板的各孔中将细胞裂解液转移至1.5mL管内，并且为了去 除细胞碎片等的夹杂物而通过微量高速冷却离心机在4℃、15000rpm下离心1分钟。将得到 的上清作为蛋白量测定用试样。

另一方面，为了去除如细胞碎片等的夹杂物而将转移至1.5mL管内的培养上清通过 微量高速冷却离心机在4℃、15000rpm下离心1分钟。将得到的上清作为ELISA用试样。

B2)OPN蛋白量的测定：

将ELISA用试样如下进行稀释；

A549细胞(稀释20倍)：试样5μL+培养基95μL

HepG2细胞(稀释80倍)：试样2μL+培养基158μL。

在包含于ELISA试剂盒中的OPN标准品的小瓶(vial)中加入1mL水，平稳地混 合，在室温中静置15分钟而配制出200ng/mL的OPN标准品。然后，如表2所示，将OPN 标准品用包含于试剂盒中的稀释液RD5-24进行依序稀释。

[表2]

准备包含于试剂盒中的所需数量的OPN微孔板(microplate)和RD1-6，向孔中分别 注入100μLRD1-6。将稀释的OPN标准品(小瓶A～H)以及试样50μL分别进一步添加 于已添加RD1-6的孔内。之后，将孔上部用密封件覆盖，在室温下静置2小时。在这期 间，用水稀释包含于试剂盒中的浓缩洗涤缓冲液(washbufferconcentrate)，配制出洗涤缓冲 液(washbuffer)。

在静置2小时后，去除各孔内的液体。向各孔内分别注入250μL洗涤缓冲液后，去 除洗涤缓冲液，将孔进行洗涤。将该洗涤操作进行四次。

在各孔中分别注入200μLOPN结合物(conjugate)。然后，将孔上部用密封件覆 盖，在室温下静止两个小时。在这期间，将包含于试剂盒中的显色剂A(ColorReagentA) 和显色剂B(ColorReagentB)进行等量混合，从而配制出底物溶液(SubstrateSolution)。

在静置两个小时后，去除各孔内的液体。向各孔中分别注入250μL洗涤缓冲液后， 去除洗涤缓冲液，将孔进行洗涤。将该洗涤操作进行了四次。

向各孔内分别注入200μL底物溶液，并且在遮光下室温中静置30分钟。之后，在 各孔内分别添加50μL的包含于试剂盒中的终止液(stopsolution)，并且通过涡旋混合器平 稳地混合至孔的全部液体从蓝色变成黄色。在混合后，使用酶标仪(microplateReader) (Bio-Rad；Benchmark或ThermoScientific；VarioskanFlash)测定吸光值(450nm以及 570nm)。进行从所有的测定数据的OD450nm减去OD570nm的值的运算，以后的计算使 用这一值。

根据标准曲线样品的吸光值制作标准曲线。使用标准曲线的数学式根据各样品的吸 光值算出OPN蛋白量。

B3)细胞中的总蛋白量测定：

将蛋白量测定用试样10μL和水90μL进行混合，稀释10倍。如表3所示用水稀释BSA 溶液而配制出标准曲线样品。

[表3]

将包含于蛋白测定用试剂盒中的BCA试剂A和BCA试剂B(50:1)进行混合，配 制出工作试剂(WorkingReagent)。向96孔板中分别注入标准曲线样品(小瓶A～F)以及 稀释10倍的蛋白测定用试样各25μL。由于试验重复实施两次，因此将对照组以及各浓度 的被试化合物添加组分别准备两个孔。

向各孔内分别添加200μL工作试剂，并且通过涡旋混合器混合30秒钟。以60℃加 热30分钟后，在室温下静置15分钟。之后，使用酶标仪(Bio-Rad；Benchmark或Thermo Scientific；VarioskanFlash)测定吸光值(550nm)。

根据标准曲线样品的吸光值制作标准曲线，根据标准曲线的数学式算出各孔的稀释 的试样的总蛋白浓度。此外，在总蛋白浓度上乘以稀释倍数(10倍)，算出试样的总蛋白浓 度。

(OPN(蛋白)量的显示)

将OPN量(每1mL培养上清的量)换算成以ELISA测定用的试样的总量(0.5mL)为单位 的值。将该换算值除以与求出了OPN量的试样相同的孔的蛋白测定用试样总量(0.2mL)中 的蛋白量，从而将OPN量换算成每1mg细胞总蛋白的值。根据该每1mg蛋白的OPN量研 究了给予化合物3的影响。

(统计处理)

在OPN量的统计处理中使用Excel统计Statcel3。在Excel文件上，通过将添加了作为被试 化合物的化合物3的试样的OPN量与对照的OPN量之间的比较而进行了Dunnett检验。

图1示出通过添加化合物3而产生的A549细胞的OPN产生抑制效果的图表。化合 物3被证实了在浓度为30μmol/L时小于5％的危险比下，在浓度为60μmol/L时小于1％的 危险比下，与对照组(control)相比显著抑制A549细胞的OPN产生。

图2示出表示通过添加化合物3而产生的HepG2细胞的OPN产生抑制效果的图表。 化合物3被证实了在浓度为15μmol/L以及浓度为30μmol/L时，在小于1％的危险比下， 与对照组相比显著抑制HepG2细胞的OPN产生。尤其是，在浓度为30μmol/L时，OPN产 生量与对照组相比减少一半以下。

根据图1以及图2，化合物3被证实了显著降低人小细胞肺癌细胞株A549以及人肝 癌细胞株HepG2所产生的OPN量。

＜C：化合物3对于人非小细胞肺癌细胞株A549的创伤治愈能力的抑制效果＞

抑制OPN启动子控制下的荧光素酶表达的化合物3实际上抑制作为蛋白的OPN产生由图1 以及图2所示的实验结果得到确认。作为下一步，确认作为被试化合物的化合物3是否抑制 因OPN产生而在细胞中产生的生理功能。作为确认方法中的一种，进行细胞的划痕试验 (Wound-Healingassay)。该试验是对于检验细胞迁移能力的方法来说公知的方法。在将单 层培养的细胞通过移液管的梢端等局部剥离细胞时，伤口的周围的细胞移动(迁移)而填充 伤口的部分，通过在培养液中添加被试化合物，以此观察是否对该功能产生影响。

C1)划痕试验(Wound-Healingassay)方法

使人非小细胞肺癌细胞株A549在添加了10％FCS、1％P/S的DMEM培养基中悬浮并达到 3.5×10⁵cells/mL。向24孔板的各孔内分别注入500μL(1.75×10⁵cells)细胞悬浮液。由于 将试验重复实施三次，因此作为对照以及各浓度的被试化合物添加用孔，分别准备三个孔。 在分注后，将24孔板在二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中培养24±4小时。

在培养后，从全部孔中去除培养基。将在DMEM中添加0.1％牛血清白蛋白(BSA) 以及1％P/S而成的培养基(无血清培养基)向全部孔内分别注入500μL。将板向前后左右 摇动后，再一次从全部孔中去除培养基。在去除培养基后，向全部的孔内分别注入500μL 无血清培养基。

将作为被试化合物的化合物3用DMSO制成50mmol/L溶液，并且保存在－80℃。 将该化合物3溶液用DMSO进行稀释，分别配制为3.125mmol/L以及6.25mmol/L的浓度。 在培养A549细胞的各孔内分别添加2μL化合物3的3.125mmol/L或6.25mmol/L的溶液。 在对照孔内仅分别添加2μLDMSO。

将24孔板向前后左右摇动，在混合孔内的溶液后，在二氧化碳培养器(37℃， 5％CO₂条件下)中培养24±4小时。

在显微镜下观察24孔板内的细胞，在确认是100％汇合度后，使用20μL用微型移 液器吸头的梢端在板底面的细胞上，每个孔划出3处刮伤。作为显微镜，使用安装有CCD 摄像系统的Retiga-2000Fast1394Color(QImaging)的倒置型研究显微镜IX71(奥林巴 斯)。

在显微镜下观察创伤部，并且以使创伤部纳入图像中的形式调节拍摄。倍率设定为 40倍(目镜：×10，物镜：×4)。在拍摄后，将24孔板在二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中培养48±4小时。

在培养后，用显微镜观察创伤部，以使创伤部纳入图像中的形式调节拍摄。倍率设 定为40倍(目镜：×10，物镜：×4)。

使用Image-ProPlus7.0J(MediaCybernetics公司)并基于拍摄的图像确认创伤部的面 积。然后，基于如下计算式：

创伤恢复率(％)＝100-[创伤两天后的创伤面积/刚创伤后的创伤部面积]×100，计算出创伤 恢复率(％)。算出对照组以及两种浓度的化合物3给药组的各自的创伤恢复率(％)的平 均值。又，还算出相对于对照组的创伤恢复率的化合物处理组的创伤恢复率(％)。

C2)统计处理：

对于创伤恢复率的算出值的统计处理，使用Excel统计Statcel3在Excel文件上将全部的化 合物3给药处理组的创伤恢复率与对照比较而进行Dunnett检验，以此实施所述统计处理。

图3示出显示添加化合物3时获得的A549细胞的创伤恢复抑制效果的图表。化合物 3在浓度为12.5μmol/L时未被认为与对照组之间在创伤恢复率上有差异，但是在25μmol/L 时，在小于1％的危险比下被认为与对照组之间在创伤恢复率上有显著差异。即，化合物3 被证实在浓度为25μmol/L时显著抑制A549细胞的创伤恢复。

＜D：化合物3对于人非小细胞肺癌细胞株A549的迁移侵袭能力的抑制效果＞

作为研究被试化合物是否抑制因OPN产生而在细胞中产生的生理功能的第二次的试验，进 行了基质侵袭试验(Matrix-Invasionassay)。在该试验中准备包被有作为细胞外基质成分的 胶原蛋白或层粘连蛋白(Matrigel，BDBioscience公司)且具有φ8μm的细孔(小孔)的 膜贴在底部的杯(插入皿(insert))、和插入该插入皿的24孔板。将悬浮于无血清培养基中 的细胞放入于内侧的插入皿内，在外侧的24孔板的各孔内注入添加了诱导细胞的迁移以及 侵袭的物质(在这里是胎牛血清)的培养基，并且观察了通过插入皿的包被基质胶 (matrigel)的膜后流出至外侧的孔的细胞数量。

基质胶是细胞培养用的人工基底膜基质，并且是从富含细胞外基质蛋白质的EHS (Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜调制品。基质胶的主成分是层 粘连蛋白、胶原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparansulfateproteoglycan)以及内联蛋 白(entactin)/巢蛋白(nidogen)。基质胶中还包含TGF-β、上皮细胞增殖因子、胰岛素样 生长因子、纤维芽细胞增殖因子、组织纤溶酶原激活因子以及EHS肿瘤中自然产生的其他 增殖因子。

具体而言，在侵袭至膜的外侧的A549细胞中导入荧光色素后，从膜上剥离，并且测 定其荧光强度。与此同时，在数量为已知的标准曲线制作用细胞中也导入荧光色素，由其荧 光强度制作标准曲线。然后，根据近似曲线式求出细胞数为未知的被试样品的侵袭细胞数。

癌细胞是因加入于外侧的培养基中的胎牛血清的刺激而产生OPN。然而，在培养液 中存在OPN时，细胞产生基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase；MMP)这样的分解胶 原蛋白的酶而溶解基质胶，此外由于迁移能力提高，因此向外侧的孔移动。作为抑制OPN 启动子控制下的荧光素酶表达的盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物 的代表，观察到化合物3对于A549细胞的基质侵袭功能的抑制效果。

D1)基质侵袭试验(Matrix-Invasionassay)方法

使人非小细胞肺癌细胞株A549在添加了10％FCS、1％P/S的DMEM培养基中悬浮并达到 1.8×10⁵cells/mL。在75cm²培养瓶中分注10mL该悬浮液，在二氧化碳培养器(37℃， 5％CO₂条件下)中培养24±4小时。同样地，配制出A549细胞的6×10⁴cells/mL的悬浮液 以用于标准曲线的制作，在25cm²瓶中分注5mL该悬浮液，在二氧化碳培养器(37℃， 5％CO₂条件下)中培养24±4小时。将此日作为作业的第0天。

[次日：作业第一天]

从接种了细胞的75cm²培养瓶中去除培养基。在去除培养基的培养瓶中分注10mL添加了 0.1％BSA以及1％P/S的DMEM培养基(无血清培养基)，并且以在细胞表面均匀覆盖培养 基的形式将培养瓶向前后左右倾斜。之后，从培养瓶中去除培养基。

在去除培养基的培养瓶中分注10mL无血清培养基。之后，在二氧化碳培养器 (37℃，5％CO₂条件下)中培养24±4小时。

[作业第二天]

将基质胶(10mg/mL：BDBiosciences)在冰上融解。将细胞培养插入皿(24孔板用，8.0μ m孔：BDBiosciences)以及无血清培养基预先用冰冷却。将基质胶通过用冰冷却的无血清 培养基稀释25倍，配制出基质胶溶液。

在24孔板上设置所需数量的细胞培养插入皿，并且在细胞培养插入皿内分别注入50 μL基质胶溶液，并且通过吸头(tip)的梢端使基质胶溶液遍布于整个膜。之后，将24孔 板在二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中放入1～2小时。

去除前一天更换为无血清培养基的75cm²培养瓶的细胞的培养上清。分注10mL未添 加钙·镁的磷酸缓冲生理盐水(D-PBS(-))，并且以在细胞表面均匀覆盖D-PBS(-)的形 式使培养瓶向前后左右倾斜后，去除D-PBS(-)(将该操作称为通过D-PBS(-)进行的洗 涤操作)。之后，将细胞剥离液(CellDissociationSolution；CDS)(SIGMA)的3～5mL分 注至培养瓶中。将分注了CDS的培养瓶放入至二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下) 中，加热20分钟左右(每五分钟摇动)，进行从培养瓶底部剥离细胞的作业(将该作业称为 通过CDS进行的细胞剥离)。

在以300×g进行离心分离后，去除上清，使用5mL的无血清培养基使细胞悬浮。取 出悬浮液的一部分(10μL)，添加10μL0.4％台盼蓝溶液并轻轻移液后，使用Burker-Turk 血球计数板对细胞数进行计数，求出细胞浓度(将该作业成为细胞数计数)。

使用无血清培养基配制8mL的2×10⁵cells/mL的细胞浓度的悬浮液。用基质胶溶液 包被表面后，向在二氧化碳培养器中培养了1～2小时的培养插入皿内分别平稳地注入 0.5mL(1×10⁵cells)配制的细胞悬浮液。将试验重复进行三次。

在15mL管内分注5mL已添加10％FCS、1％P/S的DMEM培养基。在该管内分注 2.5μL(最终浓度25μmol/L)或5μL(最终浓度50μmol/L)化合物3的50mmol/L的 DMSO溶液，配制出化合物3添加培养基。将具有抑制迁移以及侵袭的效果的多西环素 (DOXY；使用DMSO配制为100mmol/L，在－30℃下保存)作为阳性对照使用。在 DMEM的10％FBS、1％P/S添加培养基5mL中添加3.75μL(最终为75μmol/L)多西环素 100mmol/L，配制出阳性对照添加培养基。在添加了10％FCS、1％P/S的DMEM培养基 5mL中添加5μLDMSO，配制出阴性对照添加培养基。

从培养插入皿与板之间的间隙向24孔板的孔内分别注入0.75mL的化合物3添加培 养基、阳性对照添加培养基或阴性对照添加培养基。之后，将24孔板在二氧化碳培养器 (37℃，5％CO₂条件下)中培养48±4小时。

[作业第三天]

去除在25cm²培养瓶中培养的A549细胞的培养基，更换为5mL无血清培养基。之后，将 25cm²培养瓶在二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中培养24±4小时。

[作业第四天]

使钙黄绿素AM(50μg/小瓶：BDBiosciences)的小瓶恢复至室温，添加30μLDMSO并 混合，配制出钙黄绿素AM溶液。在15mL管内分注5mLCDS，对此添加6μL钙黄绿素 AM溶液并混合，配制出1×钙黄绿素AM溶液(被试插入皿用钙黄绿素AM溶液)。另一 方面，在15mL管内分注1.5mLCDS，添加3.6μL钙黄绿素AM溶液并混合，配制出2× 钙黄绿素AM溶液(标准曲线用钙黄绿素AM溶液)。

D2)标准曲线用细胞的准备

去除前一天更换培养基的25cm²培养瓶的细胞的培养上清，使用5mLD-PBS(-)进行上述 洗涤操作。此外，使用3mLCDS进行上述的细胞剥离。之后，进行上述细胞数计数，使用 CDS配制出5×10⁵cells/mL的细胞悬浮液。然后，如表4所示，使用CDS稀释细胞悬浮 液。在96孔黑色板(康宁公司)的各孔内分别注入50μL的小瓶A～H内的细胞悬浮液。 试验重复进行三次。

[表4]

D3)钙黄绿素AM染色

在新的24孔板的各孔内分别注入0.75mLD-PBS(-)。将各插入皿通过镊子提起的同时通过 移液管去除插入皿内的培养基，并且插入至分注了0.75mLD-PBS(-)的孔内。在各插入皿 内分注0.5mLD-PBS(-)，将插入皿用D-PBS(-)洗涤。

准备新的24孔板，在其各孔内分别注入0.35mL1×钙黄绿素AM溶液。将用D-PBS (-)洗净的插入皿用镊子提起的同时使用移液管去除插入皿内的D-PBS(-)，并且转移至 分注了1×钙黄绿素AM溶液的孔内(被试插入皿的细胞的荧光染色)。将转移有插入皿的 24孔板在二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中培养1小时。每隔30分钟轻轻地敲打 板的侧面。

在培养期间，在分注了细胞悬浮液的96孔黑色板的各孔内分别注入50μL2×钙黄 绿素AM溶液，并且用铝箔包住后在室温静置(标准曲线用的细胞的染色)。

D4)荧光测定

在1小时的培养结束后，将放入插入皿的24孔板在注意防止内部的液体溢流的同时摇动， 而混合液体。之后，从24孔板的各孔中使用镊子去除各插入皿。将去除了插入皿的各孔的 液体向新的96孔黑色板的各孔内以分别为100μL的量转移至三个孔(被试插入皿的细胞用 板)。

使用酶标仪(MolecularDevice；SpectraMaxM5或ThermoScientific；Varioskan Flash)测定标准曲线用细胞以及被试插入皿的细胞用的各自的96孔黑色板的各孔的荧光 (激发光：485nm，发射光：520nm)。

D5)总侵袭细胞数的计算

将标准曲线用细胞的荧光强度(RLU)输入至Excel中，根据最小二乘法求出近似曲线(标 准曲线)的数学式。使用标准曲线的数学式，根据96孔板的每个孔的荧光强度算出侵袭细 胞数。将该侵袭细胞数乘以3.5，算出24孔板的每个孔的总侵袭细胞数，此外，由于重复进 行三次，因此算出3个孔的总侵袭细胞数的平均值。

D6)统计处理

对于统计处理，使用Excel统计Statcel3在Excel文件上通过阳性对照以及化合物3处理组 的总侵袭细胞数与阴性对照(control)值的比较进行Dunnett检验，以此实施。

图4示出表示因添加化合物3而获得的A549细胞的基质侵袭抑制效果的图表。阳性 对照组(多西环素给药组)的总侵袭细胞数为对照组的1/3以下。另一方面，化合物3在浓 度为25μmol/L时与对照组相比总侵袭细胞数减少，但是未确认具有显著差异。然而，化合 物3在浓度为50μmol/L时，总侵袭细胞数为对照组的约一半，并且在小于1％的危险比 下，确认与对照组之间总侵袭细胞数有显著差异。即，化合物3被证实在浓度为50μmol/L 时，显著抑制A549细胞的基质侵袭。

＜E.甲羟戊酸对于OPN产生抑制作用的影响＞

他汀类高胆固醇血症治疗药(具体是瑞舒伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他 汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀以及美伐他汀)是HMG-CoA抑制剂，并且被认为 通过该酶的抑制导致甲羟戊酸的降低，因伴随于此的源自甲羟戊酸的异戊二烯量的降低导致 对Ras那样的G蛋白产生影响，从而显示出OPN产生抑制效果(非专利文献8)。

为了确认本发明的OPN产生抑制剂的有效成分的盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘 基网柄菌吡喃酮衍生物所示出的OPN产生抑制效果是否具有与公知的他汀类高胆固醇血症 治疗药相同的作用机制，而将辛伐他汀或化合物3添加至A549/OPNluc细胞的培养液中， 研究对于OPN启动子控制下的基因表达的效果，并观察在甲羟戊酸的共存下是否也能维持 该效果。

E1)WST实验

使A549/OPNluc细胞在添加了10％FCS以及1％P/S的DMEM培养基中悬浮并达到3× 10⁴cells/mL。将该悬浮液分别注入100μL至96孔板的各孔内，并且将96孔板在二氧化碳 培养器(37℃，5％CO₂条件下)中培养24±4小时。

将在－80℃下保存的化合物3的50mmol/LDMSO溶液在室温中静置并融解后，使用 DMSO进行稀释，配制出5.0mmol/L的溶液。另一方面，使用DMSO配制辛伐他丁 (simvastatin；SVS：SIGMA)的50mmol/L溶液，并且在－80℃下保存。将该溶液在使用 时室温中静置并融解，使用DMSO进一步稀释，配制1mmol/L的SVS溶液。

使用乙醇配制甲羟戊酸(mevalonicacid；MVA：SIGMA)的0.5mol/L溶液，在－ 80℃下保存。将该溶液在使用时室温中静置并融解后，在37℃下静置30分钟，之后使用D- PBS(-)稀释，配制出20mmol/L以及200mmol/L的溶液。将配制的溶液在二氧化碳培养器 (37℃，5％CO₂条件下)内静置20分钟(在此期间不时地混合)。

在分注了细胞悬浮液的孔内分别添加两种浓度(20mmol/L以及200mmol/L)的MVA 溶液各0.5μL(MVA100μmol/L：4孔，MVA1mmol/L：4孔)。在使用涡旋混合器混合 后，将96孔板在二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中培养4小时。

在预先添加了MVA以使其达到100μmol/L或1mmol/L的四个孔内分别添加0.5μL 化合物3的5.0mmol/L溶液。同样如此，在未添加MVA的两个孔内也分别添加0.5μL化合 物3的5.0mmol/L溶液。此外，在添加了MVA以使其达到100μmol/L或1mmol/L的四个 孔内分别添加0.5μL1mmol/L的SVS溶液。同样如此，在未添加MVA的两个孔内分别添 加0.5μL1mmol/L的SVS溶液。在作为对照药物的MVA、化合物3以及SVS均未被添加 的两个孔内分别添加0.5μLDMSO(对照)。表5示出各试验组中的添加药物以及添加量。

[表5]

在通过涡旋混合器混合后，将96孔板在二氧化碳培养器(37℃，5％CO₂条件下)中 培养48±4小时。之后，在各孔内分别添加10μLPremixWST-1Reagent(TAKARABIO)。 在使用涡旋混合器混合后，在37℃、5％CO₂条件下培养，使用酶标仪(Bio-Rad； Benchmark或ThermoScientific；VarioskanFlash)测定30分钟、90分钟以及120分钟后的 吸光值(450nm)。

将吸光值输入至Excel文件中，将各试验组的全部的样品的吸光值除以对照的吸光值 的平均值，求出各个吸光值相对于对照吸光值的比值(与对照的比值(ratiotocontrol))；

各样品的吸光值÷对照的吸光值＝与对照的比值。

E2)荧光素酶实验

去除WST实验结束的各孔的上清，在各个孔内分别注入100μLD-PBS(-)。将荧光素酶实验 系统(luciferaseassaysystems)(Promega)中含有的荧光素酶实验底物(luciferaseassay substrate；LAS)用荧光素酶实验缓冲液(LuciferaseAssayBuffer；LAB)溶解，配制出荧光 素酶试剂。此外，将5×CCLR用水稀释5倍，配制出1×CCLR。

完全去除各孔的D-PBS(-)，并且分别注入50μL1×CCLR。之后，将96孔板在室温 中静置30分钟。将静置后的各孔内的1×CCLR作为测定用试样。在化学发光测定用管内分 别注入荧光素酶试剂100μL，在该管内添加20μL测定用试样并进行混合，使用GloMax 20/20Luminometer(Promega)测定了化学发光(相对发光强度：RLU)。

将对照的RLU以及各测定用试样的RLU分别输入至Excel文件中。将各组的RLU 除以WST实验中求出的与对照的比值，从而修正因添加化合物3或SVS而受到影响的细胞 增殖速度的差值所产生的RLU的差值。

图5示出表示相对于由SVS所产生的荧光素酶活性抑制效果的、通过添加MVA而 产生的恢复效果的图表。通过添加SVS，被控制OPN启动子的A549细胞的荧光素酶活性 降低。然而，如下结果得到证实：通过以100μmol/L或1mmol/L的浓度添加MVA，以此 SVS的荧光素酶活性抑制效果消失，A549细胞的荧光素酶活性恢复至与对照组相同的程 度。

图6示出表示相对于由化合物3所产生的荧光素酶活性抑制效果的、通过添加MVA 而产生的影响的图表。通过添加化合物3而产生的荧光素酶活性抑制并未因MVA添加而恢 复。

图5以及图6示出SVS的荧光素酶活性抑制与化合物3的荧光素酶活性抑制在作用 机制上不同。

工业应用性：

本发明的以盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的OPN 产生抑制剂有望能够预防如癌转移那样的因OPN产生亢进而引起的疾病。本发明的以盘基 网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的OPN产生抑制剂作为 具有不同于以往的OPN产生抑制剂的作用机理的OPN产生抑制剂在医药品、生物化学或生 物技术领域有用。